Экстрапинеальный мелатонин в процессе старения 14. 00. 53 геронтология и гериатрия

доктор медицинских наук, профессор

Кветной Игорь Моисеевич
Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Корнева Елена Андреевна

доктор медицинских наук, профессор

Райхлин Натан Танфелевич
доктор медицинских наук, профессор

Смирнов Олег Алексеевич

ФГУ «Российский научно-исследовательский институт геронтологии

Росздрава»
Защита состоится «_____»_______________ 2008 г. в _____ часов на заседании диссертационного cовета Д 601.001.01 в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН по адресу: 197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского

института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН (197110, Санкт-Петербург, пр. Динамо, д. 3).
Автореферат разослан «_____»____________________2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент Козина Л.С.

Многочисленными исследованиями показано, что при старении происходит выраженная инволюция пинеальной железы (эпифиза) [Reiter R.J., 1999, 2003]. При этом установлено, что морфологические изменения, развивающиеся в эпифизе в процессе возрастной инволюции, неразрывно связаны с резким падением уровня продукции мелатонина (МТ) – основного гормона пинеальной железы, координирующего биологические ритмы организма на всех уровнях его организации [Анисимов В.Н., Рейтер Р. , 1990; Charman W.N. , 2003].

МТ является гормоном широкого спектра действия – он участвует в регуляции иммунной и эндокринной систем, обладает пролиферотропным действием, модулируя дифференцировку и апоптоз клеток, участвует в регуляции зрительной функции, снижает уровень холестерина, повышает сопротивляемость организма стрессам и высоким физическим нагрузкам, способствует нормализации кровяного давления и подавляет действие свободных радикалов [Арутюнян А.В. и др., 2003; Reiter R.J. et al., 1998, 2002]. Эти свойства позволяют рассматривать МТ как перспективный для детального изучения эндогенный гормональный фактор, обладающий геропротекторными свойствами.

Важную роль МТ в процессах старения отражает демонстрация существенного снижения уровня ночной экскреции MT с мочой, как у старых животных, так и у пожилых людей [Arendt J., 1995; Bartsch et al., 2001].

При пинеалэктомии (общепринятая модель преждевременного старения) наблюдается иммуносупрессия, сходная с таковой при естественном старении, которая снимается введением экзогенного МТ [Maestroni G., Konti A., 2002]. Определенное значение для увеличения вероятности аутоиммунных расстройств при старении имеет снижение продукции MT – гормона, обладающего антиканцерогенными и антиоксидантными свойствами, а также способного ограничивать возрастной гиперкортицизм, защищающего клетки иммунной и нервной системы от окислительного стресса.

Более половины всех мужчин старше 50 лет страдают опухолевыми заболеваниями простаты, что нарушает половую функцию и мочеиспускание. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что MT предупреждает развитие доброкачественной гиперплазии предстательной железы и задерживает атрофию половых органов, что обычно происходит при старении мужского организма. Учитывая широкий спектр биологической активности МТ и особенно его свойств ключевого регулятора биологических ритмов и мощного природного антиоксиданта, МТ можно рассматривать как важнейший фактор регуляции жизненно важных функций организма. Поэтому уровень продукции MT в организме имеет принципиальное значение для обеспечения его жизнедеятельности в различные возрастные периоды.

Твердо установлено, что пинеальная железа не является исключительным органом, способным продуцировать МТ [Raikhlin N.T. et al., 1975; Raikhlin N.T., Kvetnoy I.M., 1978; Bubenik G. et al., 1985; Kvetnoy I.M., 1999; 2002]. Многочисленными исследованиями показано, что экстрапинеальный МТ широко распространен в организме человека и животных: клетки, продуцирующие МТ, обнаружены в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей, в поджелудочной железе, надпочечниках, щитовидной железе, тимусе, мозжечке, мочеполовой системе, плаценте и других органах. Более того, показана активная продукция МТ в неэндокринных клетках – тучных клетках, естественных киллерах, эозинофильных лейкоцитах, тромбоцитах, эндотелиоцитах [Кветной И.М., Райхлин Н.Т., 1996, 1998; Кветной И.М. и др., 2002; Kvetnoy I.M., 1999]. Такое широкое распространение МТ в организме отражает его ключевую роль как межклеточного нейроэндокринного регулятора и координатора многих сложных и взаимосвязанных биологических процессов.

При возрастной инволюции пинеальной железы происходит снижение концентрации МТ в организме, что, в свою очередь, влечет изменение каскада многих метаболических процессов и негативно отражается на функции многих органов и систем. Однако при этом сведения о возрастных структурно-функциональных изменениях экстрапинеальных источников МТ и особенностях секреции экстрапинеального МТ при старении отсутствуют, что ограничивает понимание роли и значения МТ и свидетельствует о необходимости исследований в этом направлении.

Фундаментальные исследования, предпринятые на молекулярном и клеточном уровнях, будут способствовать познанию механизмов старения и разработке эффективных методов диагностики, лечения и профилактики патологии, ассоциированной с возрастом.

Целью диссертационного исследования является установление роли и значения экстрапинеального мелатонина в процессах старения организма.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. 
   исследовать функционально-морфологические изменения пинеальной железы при старении у человека;
   
2. 
   выявить структурно-функциональную организацию экстрапинеаль-ных источников мелатонина при старении у человека и экспериментальных животных;
   
3. 
   описать степень и характер изменений мелатонин-содержащих энтерохромаффинных клеток желудка в биоптатах слизистой оболочки желудка у людей пожилого и старческого возраста с различной патологией (заболевания желудка и кишечника, болезнь Паркинсона);
   
4. 
   выявить связь характера изменений содержания мелатонина в клетках предстательной железы с развитием опухолей, ассоциированных с возрастом (доброкачественная гиперплазия предстательной железы и рак простаты);
   
5. 
   изучить возможность локальной продукции мелатонина в неэндо-кринных опухолях у пожилых и старых людей и оценить значение этого феномена в процессах опухолевой прогрессии;
   
6. 
   проанализировать нейроэндокринные аспекты участия мелатонина в процессах старения и патогенезе заболеваний, ассоциированных с возрастом.
   

Проведенные исследования позволили установить, что при естественном старении у человека, так же как в различных моделях преждевременного и ускоренного старения (пинеалэктомия и облучение сублетальными дозами), у животных наблюдаются изменения структурно-функциональной организации пинеальной железы и экстрапинеальных МТ-содержащих клеток.

Впервые установлено, что в то время как уровень секреции пинеального МТ прогрессивно снижается с возрастом, экстрапинеальная экспрессия МТ в различных органах стабильно сохраняется до 60 лет и только у более старых людей достоверно снижается. При этом наиболее устойчива в структурно-функциональном отношении популяция МТ-содержащих клеток бронхи-ального эпителия и надпочечников. Показано достоверное снижение накопления МТ в иммунокомпетентных клетках, сопровождающееся нару-шением их структурно-функциональной организации.

Проведенные исследования показали неодинаковую реакцию гастро-интестинальных МТ-содержащих клеток в различных моделях старения, что свидетельствует о возможности активного участия экстрапинеального МТ в возрастной инволюции органов и тканей и компенсации нарушенных физиологических процессов при разных способах инициации старения.

Впервые получены данные о динамике распределения меченого МТ и антител к нему в организме молодых и старых животных. Установлены ключевые органы-мишени МТ и время поглощения МТ их паренхимой.

Детально описано морфофункциональное изменение экстрапинеальных источников МТ при заболеваниях, ассоциированных с возрастом, и опухолях различной локализации у пожилых и старых людей.

Теоретическая значимость исследования состоит в том, что оно существенно расширяет современные представления о нейроиммуноэндо-кринологии и геронтологии для понимания изменения структуры и функции пинеальной железы и значимости экстрапинеальных МТ-содержащих клеток при старении.
Практическая ценность работы

Впервые установлены диагностически и прогностически значимые изменения функциональной активности экстрапинеальных МТ-содержащих клеток при различной патологии у пациентов пожилого и старческого возраста (заболевания желудочно-кишечного тракта, нейродегенеративные процессы, опухолевый рост), позволяющие проводить оценку прогноза и выбор терапии, оптимизирующей нарушенные нейроиммуноэндокринные взаимодействия, усугубляющие течение патологического процесса при старении.

Установлено, что локальное нарушение синтеза МТ нейроэндокринными клетками простаты является важным патогенетическим фактором развития возрастных гиперпластических процессов в предстательной железе.

В злокачественных эпителиальных (раковых) опухолях гортани, легких, желудка и толстой кишки обнаружена эктопическая секреция МТ в клетках, локализованных в ткани опухоли. Установлено, что по мере прогрессии опухолей содержание МТ в опухолях снижается, достигая минимальных значений при распространенных метастазах, что может явиться информативным прогностическим маркером опухолевого процесса.

1. 
   Экстрапинеальная популяция мелатонин-содержащих клеток сохраняет относительную структурно-функциональную стабильность в пожилом возрасте, что обусловливает возможность участия мелатонина в осуществлении регуляции физиологических процессов в стареющем организме, несмотря на выраженную инволюцию пинеальной железы.
   
2. 
   Мелатонин-содержащие клетки являются важным звеном в нейро-иммуноэндокринных процессах старения организма.
   
3. 
   Локальное нарушение продукции мелатонина нейроэндокринными клетками простаты является важным патогенетическим фактором развития возрастных гиперпластических процессов в предстательной железе.
   
4. 
   Количество мелатонин-содержащих клеток в неэндокринных злокачественных опухолях коррелирует со степенью прогрессии опухолей и помогает прогнозировать развитие заболевания у пожилых и старых людей.
   
5. 
   Структурно-функциональные изменения экстрапинеальных мелатонин-содержащих клеток являются важным компонентом в патогенезе соматических заболеваний, ассоциированных с возрастом.
   

Основные результаты и положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге – 2002» (Санкт-Петербург, 2002), ХII Всероссийской конференции «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, 2003), XIII Европейском конгрессе по микроскопии (Антверпен, Бельгия, 2004), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), II Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Санкт-Петербург, 2005), VI Международной конференции по нейроиммуномодуляции (Афины, Греция, 2005), II Всероссийской научно-практической конференции «Общество, государство и медицина для пожилых больных и инвалидов» (Москва, 2005), IV Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 2005), II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005),

Результаты исследований изложены в двух главах «Руководства по нейроиммуноэндокринологии» (М., Медицина, 2006), которое рекомендовано Департаментом образования Минздравсоцразвития РФ в качестве учебника для студентов медицинских вузов. Они также используются в научной, педагогической и практической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербургского государственного университета, Института физиологии им. И.П. Павлова РАН, Медицинского радиологического научного центра РАМН, Института иммунологии ФМБА РФ, Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст диссертации изложен на 244 страницах, содержит 13 таблиц и иллюстрирован 57 рисунками. Список литературы содержит 367 источников, из которых на русском языке – 95, на иностранных языках – 272.

Методология изучения мелатонинпродуцирующих клеток желудка

Были исследованы три группы животных различного возраста: 4, 21 и 34 мес. Буквы nu в названии линии животных указывают на наличие рецессивной мутации, введенной инбредным мышам линии BALB/c, путем их скрещивания с атимическими «обнаженными» (nu/nu) мышами. Термином BALB/c-nu была названа популяция, полученная из гетерозиготных и гомозиготных эутимических мышей.

Объектом исследования служили образцы слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки.

Исследована также динамика аккумуляции ³H-MT у старых мышей-самцов в органах желудочно-кишечного тракта, в сердце, в плазме крови, эндокринных железах, моче и фекалиях.

Исследования проведены на биоптатах слизистой оболочки желудка, полученных при диагностической биопсии из антрального отдела у 84 пациентов, а также на биоптатах слизистой оболочки толстой кишки, полученных при колоноскопии у 52 больных пожилого и старческого возраста (60-89 лет), страдающих хроническим гастритом, язвенной болезнью желудка, хроническим колитом, болезнью Крона, раком толстой кишки.

Кроме того, была сформирована отдельная группа больных для изучения количества ЕС-клеток желудка при болезни Паркинсона (26 человек в возрасте от 63 до 87 лет), у которых при исследовании гастробиоптатов не было обнаружено серьезной самостоятельной патологии органов пищеварения.

Для исследования предстательной железы были использованы образцы, полученные при биопсии или операции от 48 больных с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ) в возрасте старше 50 лет и от 32 больных раком предстательной железы (рак ПЖ) в возрасте старше 50 лет. В контрольной группе исследовался аутопсийный материал (предстательная железа), полученный от 22 мужчин в возрасте 25-69 лет, погибших от разных причин и не имевших патологии простаты.

Исследована также динамика аккумуляции ³Н-МТ у старых мышей-самцов в органах желудочно-кишечного тракта, сердце, плазме крови, эндокринных железах, моче и фекалиях.
Методология изучения содержания мелатонинсодержащих клеток
в неэндокринных злокачественных опухолях у пациентов пожилого
и старческого возраста

Для изучения количества и площади мелатонинсодержащих клеток в неэндокринных опухолях использовали биоптаты, полученные от 182 больных со злокачественными опухолями (мужчин – 101, женщин – 81): гортани (32), легких (23), желудка (44), толстой кишки (30), прямой кишки (53), диагностированных у пациентов пожилого и старческого возраста (60-89 лет). До проведения гистохимических, иммуногистохимических и электронно-микроскопических исследований во всех случаях производили патогистологическую верификацию опухолей согласно классификациям ВОЗ.

Пролиферативную активность клеток изучали с применением мышиных моноклональных антител к PCNA (клон РС10, Calbiochem, титр 1:50). Реакцию верифицировали АБП наборами для выявления кроличьих или мышиных иммуноглобулинов (Vectastain).

При иммунофлуоресцентной визуализации после инкубации с первыми антителами срезы промывали ФРК, наносили биотинилированные антитела к иммуноглобулинам животного-донора первых антител или антитела, связанные с флуорохромом (изотиоцианат флуоресцеина или родамин G) и инкубировали соответственно протоколам коммерческих наборов (Dako).

Электронно-микроскопическое исследование проводили на материале, фиксированном в 2,5% глутаральдегиде с последующей дофиксацией 4% осмием. Материал заливали в смесь эпонов. Срезы (250-300 Å), полученные на ультратоме LKB-7A, контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца, после чего изучали в электронном микроскопе JEM-100B (Jeol).

Радиоавтография. МТ, меченный тритием, был получен в лаборатории радиоактивных препаратов Медицинского радиологического научного центра РАМН. Исследования проводили с использованием самцов мышей в возрасте 3 мес. (молодые животные) с массой тела 18 г и в возрасте 18 мес. (старые животные) с массой тела 22 г. Для исследования характера распределения ³Н-МТ по органам и тканям интактных животных МТ вводили из расчета 3,7 мБк/г массы животного. Животных декапитировали через 5, 15, 30 мин, 1, 3, 6 ч и 1 сут. После введения кровь и органы радиометрировали на сцинтилляционном счетчике. Также было изучено перераспределение антител к МТ (АтМ). Специфичность иммунологической активности АтМ проверяли иммунопероксидазным методом на препаратах эпифиза и тонкой кишки интактных животных по положительной реакции пинеалоцитов и ЕС-клеток, являющихся основным местом продукции МТ, с АтМ. ¹²⁵I-АтМ вводили в хвостовую вену в количестве 3,7 мБк/г массы животного. Животных декапитировали через 3, 6, 24 и 72 ч после введения ¹²⁵I-АтМ, отбирали кровь, выделяли органы и ткани для радиометрии. Для оценки накопления ¹²⁵I-АтМ в органах и тканях использовали тот же коэффициент дифференциального накопления (КДН), что и для МТ.