Морфометрия и компьютерный анализ микроскопических изображений

Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам Медицинского радиологического научного центра РАМН к.б.н. Г.А. Петровой и к.м.н. В.В. Южакову за помощь и консультации при моделировании радиационного старения, проведении радиографических и электронно-микроскопических исследований.

При старении наблюдается полиморфизм и уменьшение размеров ядер пинеалоцитов. После 60 лет происходит изменение цитоархитектоники пинеальной железы в виде поляризации ядер пинеалоцитов, вследствие формирования розе­ток и клеточных фолликулов, которые обнаруживаются в 62% наблюдений у лиц старше 60 лет. Отмечается не только гиперплазия соединительной ткани, но и ее качественные изменения – в ней превалируют коллагеновые волокна, в то время как у людей молодого возраста – ретикулиновые.

При электронно-микроскопическом исследовании в паренхиме пинеальной железы обнаруживается два типа пинеалоцитов (в зависимости от их формы, структуры ядра и органелл, плотности цитоплазматического матрикса и расположения клеток по отношению к соединительной ткани). Пинеалоциты I типа имеют округлую или неправильную форму; крупное ядро содержит в основном диффузный хроматин, отличается более светлой кариоплазмой, имеет неправильную форму за счет многочисленных инвагинаций ядерной мембраны. Ядрышко крупное, расположено чаще по центру ядра. Цитоплазматический матрикс сравнительно электронно-светлый, с небольшим количеством секреторных гранул. Митохондрий много, они имеют округлые или овальные профили, содержат неплотно упакованные, поперечно расположенные кристы.

Пинеалоциты II типа отличаются удлиненной формой, наличием цитоплазматических отростков, которые не формируют сплошного поля, а проникают между пинеалоцитами I типа. Клетки II типа располагаются часто между паренхимой и стромой железы, как бы обрамляя капилляры своими отростками. Ядра пинеалоцитов II типа электронно-плотные, содержат гетерохроматин, располагающийся у ядерной мембраны. Цитоплазматический матрикс сравнительно электронно-плотный, содержит многочисленные секреторные гранулы. В цитоплазме выражен шероховатый эндоплазматический ретикулум (ШЭР), митохондрии имеют сравнительно плотный матрикс и поперечно расположенные кристы.

Возрастные изменения в пинеалоцитах II типа проявляются изменением формы ядра, которое также становится фестончатым за счет инвагинаций ядерной мембраны. Увеличивается доля гетерохроматина в ядре, которое становится еще более плотным. В некоторых митохондриях просветляется цитоплазматический матрикс, в клетках встречаются единичные набухшие органеллы. Характерно накопление зерен липофусцина и аутофагосом.

При старении прогрессивно снижается как общее количество пинеалоцитов, иммунопозитивных к МТ, так и их оптическая плотность, что свидетельствует об ослаблении продукции МТ в пинеальной железе.

Таким образом, при электронно-микроскопическом исследовании выявляются значительные изменения структуры пинеальной железы при старении, однако при этом сохраняется часть гормонально активной паренхимы и в пожилом возрасте, что обусловливает возможность сохранения функций пинеальной железы в стареющем организме.
Экстрапинеальные источники мелатонина при старении человека

Мелатонин-содержащие клетки желудка и кишечника

При иммуногистохимическом исследовании во всех отделах желудочно-кишечного тракта у человека была обнаружена положительная реакция энтерохромаффинных клеток с антителами к МТ и его предшественникам – серотонину, N-ацетилсеротонину и мексамину, что свидетельствует об активной продукции МТ в ЕС-клетках, а не о его пассивном накоплении.

В эпителии бронхов у человека встречаются клетки, дающие положительную реакцию с антителами к серотонину, МТ, N-ацетилсеротонину

и мексамину.

МТ-иммунопозитивные одиночные нейроэндокринные клетки диффузно рассеяны среди бронхиального эпителия. Форма клеток различная – треугольная, трапециевидная, грушевидная, веретенообразная, у некоторых клеток, так же, как и у ЕС-клеток в желудочно-кишечном тракте, на апикальном конце выявляется антенновидный отросток. Ультраструктура МТ-продуцирующих клеток бронхиального эпителия сходна с ЕС-клетками в кишечнике.

При старении популяция МТ-содержащих клеток бронхиального эпителия проявляет себя более устойчивой, чем в пинеальной железе и желудочно-кишечном тракте.

Достоверное снижение площади накопления и оптической плотности

Под капсулой, а также на границе надпочечников человека верифицируются клетки, дающие положительную реакцию со специфическими антителами к серотонину, МТ, мексамину и N-ацетилсеротонину. Компьютерный анализ микроскопических изображений не показал достоверных изменений морфометрических показателей в зависимости от возраста.

В большинстве нейроэндокринных клеток предстательной железы во всех изученных возрастных группах было отмечено выраженное накопление МТ и серотонина. Площадь МТ-содержащих клеток достоверно снижалась с увеличением возраста. Так, у людей в возрасте 20-30 лет их площадь в среднем составила 5,33±0,03%, что в 4 раза больше, чем у людей старше 80 лет. Между возрастом пациентов и значениями площади МТ-содержащих клеток выявлена положительная корреляция. В то же время, не отмечалось достоверных изменений площади накопления серотонина в зависимости от возраста людей.

Оптическая плотность МТ и серотонина достигает максимального значения у лиц в возрасте 20-30 лет, у пациентов пожилого возраста наблюдается достоверное снижение этого показателя. Полученные данные свидетельствуют о снижении содержания серотонина и МТ в нейроэндокринных клетках предста­тельной железы человека с увеличением возраста (p<0,05).
Мелатонин-иммунопозитивные клетки плаценты

При иммуногистохимическом исследовании плацент у родильниц разных возрастных групп накопление МТ была выявлена во всех структурных элементах ворсинчатого хориона – синцитиотрофобласте (СТБ), синцитиокапиллярных мембранах, синцитиальных почках и узлах, единичных клетках стромы и эндотелии сосудов.

Площадь МТ-содержащих клеток в плацентах родильниц 1, 3, 4 и 5-й групп была достоверно меньше, чем в плаценте родильниц 2-й группы (группы сравнения) (р<0,05). Так, у юных родильниц (<18 лет) их площадь составила 0,39±0,01%, что в 17,7 раза меньше, чем в группе 2.

В плаценте женщин 29-35-летнего возраста (3-я группа) площадь накопления МТ была почти в 2 раза меньше (3,78±0,04%), чем у женщин нормального репродуктивного возраста (6,89±0,02%). С увеличением возраста площадь МТ-содержащих клеток в плаценте уменьшается.

Между возрастом родильницы и значениями площади МТ-содержащих клеток выявлена положительная корреляция. Оптическая плотность МТ достигает максимального значения у женщин 2-й группы (0,34±0,01 у.е.), а у женщин старше 36 лет (4 и 5-я группы) наблюдается достоверное снижение этого показателя (р<0,05).
Мелатонин в естественных киллерах (NK-клетках)

При окрашивании NK-клеток азур-эозином в них выявлялись азурофильные гранулы, которые вступали в положительную реакцию с нитратом серебра по методу Гримелиуса. При электронно-микроскопическом исследовании изучаемые клетки представляли собой лимфоциты с круглым или почкообразным ядром, глыбчатым хроматином. Клетки имели относительно большую цитоплазму, крупные митохондрии, изолированные профили ШЭР.

Кроме того, выявлялись определенные, характерные для данных клеток, но не для лимфоцитов вообще, многочисленные везикулы, разбросанные по всей цитоплазме или сконцентрированные в углублении ядра, хорошо развитый пластинчатый комплекс и, наконец, плотные осмиофильные гранулы, которые являются своеобразным маркером NK-клеток.

Таким образом, впервые были получены данные, свидетельствующие о присутствии в секреторных гранулах естественных киллеров высокоактивных гормональных веществ – МТ и серотонина.

При старении отмечалась дегрануляция многих NK-клеток, при этом площадь и оптическая плотность МТ-иммунопозитивных NK-клеток снижались почти в 2 раза.
Мелатонин в эндотелиальных клетках

Проведенные исследования показали присутствие полиморфных осмиофильных гранул различной величины в эндотелии капилляров печени, селезенки и костного мозга. Размеры, форма и строение гранул были различными, однако наиболее часто встречались гранулы трех типов:

• 
  I тип – гомогенные электронно-плотные гранулы овальной или бобовидной формы с очень узким светлым ободком вокруг электронно-плотной сердцевины или без него;
  
• 
  II тип – «перстневидные» гранулы характерного вида: электронно-плотная сердцевина расположена центрально или смещена к одному из полюсов с широким светлым ореолом вокруг нее;
  
• 
  III тип – крупные гранулы округлой формы с электронно-плотной сердцевиной и тонким светлым ореолом вокруг нее.
  

Проведенные электронно-микроскопические исследования позволили впервые установить, что местом локализации эндокринных секреторных гранул являются эндотелиальные клетки капилляров печени, селезенки и костного мозга. Идентификация секреторных гранул свидетельствует о том, что кроме присутствия в нейронах и пептидергических нервных волокнах, обнаруженных в сосудистой стенке, продукция гормонов возможна непосредственно в отдельных эндотелиальных клетках. Преобладающим типом гранул в эндотелиальных клетках являются секреторные нейроэндокринные гранулы, характерные для МТ. При старении количество секреторных гранул в эндотелиальных клетках резко уменьшается, во многих эндотелиоцитах отмечается картина экзоцитоза.

В тимусе динамика накопления АтМ у молодых и старых животных была различна: к 3 ч КДН у старых животных был в 4 раза выше, чем у молодых, и постепенно увеличивался в течение суток. У молодых животных аккумуляция ¹²⁵I-АтМ происходила более интенсивно и через сутки была значительно выше, чем у старых крыс. Через 3 сут. АтМ не были обнаружены в тимусе обеих групп животных. В течение суток в сердце во все сроки (3, 6 и 24 ч) КДН у старых крыс был выше по сравнению с молодыми особями.

В гипофизе ¹²⁵I-АтМ не были выявлены во все сроки исследования. Высокие уровни КДН ¹²⁵I-АтМ были обнаружены в желудочно-кишечном тракте у животных обеих групп: в пищеводе, слепой и двенадцатиперстной кишке – к 1 сут.; в пилорическом отделе желудка – к 3 ч; в тонкой кишке – к
6 ч после введения ¹²⁵I-АтМ. В желудочно-кишечном тракте самый высокий КДН был зарегистрирован через 3 ч в слизистой оболочке пилорического отдела желудка, более низкий – в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки. К 24 ч и далее КДН почти не изменялся в течение суток в тонкой кишке как старых, так и молодых крыс.

В плазме крови уровень ¹²⁵I-АтМ снижался, и к 3 сут. обнаружено более чем 6-кратное снижение его у старых и 5-кратное снижение у молодых крыс.

Таким образом, впервые получены данные о динамике распределения антител к МТ после его введения молодым и старым животным. Они показали неодинаковую степень поглощения и утилизации МТ различными органами как у молодых, так и, тем более, у старых животных.
Мелатонин-продуцирующие гастроинтестинальные клетки

в моделях преждевременного старения

Радиационная модель старения

Эпителий слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта находится в состоянии постоянного обновления, основу которого составляет пролиферация стволовых и дифференцирующихся клеток генеративной зоны. Количество МТ-иммунопозитивных клеток в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки крыс при радиационном старении обусловлено высоким индексом пролиферативной активности PCNA (44,8%) и митотическим индексом (2,9%), которые отражают высокий уровень физиологической регенерации эпителия двенадцатиперстной кишки животных 1-й (контрольной) группы (табл. 3).

Иммуногистохимические исследования показали, что в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки позитивную реакцию на МТ дают энтерохромаффинные клетки, локализующиеся в эпителиальном слое крипт и ворсинок, а также часть тучных клеток в собственной пластинке слизистой оболочки.

Через 3 ч и 1 сут. после облучения животных сублетальной дозой 5 Гр отмечается тенденция к снижению общего содержания МТ-иммунопозитивных клеток в пилорическом отделе желудка. На 3-и сут. их количество достигает минимального уровня и достоверно отличается от контроля (р<0,05). В последующие сроки число МТ-продуцирующих клеток увеличивается и через 4 мес. лишь на 7% отличается от контрольных показателей (различие статистически недостоверно).

Количественные изменения ЕС-клеток в двенадцатиперстной кишке имеют следующие особенности. При воздействии дозой 5 Гр максимальное снижение числа клеток обнаруживается также на 3-и сутки после облучения. К 7 и 21-м суткам их количество увеличивается, но даже в отдаленные сроки (через 4 мес.) не достигает уровня, характерного для контрольных животных. Через 21 сут. и 4 мес. после облучения сублетальной дозой в эндокринных клетках визуализируется умеренная вакуолизация эндоплазматического ретикулума, единичные миелиновые структуры и липофусциновые гранулы.