Пинеалэктомия как модель старения

У животных контрольной группы при окраске гематоксилином-эозином поверхность слизистой оболочки желудка в пилорическом и фундальном отделах образует ямки, которые выстланы цилиндрическим эпителием и имеют однородный вид, отличаясь глубиной в различных отделах. Железы, располагающиеся в различных отделах, также имеют особенности.

Помимо эпителиоцитов в исследуемых отделах желудка при окраске по методу Гримелиуса обнаруживаются эндокринные клетки (апудоциты). Они имеют неправильную форму и располагаются в нижних отделах пилорических

Морфометрический анализ показал, что общее число апудоцитов на 1 мм² слизистой оболочки фундального отдела желудка более чем на 20% превышает их содержание в пилорическом отделе (14815 и 12012 клеток в

При моделировании старения (через один месяц после пинеалэктомии) при светооптическом исследовании изменений гистологического рисунка пилорического и фундального отделов желудка на препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, не обнаруживается. В то же время, количественный анализ позволил выявить значительные изменения в количестве апудоцитов слизистой оболочки желудка по сравнению с интактными крысами.

Так, плотность распределения эндокринных клеток в 1 мм² слизистой оболочки в пилорическом и фундальном отделах возрастает более чем на 50%, достоверно отличаясь от контроля. Аналогичные изменения обнаружены и при морфометрии МТ-иммунопозитивных клеток в желудке, где после пинеалэктомии данный показатель возрастает до 32325 клеток на 1 мм² в пилорическом отделе и до 410±24 клеток на 1 мм² в фундальном отделе. Поскольку пинеалэктомия – наиболее адекватная модель нормального процесса старения, такую динамику следует признать близкой к природной.
Нокаутная долгоживущая линия мышей

Желудок. Общее количество нейроэндокринных клеток возрастает
с увеличением продолжительности жизни животных (60442 в 4, 70553 в 21 и 75353 в 34 мес. жизни). Подобная тенденция наблюдается и со стороны ЕС-клеток: количество серотонин/МТ-содержащих ЕС-клеток составляло 32552 в 4, 34549 в 21 и 38946 в 34 мес.

Двенадцатиперстная кишка. Общее количество нейроэндокринных клеток здесь (как и в желудке) возрастает с увеличением продолжительности жизни животных (19614 в 4, 31114 в 21 и 30311 в 34 мес.), хотя к 34-му месяцу отмечается тенденция к снижению количества ЕС-клеток по сравнению с 21 месяцем жизни. Со стороны ЕС-клеток отмечается выраженная гиперплазия с увеличением возраста: 1867 в 4, 37221 в 21 и 43122 в 34 мес. При этом пролиферативная активность эпителиоцитов с возрастом практически не изменяется (PCNA индекс составлял 15,70,7% в 4, 15,70,8% в 21 и 17,61,1% в 34 мес.). Напротив, индекс апоптоза с возрастом увеличивался (от 0,48±0,02% в 4 до 0,85±0,03% в 34 мес.).

Таким образом, проведенные исследования показали неодинаковую реакцию гастроинтестинальных МТ-продуцирующих клеток в различных моделях старения. При радиационном старении отмечалась выраженная гипоплазия МТ-иммунореактивных клеток в двенадцатиперстной кишке и особенно остро реагировала популяция тучных клеток, численность которых в опытной группе снижалась по сравнению с контрольной почти в 10 раз. В то же время при пинеалэктомии и в нокаутной долгоживущей линии мышей популяция ЕС-клеток достоверно возрастала. Такое разночтение результатов, по-видимому, объясняется менее физиологичным (более жестким) действием радиации на пул стволовых клеток желудочно-кишечного тракта, чем влияние пинеалэктомии, которая более мягко (приближенно к реальности) моделирует процессы старения.

С целью выяснения участия МТ-содержащих ЕС-клеток слизистой оболочки желудка в процессе старения проведено изучение функциональной морфологии слизистых оболочек желудка и двенадцатиперстной кишки у пожилых и старых людей в норме, при язвенной болезни и гастрите.

При электронно-микроскопическом исследовании ЕС-клетки имеют крупное овальное ядро с хорошо выраженным хроматином и ядрышком. В их цитоплазме обнаруживаются хорошо развитый ШЭР и гладкий эндоплазматический ретикулум (ГЭР), митохондрии, рибосомы, пластинчатый комплекс с признаками различной функциональной активности, лизосомы, вакуоли.

Основным отличительным признаком ЕС-клеток служит присутствие в их цитоплазме многочисленных нейроэндокринных секреторных гранул, которые являются местом окончательного образования и хранения МТ, серотонина и пеп­тидных гормонов (мотилина, вещества Р). При электронно-микроскопическом исследовании в цитоплазме ЕС-клеток выявляются полиморфные, округлые, ган­телеобразные и ракетообразные гранулы с сердцевиной различной электронной плотности.

Хронический гастрит. У больных хроническим гастритом отмечается утолщение слизистой оболочки. В эпителии обнаруживаются дистрофические изменения различной степени выраженности. Границы между эпителиоцитами не всегда четко контурируются. Собственный слой слизистой оболочки отечен, инфильтрирован лимфоцитами и плазматическими клетками. Изменение количества ЕС-клеток обнаруживало тенденции к гиперплазии, содержание их на 1 мм² слизистой оболочки было следующим: серотонин-содержащие – 250,6±17,1 и МТ-содержащие – 190,6±14,5.

У больных с атрофическим гастритом отмечается истончение слизистой оболочки. Желудочные ямки удлиняются, а железы укорачиваются. Кровеносные капилляры расширены, наблюдается стаз крови, иногда мелкие кровоизлияния. Выражена полиморфноклеточная инфильтрация с преобладанием лимфоцитов и плазматических клеток.

При анализе количества ЕС-клеток установлено, что их количество имеет тенденцию к увеличению и составляет 280,6±19,4 (серотонин-содержащие) и 200,2±11,2 (МТ-содержащие). Гранулы в них в основном концентрируются вблизи клеточной мембраны. В некоторых секреторных гранулах снижается электронная плотность.

Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки. Функциональная морфология и количество ЕС-клеток желудка в период ремиссии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки практически не отличались от контроля или от их состояния при гастрите (если таковой имелся, а в преобладающем большинстве случаев он имел место). Существенные отличия были обнаружены у больных в период обострения заболевания, что дает основание считать значимыми выявление и анализ их как прогностических маркеров течения патологического процесса.

Язвенная болезнь желудка (обострение). У больных язвенной болезнью желудка в период обострения по краю язвы выявляются зоны фибриноидного некроза. Выражена клеточная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов и эозинофилов. Со стороны ЕС-клеток отмечалась гиперплазия – 380,6±13,4 (серотонин-содержащие) и 290,2±12,7 (МТ-содержащие).

Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (обострение). При обострении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки общее число аргирофильных клеток в антральном отделе желудка еще более увеличивается. При этом отмечается выраженная гиперплазия ЕС-клеток: 440,5±14,2 (серотонин-содержащие) и 350,3±13,7 (МТ-содержащие).

Количество ЕС-клеток при патологии желудка и двенадцатиперстной кишки в пожилом и старческом возрасте представлено в табл. 4.

Для объективной и унифицированной оценки роли и участия ЕС-клеток

В слизистой оболочке сигмовидного отдела толстой кишки присутствуют ЕС-клетки, содержащие серотонин и МТ. Среднее количество ЕС-клеток на 1 мм² слизистой оболочки в норме составляет 20,7±5,0 для серотонин-содержащих клеток и 30,0±2,3 для МТ-содержащих.

Сосуды микроциркуляторного русла были расширены и полнокровны. Среди тучных клеток многие были дегранулированными. При диффузном воспалении слизистой оболочки наблюдалось распространение лимфоплазмоцитарной инфильтрации на всю слизистую оболочку, отмечались уплощение, дистрофия, некроз и слущивание покровного эпителия.

Со стороны ЕС-клеток отмечалось как увеличение аргентаффинных
ЕС-клеток, окрашенных по Массону, так и ЕС-клеток, выявленных при иммуноцитохимических реакциях, соответственно, на серотонин и МТ. Среднее их количество составило для серотонин-иммунопозитивных клеток 80,2±6,1 и для МТ-иммунопозитивных клеток 100,1±8,4 на 1 мм² слизистой оболочки. При этом также отмечалось увеличение числа секреторных гранул в их цитоплазме с одновременной активизацией рельефа эндоплазматического ретикулума.

Неспецифический язвенный колит (НЯК). НЯК характеризуется геморрагически-гнойным воспалительным процессом различной степени выраженности. В сравнительно «мягких» вариантах отмечается утолщение слизистой оболочки с многочисленными геморрагиями, эрозиями и мелкими изъязвлениями, в то время как при тяжелых процессах наблюдалась гипоплазия слизистой оболочки, вплоть почти до полной ее аплазии. В эпителии обнаруживаются дистрофические изменения различной степени выраженности, часто встречаются язвы, размеры и глубина которых зависят от распространенности некробиотического процесса.

Границы между эпителиоцитами не всегда четко контурируются. Отмечается отек собственной пластинки слизистой оболочки, которая обильно инфильтрирована лимфоцитами, эозинофильными лейкоцитами и плазматическими клетками. Наблюдается гиперплазия бокаловидных клеток с гиперсекрецией слизи, которая на электронно-микроскопическом уровне выражается в большом количестве слизистых вакуолей в цитоплазме бокаловидных клеток.

Часто участки регенерации сочетались с участками фиброза, деформировавшего структуру стенки кишки. При этом отмечалось развитие грубоволокнистой соединительной ткани и образование грануляций в дне язв.
В некоторых случаях при изменениях слизистой оболочки, аналогичным вышеописанным, в участках компенсаторной гиперплазии и аденоматоза слизистой оболочки отмечался атипизм клеток, гиперхромия ядер, разрывы базальной мембраны желез, что формировало разрастания железистого рака.

Во всех случаях НЯК в слизистой оболочке обнаруживались клетки Панета, причем нередко их число значительно превышало обычное количество этих клеток в типичных местах их расположения – криптах тощей и подвздошной кишок.

Количество ЕС-клеток практически не отличалось от такового при хроническом колите. Так, среднее количество серотонин-иммунопозитивных клеток составляло 80,7±7,3, а МТ-иммунопозитивных – 100,8±9,5 на 1 мм² слизистой оболочки, соответственно. При окраске по Массону также не обнаруживалось различий в количестве ЕС-клеток с таковым при хроническом колите, среднее количество их составляло 60,0±4,5 на 1 мм² слизистой оболочки. При электронно-микроскопическом исследовании ЕС-клетки демонстрировали различную степень насыщения цитоплазмы секреторными гранулами.

Болезнь Крона (БК) представляет собой неспецифический воспалительный рецидивирующий процесс. Воспаление при БК носит гранулематозный характер. Признаки воспалительного процесса обнаруживались во всех слоях стенки кишки, но в отличие от НЯК, в слизистой оболочке они были менее выражены. Эпителиоциты были уплощены, иногда отмечались аплазированые участки слизистой оболочки (в зоне язв щелевидной формы, поверхность которых была покрыта фибрином). В воспалительном инфильтрате преобладали лимфоциты, скопления которых формировали гранулематозные саркоидоподобные образования, но без гигантских клеток Пирогова-Лангганса. Такие гранулемы выявлялись преимущественно в периваскулярной и периневральной соединительной ткани во всех слоях кишечной стенки.

При анализе количества ЕС-клеток установлено, что число аргентаффинных ЕС-клеток, окрашенных по методу Массона, хотя и увеличивается по сравнению с контролем (70,4±6,0 на 1 мм² слизистой оболочки), но достоверно не отличается от их количества при хроническом и неспецифическом язвенном колите. При этом отмечается переход секреторных гранул в ЕС-клетках из базальной части в длинный отросток – «антенну», который в ряде случаев достигает просвета крипт.

Количество аргентаффинных ЕС-клеток, окрашенных по методу Массона, снижалось в 2 раза по сравнению с контролем (10,8±1,2 на 1 мм² слизистой обо­лочки). При использовании иммуноцитохимического метода и последующей морфометрии обнаружено, что среднее количество серотонин-иммунопозитив­ных ЕС-клеток составляет 10,0±1,2, а МТ-иммунопозитивных ЕС-клеток – 10,7±1,3 на 1 мм² слизистой оболочки, то есть снижается по сравнению с кон­трольными показателями почти в 3 раза. При электронно-микроскопическом ис­следовании обнаруживается большое количество ЕС-клеток с дегрануляцией и отмечается более частый выход отдельных гранул путем экзоцитоза в межкле­точное пространство.

Количество ЕС-клеток в слизистой оболочке при патологии толстой кишки в пожилом и старческом возрасте отражены в табл. 5.
Таблица 5

Количество ЕС-клеток в слизистой оболочке при патологии
толстой кишки в пожилом и старческом возрасте

Группа больных	Метод Массона	Серотонин	МТ
Контроль	20,2±4,2	20,7±5,0	30,0±2,3
Хр. колит	60,3±4,2*	80,2±6,1*	100,1±8,4*
Несп. язв. колит	60,0±4,5*	80,7±7,3*	100,8±9,5*
Б-нь Крона	70,4±6,0*	10,7±1,7*	110,9±1,4*
Рак толстой кишки	10,8±1,2	10,0±1,2*	10,7±1,3*

Примечание: количество клеток содержащихся в 1 мм² среза.

*- р<0,05 по сравнению с контрольными значениями.

При микроскопическом исследовании предстательной железы большей частью узлы имеют аденоматозную структуру. Они построены из тесно расположенных ветвистых желез причудливой формы, образующих многочисленные крипты и сосочковые выросты. Железы выстланы 1-2 слоями клеток высокого призматического эпителия, в области сосочков количество слоев увеличивается.

Цитоплазма эпителиальных клеток светлая, слегка зернистая, в апикальных отделах выявляются жировые включения. Ядра гиперхромные, округлой формы располагаются преимущественно в базальных отделах клеток.

Самые большие узлы иногда достигали в диаметре 5-6 см, состояли из многочисленных кист довольно крупного размера, разделенных тонкими фиброзными, нередко гиалинизированными прослойками, иногда содержащими пучки гладких мышц. Перегородки между кистами нередко разрушаются и тогда образуются крупные гроздевидные кистозные конгломераты, в просвет которых выступают остатки перегородок в виде фиброзных выступов с булавовидным утолщением на конце.

Кисты выстланы однорядным высоким цилиндрическим, кубическим или плоским эпителием, иногда обнаруживаются единичные сосочковые образования. В просвете кист гомогенное содержимое, окрашивающееся эозином в бледно-розовый цвет. Иногда наблюдается множество мелких амилоидных телец.

Значительно реже встречаются «фиброзно-аденоматозные» узлы, построен­ные из немногочисленных редко разбросанных трубочек, выстланных кубиче­ским или низкопризматическим эпителием с хорошо очерченными границами, слабо заметной цитоплазмой и довольно крупным ядром. В просвете железистых трубочек находится секрет ярко-розового цвета.

При иммуногистохимическом исследовании в ткани ДГПЖ обнаруживалось довольно большое количество нейроэндокринных клеток, накапливающих МТ и его основной предшественник – серотонин.

Площадь МТ-содержащих клеток в ДГПЖ ниже, чем в контрольной группе у больных того же возраста и составляет 4,34±0,01% у 50-59-летних пациентов, что в 2 раза больше, чем у пациентов 60-69 лет, а для серотонина она была равна 4,36% в группе 50-59 лет (p<0,05). С увеличением возраста площадь серотонин-содержащих клеток увеличивается, особенно у пациентов с ДГПЖ в возрасте 70 лет и старше (5,33±0,02%).

У пациентов 50-59 лет оптическая плотность МТ-содержащих клеток достигает максимального значения (0,35±0,02 у.е.), а серотонина (0,38±0,01 у.е.). С увеличением возраста пациентов наблюдается достоверное снижение оптической плотности МТ, а плотность серотонина увеличивается (p<0,05). Площадь МТ- и серотонин-позитивных клеток при ДГПЖ была достоверно выше, чем у людей контрольной группы.
Рак предстательной железы

Все исследуемые случаи рака предстательной железы были гистологически представлены аденокарциномой, характеризующейся клеточным полиморфизмом и различной степенью дифференцировки опухолевых клеток. Площадь накопления МТ в раковых опухолях достоверно снижалась с увеличением возраста (p<0,05). Для серотонина отмечается тенденция к значительному увеличению показателей (2,33±0,02%). У пациентов величина площади МТ-содержащих клеток составила 3,34±0,01%, в группе 60-69 лет она была равна 3,28±0,02%, а для серотонина – 2,02±0,01%.

Оптическая плотность МТ-позитивных клеток достигает максимального значения у больных 50-59 лет (0,35±0,01 у.е.), обратная тенденция наблюдается при анализе плотности серотонин-позитивных клеток (0,43±0,02 у.е.).

Во всех аденокарциномах были обнаружены серотонин- и МТ-содержащие нейроэндокринные клетки. При окраске гематоксилином-эозином они были крупнее обычных клеток, цитоплазма их была эозинофильна, ядро смещено в апикальный полюс.

Обширные и множественные скопления нейроэндокринных клеток в основном обнаруживались в высокодифференцированных опухолях. При этом опухолевые нейроэндокринные клетки не демонстрировали признаков пролиферативной активности.

При иммуногистохимическом исследовании раковых опухолей предстательной железы с использованием специфических антисывороток к МТ было обнаружено, что в 20 из 32 случаев аденокарциномы часть клеток, в которых была зарегистрирована положительная реакция с антисывороткой к серотонину, вступала в положительную реакцию с антисыворотками к МТ.

Проведенные иммуногистохимические исследования показали, что в раковых опухолях предстательной железы содержатся нейроэндокринные клетки, ответственные за продукцию серотонина и МТ.