На правах рукописи жилова марьянна борисовна эффективность и безопасность многокурсовой

В основу исследования за период с 2010 года по 2015 год легли 147 наблюдений больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза. Клинико-лабораторное обследование проводилось 41 больному средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза впервые получавших курс фототерапии (УФВ-311, ПУВА-терапия) и 106 больным средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза получшим многокурсовое лечение методами фототерапии (ПУВА-терапия или УФВ-311 на базе ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России. Среди пациентов, получавших многокурсовое лечение методами фототерапии, 136 пациентам проводились курсы фототерапии, 11 больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза, имевших в анамнезе длительную многокурсовую фототерапию.

Среди 136 больных псориазом в соответствии с поставленными задачами и в зависимости от метода проводимой фототерапии больные были разделены на следующие группы: 1 группа – впервые получавших методы фототерапии (ПУВА-терапия, УФВ-311 терапия), 1 группа - получавших многокурсовое лечение методами фототерапии (ПУВА-терапия, УФВ-311 терапия). Больные 1 и 2 групп были разделены на следующие подгруппы:

1А подгруппа (n=19) включала больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза получавших однократный курс ПУВА-терапии

1Б подгруппа (n=22) включала больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза, впервые получавшими курс УФВ-311

2А подгруппа (n=51) включала больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза, получавшими многокурсовое лечение методом ПУВА-терапии.

2Б подгруппа (n=44) включала больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза, получавшими многокурсовое лечение методомУФВ-311.

В зависимости от степени тяжести заболевания и вида фототерапии пациенты были распределены на следующие группы:

1 группа (n=20) – больные средне-тяжелыми формами псориаза, получавшие курс УФВ-311 и имевшие в анамнезе многокурсовое лечение методом ПУВА-терапии.

2 группа (n=26) – больные средне-тяжелыми формами псориаза, получавшие многокурсовое лечение методом ПУВА- терапии.

3 группа (n=20) – больные средне-тяжелыми формами псориаза, получавшие многокурсовую УФВ-311.

4 группа (n=25) – больные тяжелыми формами псориаза получавшие многокурсовую ПУВА-терапию.

Среди 106 больных псориазом, получавших многокурсовую фототерапии (УФВ,УФВ-311, ПУВА-терапия) в соответствии с поставленной задачей оценить частоту отделенных побочных эффектов фототерапии, в зависимости от длительности применения фототерапии больные были разделены на 3 группы:

1 группа - 33 больных псориазом, получившие 60-100 процедур фототерапии (ПУВА-терапия, УФВ/УФВ-311),

2 группа – 58 больных псориазом, получившие 101-200 процедур (ПУВА-терапия, УФВ/УФВ-311),

3 группа- 15 больных псориазом, получившие более 200 процедур (ПУВА-терапия, УФВ/УФВ-311) .

В рамках поставленной задачи дать сравнительную характеристику распределения частот нуклеотидных замен генов системы эксцизионной репарации ДНК и изучить возможные мутации генов ХР в коже больных псориазом однократно и многократно получавшие курсы фототерапии (УФВ-311, ПУВА-терапия) молекулярно-генетические исследования были проведены из биообразцов крови и кожи, полученного от 80 больных псориазом. Для изучения молекулярно-генетических маркеров повышенного риска развития злокачественной меланомы кожи биообразцы крови были получены от 80 больных псориазом, длительно получавших курсы фототерапии и контрольной группы из 44 человек (24 больных злокачественной меланомой кожи и 20 здоровых добровольцев).

Отбор пациентов проводился в соответствии с критериями включения/исключения.

- наличие у пациента средне-тяжелых и тяжелых форм псориаза (PASI>10);

- возраст пациента не менее 18 лет европиоидной расы, российской популяции и любой половой принадлежности;

- отсутствие в анамнезе ранее проводимых курсов фототерапии (ПУВА-терапия, УФВ, УФВ-311).

- отсутствие беременности и грудного вскармливания, использование адекватных методов контрацепции на период проведения терапии;

- отсутствие сифилиса, гепатитов В, С, ВИЧ на основании выполненных скрининговых лабораторных тестов;

- отсутствие клинически значимых отклонений от нормальных лабораторных показателей (общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови);

- заключение терапевта, окулиста, эндокринолога, гинеколога (у женщин) об отсутствии противопоказаний к ультрафиолетовой терапии.

- наличие у пациента средне-тяжелых и тяжелых форм псориаза (PASI>10);

- возраст пациента не менее 18 лет европиоидной расы, российской популяции и любой половой принадлежности;

- проведение не менее 3 курсов фототерапии (ПУВА-терапия, УФВ, УФВ-311).

- отсутствие беременности и грудного вскармливания, использование адекватных методов контрацепции на период проведения терапии;

- отсутствие сифилиса, гепатитов В, С, ВИЧ на основании выполненных скрининговых лабораторных тестов;

- отсутствие клинически значимых отклонений от нормальных лабораторных показателей (общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови);

- заключение терапевта, окулиста, эндокринолога, гинеколога (у женщин) об отсутствии противопоказаний к ультрафиолетовой терапии.

- отсутствие у добровольца псориаза и других аутоиммунных заболеваний;

- возраст пациента не менее 18 лет европиоидной расы, российской популяции и любой половой принадлежности;

- отсутствие беременности и грудного вскармливания, использование адекватных методов контрацепции на период проведения терапии;

- отсутствие сифилиса, гепатитов В, С, ВИЧ на основании выполненных скрининговых лабораторных тестов;

- отсутствие клинически значимых отклонений от нормальных лабораторных показателей (общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови);

- возраст пациента не менее 18 лет европиоидной расы, российской популяции и любой половой принадлежности;

- наличие установленного врачом-онкологом окончательного диагноза: «Злокачественная меланома кожи» вне зависимости от стадии заболевания;

- отсутствие у больного наследственной формы меланомы кожи.

- возраст менее 18 лет;

- непереносимость ультрафиолетового излучения и фотосенсибилизаторов;

- наличие заболеваний, ассоциированных с повышенной чувствительностью к ультрафиолетовому облучению (пигментная ксеродерма, красная волчанка, дерматомиозит, трихотилодистрофия, синдром наследственного диспластического невуса, альбинизм, синдром Горлина, синдром Кокейна).

- наличие порфирии;

-наличие злокачественных и доброкачественных опухолей, злокачественная меланома в анамнезе;

- предшествующая терапия мышьяком, ионизирующим излучением;

- беременность или грудное вскармливание, планирование беременности;

- наличие тяжелого инфекционного процесса, например, сепсиса, абсцесса

туберкулеза;

- наличие соматических заболеваний в стадии обострения или

декомпенсации;

- заболевания крови;

- заболевания центральной нервной системы;

- клинически значимые отклонения от нормальных показателей лабораторных исследований
Общая характеристика здоровых добровольцев.

В исследование включено 20 добровольцев: 14 мужчин и 6 женщин в возрасте от 26 до 60 лет (средний возраст 43,2±9,5).

Группа добровольцев была относительно однородной по национальной принадлежности: все 20-и индивидуумы относились к русской национальности. У всех 20 добровольцев наследственность по псориазу была не отягощена. Все здоровые добровольцы выразили готовность участвовать в данном исследовании, подписав письменное информированное согласие.

Всем здоровым добровольцам однократно осуществлялся забор цельной венозной крови в количестве 5 мл.

В исследование были включены 24 больных со злокачественной меланомой кожи, имевших различные стадии заболевания (у 5 больных - T2aN0M0, у 6 больных - T3bN0M0, у 5 больных - T3bN1M0, у 3 больных -T3aN2M0, у 5 больных - Т3bN3M0). Все пациенты находились на лечении в ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России, диагноз был подтвержден результатами гистологического исследования. Семейных случаев меланомы кожи у наблюдаемых пациентов выявлено не было. По формам заболевания отмечалось следующее распределение: поверхностно-распространяющаяся форма – у 14, узловатая – у 3, лентиго-меланома – у 7. Локализация первичной злокачественной опухоли была следующая: кожа лица - у 20,8% (n=5), кожа шеи - у 25% (n=6), кожа предплечий - у 29,2% (n=7) , кожа туловища - у 8,3% (n=2), кожа голеней - у 16,7% (n=4). Все опухоли были пигментообразующими.

Среди обследуемых больных со злокачественной меланомой кожи было 15 мужчин и 9 женщин. Средний возраст пациентов составил 51,5±12,3. Преобладающими возрастными группами дебюта заболевания были группы 50-59 лет - у 6 пациентов и 60-69 лет - 9 пациентов.

По фототипам кожи больные распределились следующим образом: 1 фототип кожи был у 2 больных (8,3%), 2 тип кожи у 12 (54,1%), 3 тип –у 9 (37,5%), 4 тип кожи не встречался. Интенсивность солнечной инсоляции была высокой у 16,6% (n=4) больных, средней – у 58,3% (n=14) и низкой – у 25% (n=6). Солнечные ожоги в течение жизни имели 50% (n=12) больных. Всем больным злокачественной меланомой кожи однократно осуществлялся забор цельной венозной крови в количестве 5 мл независимо от стадии заболевания и проводимой терапии. Предварительно все больные злокачественной меланомой кожи выразили готовность участвовать в исследовании, подписав письменное информированное согласие.

Для обследования псориазом, получавших ультрафиолетовую терапию в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России применялись методы клинико-лабораторного обследования пациентов: осуществлялась работа с пациентом по получению информированного согласия, оценка соответствия пациента критериям включения – исключения, проведение физикального обследования пациента, сбор анамнестических данных, оценка тяжести состояния пациента и распространенности псориатического процесса по величине индекса PASI, проведение клинико-лабораторного обследования пациента, в том числе: клинического исследования крови и мочи, проведение биохимического исследования крови, идентификация маркеров вирусных гепатитов В, С, обследование пациента на наличие ВИЧ-инфекции и сифилиса, получение заключения терапевта, эндокринолога и окулиста об отсутствии у пациента противопоказаний к проведению ультрафиолетовой терапии, получение заключения гинеколога (для женщин) об отсутствии противопоказаний к проведению ультрафиолетовой терапии и теста на беременность, взятие образца крови для исследования нуклеотидных замен системы ХР, взятие биоптата с непораженной кожи или с участка кожи с признаками фотостарения или др. побочных эффектов для исследования нуклеотидных замен системы ХР. Все данные о пациентах и добровольцах заносились в индивидуальные карты.

Оценка тяжести поражения кожного покрова при псориазе проводилась на основании Индекса распространенности и тяжести поражения кожи при псориазе (PASI) до и после курса лечения.

Индекс PASI рассчитывался по следующей формуле:

0,3× (Э _{туловища}+ И _{туловища}+ Ш _{туловища}) × А _{туловища} +

0,2× (Э _{верхних конечностей}+ И_{верхних конечностей}+ Ш_{верхних конечностей}) × А_{верхних клонечностей} +

0,4× (Э _{нижних конечностей} + И _{нижних конечностей}+ Ш _{нижних конечностей}) × А _{нижних конечностей} ,

где Э –эритема, И - инфильтрация, Ш - шелушение, выраженные в числовых значениях от 0 до 4 (0 - отсутствие проявлений, 1 – незначительные проявления, 2 – умеренные проявления, 3 - выраженные проявления, 4 - очень выраженные проявления); А - числовой показатель площади поражения определенной области кожного покрова (голова, туловище, верхние и нижние конечности) в числовых значениях от 0-6 ( 0- отсутствие поражений, 1 - от 1-9%; 2 - от 10 -29%; 3 – от 30-49%; 4 – от 50-69%; 5 – от 70 - 89%; 6 – от 90-100%). Оценка эффективности проводимой терапии оценивалась на основании динамики Индекса распространенности и тяжести поражения кожи при псориазе (PASI) до и после курса лечения.

Эффективность терапии была оценена по динамике индекса распространенности и тяжести поражения кожи (PASI). Эффективность проводимой терапии вычислялась по следующей формуле.

PASI ДО ЛЕЧЕНИЯ

• 
  Снижение индекса PASI менее чем на 75% - незначительный эффект от проводимого лечения или его отсутствие
  
• 
  Снижение индекса PASI % от 75 до 100% –выраженный клинический эффект
  

- 9 экзон гена XPD, кодирующий функциональный домен DEAH-box, ответственный за расплетание двуцепочечной молекулы ДНК для последующей работы репарационного аппарата;

- 4 экзон гена ERCC1 (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group) принимает участие в работе эксцизионной репарации и отвечает за устранение повреждений ДНК, вызванных УФ-облучением либо алкилирующим агентом цисплатином;

- 10 экзон гена XRCC1 (X-ray cross-complementing group I) – белок, кодируемый геном XRCC1, является важным регулятором системы репарации ДНК и входит в семейство белков, участвующих в контроле прохождения клеточного цикла и стабильности генома;

- 23 экзон гена XPD (официальное название гена ERCC2, excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 2) – белок, кодируемый геном XPD принимает участие в эксцизионной репарации нуклеотидов молекулы ДНК, расплетая молекулу ДНК в районе места повреждения. Также участвует в транскрипции РНК.

Белки, которые кодируют эти гены, являются ключевыми компонентами процесса эксцизионной репарации ДНК человека.

Известно, что хромосомная ДНК содержится во всех ядерных клетках организма, при этом во всех клетках одного организма ДНК одинакова. В связи с этим для проведения исследования в качестве клинического материала использовались:

- цельная кровь пациентов, забор которой осуществлялся до начала лечения; кровь служила «внутренним контролем» исследования, т.к. в ней производилось изучение состояния генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК, до начала ультрафиолетовой терапии.

- биоптат кожи пациентов с участков кожного покрова без псориатических высыпаний; исследование биоптатов кожи проводилось после проведения ультрафиолетовой терапии с целью выявления соматических мутаций в генах ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК, которые могут возникнуть как после первого курса фототерапии, так и на фоне многокурсовой ультрафиолетовой терапии или по окончании очередного курса лечения.

В связи с относительно высокой травматичностью кожи при проведении биопсии (в сравнении с забором крови) исследование биоптата кожи до начала лечения не проводилось.

Для проведения молекулярно-генетических исследований были отобраны следующие биообразцы:

- образцы крови, полученные от 20-и здоровых добровольцев;

- образцы крови, полученные от 24 больных меланомой кожи

- образы крови, полученные от 80 больных псориазом до получения фототерапии;

- биоптаты кожи, полученные от 80 больных псориазом после лечения. Подготовленный для хранения материал помещали в кюльвенатор (низкотемпературный холодильник) и хранили до проведения исследования при температуре -70 – 80° С.

Этапы исследования нуклеотидных последовательностей выбранных генов эксцизионной системы репарации ДНК (XPD, XPC, XPF, ERCC1, XRCC1) для поиска мутаций или нуклеотидных замен включали:

1. 
   выделение ДНК из биообразцов;
   
2. 
   амплификацию ДНК выбранных генов для последующего секвенирования нуклеотидной последовательности;
   
3. 
   детекцию и визуализацию продуктов амплификации ДНК выбранных генов;
   
4. 
   осаждение продуктов амплификации ДНК выбранных генов;
   
5. 
   проведение сиквенсовой ПЦР;
   
6. 
   осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР;
   
7. 
   проведение реакции секвенирования.
   
8. 
   для проведения аплификации фрагментов генов эксцизионной системы репарации ДНК были подобраны праймеры, характеристика которых представлена в таблице 3.
   

1. 
   выделение ДНК из биоптатов кожи
   

В связи с тем, что металлические шарики предназначены для многократного использования, после окончания процедуры гомогенизации каждый шарик переносился в пластиковый контейнер с водным раствором моющего средства Fairy, затем промывается дистиллированной водой и автоклавировался.

2. 
   выделение ДНК из образцов цельной крови
   

Во избежание контаминации, сбор реакционной смеси проводился в стерильном ламинаре.

Амплификация выбранных генов осуществлялась с использованием коммерческого набора регентов фирмы “Синтол” (Россия). Перед проведением реакции подготавливалось необходимое количество ПЦР-пробирок типа эппендорф объемом 0.2 мл. Пробирки маркировались соответствующим образом: положительный (К+), отрицательный (К-) контроли и исследуемые пробы (указывается номер пробы).

Затем готовилась реакционная смесь, включавшая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (Таб. 4).

Таблица 4.

Состав реакционной смеси для проведения амплификации ДНК выбранных генов

После приготовления смесь компонентов перемешивалась и центрифугировалась на вортексе. Готовую ПЦР-смесь тщательно перемешивали на вортексе и вносили по 20 мкл в маркированные пробирки, затем добавлялипо 5 мкл ДНК исследуемого образца. В пробирку отрицательного контроля добавляли 5 мкл dH₂O. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. Пробирки закрывали и центрифугировали в течение 3-5 секунд при комнатной температуре на вортексе для позиционирования реакционной смеси на дне пробирки.

ПЦР проводилась в амплификаторе Dyad. На первой стадии образцы подвергалисья тепловой денатурации при 95°C в течение 3 минут. Затем следовали 35 циклов, состоявшие из стадии денатурации ДНК, отжига праймеров и синтеза ДНК (72°C, время синтеза зависит от размера амплифицируемого фрагмента (из расчета 1 мин. на 1000 п.н. для Taq-полимеразы). Описание циклов амплификации для каждой пары праймеров представлено в таблице 5.
Таблица 5.

Циклы амплификации

Стадия	Пара праймеров F и R для гена XPD	Пара праймеров F и R для гена XPС	Пара праймеров F и R для гена XPF	Пара праймеров F и R для XPD, ex23	Пара праймеров F и R для ERCC1	Пара праймеров F и R для XRCC1
Денатурация	95°C, 20 сек	95°C, 20 сек	95°C, 20 сек	94°C, 60 сек	94°C, 60 сек	94°C, 30 сек
Отжиг	62°C, 15 сек	60°C, 20 сек	62°C, 20 сек	67°C, 60 сек	69°C, 60 сек	58°C, 30 сек
Синтез	72°C, 35 сек	72°C, 60 сек	72°C, 40 сек	72°C, 30 сек	72°C, 30 сек	72°C, 10 сек

Детекция и визуализация продуктов амплификации ДНК

выбранных генов

В камеру для горизонтального электрофореза заливали 1хТАЕ буфер, приготовленный разбавлением 50хТАЕ дистиллированной водой. К 2,0 г агарозы добавляли 2 мл 50х тае буфера и 100 мл дистиллированной воды. Приготовленную смесь прогревали в СВЧ-печи до полного растворения агарозы, затем в нее добавляли 10 мкл 1% раствора бромистого этидия и перемешивали. Расплавленную агарозу охлаждали до температуры 50-60°с и заливали в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов устанавливали на планшет гребенку, используя зажим типа «бульдог». После застывания агарозы осторожно вынимали гребенку из геля и переносили планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза. В карманы геля наносили по 5мкл амплификата, предварительно смешанного с 0.05% раствором бромфенолового синего. Для установления точного размера амплифицируемого продукта в один из карманов агарозного геля вносился маркер молекулярного веса ДНК в растворе, предназначенном для нанесения на гель GENERULER. Затем подключали электрофоретическую камеру к источнику питания и задавали напряжение, соответствовавшее напряженности электрического поля 10-15 в/см геля. Проводили электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляли визуально по движению полосы красителя., которая должна была пройти от старта 1,5-2 см. Результаты прохождения реакций амплификации оценивали с помощью трансиллюминатора с фотокамерой для фотографирования гелей в ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм

Перед проведением реакции подготавливалась и маркировалось необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 0.2 мл. Затем на льду приготовливалась смесь ферментов, включавшая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку: 0.5 мкл экзонуклеазы (20 ед. в мкл) и 1 мкл фосфатазы (1 ед. в мкл). Ферменты отбирались из пробирок с поверхности, плавным движением.

После приготовления смесь ферментов аккуратно перемешивалась и центрифугировалась на вортексе.

Затем в каждую пробирку типа эппендорф объемом 0.2 мл вносилось по 1.5 мкл приготовленной смеси ферментов и по 5 мкл ПЦР-продукта. Общий объем реакционной смеси составлял 6,5 мкл.

Реакция проводилась в амплификаторе Dyad по следующему протоколу: 1) 37°С в течение 20 мин, 2) 90°С в течение 20 мин.

После проведения реакции пробы разбавлялись dH₂O в зависимости от интенсивности свечения полосок при оценочном электрофорезе (возможно добавление от 6 до 48 мкл dH₂O).

Проведение сиквенсовой реакции осуществлялось с использованием коммерческого набора реагентов для секвенирования ДНК Big Dye Terminator v1.1 или v3.1 Sequencing RR-100.

Перед проведением реакции подготавливалось и маркировалось необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 0.2 мл.

Затем приготавливалась сиквенсовая амплификационная реакционная смесь, включавшая следующие объемы компонентов в расчете на одну пробирку (Таблица 6).

Таблица 6

Компоненты амплификационной реакционной смеси для реакции секвенирования

В качестве праймеров для сиквенсовой реакции использовались праймеры, представленные в таблице 5. Каждый из трех очищенных ПЦР-продуктов для каждого выбранного гена секвенировался с обоих концов, следовательно, на каждый ПЦР-продукт приходилось по 2 реакции.

После приготовления смесь компонентов перемешивалась и центрифугировалась на вортексе.

Затем в каждую пробирку типа эппендорф объемом 0.2 мл вносилось по 18 мкл приготовленной смеси компонентов и по 2 мкл очищенной ДНК. Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл.

Сиквенсовая ПЦР проводилась в амплификаторе Dyad и включала стадии денатурации (96°C, 10 сек), отжига (60°C, 5 сек.) и синтеза (60°C, 4 мин). Количество циклов составляло 25.

Осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР

Осаждение продуктов сиквенсовой ПЦР проводилось, чтобы избавиться от компонентов сиквенсовой смеси, таких как праймеры и меченые DDNTP, которые в дальнейшем могли помешать проведению реакции секвенирования на приборе 3130 GENETIC ANALYZER.

Подготавливалось и маркировалось необходимое количество пробирок типа эппендорф объемом 1.5 мл, в каждую пробирку добавлялось по 50 мкл охлажденного 96% этилового спирта. Далее в пробирки типа эппендорф объемом 0,2 мл с реакционной смесью добавлялось 2 мкл 0,125м ЭДТА и 2 мкл 3М ацетата натрия. Реакционная смесь с ацетатом натрия из микропробирок переносилась в пробирки с этиловым спиртом и перемешивалась на вортексе. Пробы инкубировались в морозильной камере при -20°С в течение 45 минут, Затем центрифугировались в течение 15-20 мин при 12000 об/мин при 4°С (использовалась центрифуга с функцией охлаждения). Затем надосадочная жидкость тщательно удалялась. К осадку добавлялось 70 мкл охлажденного 80% этилового спирта. Пробы центрифугировались в течение 10 мин при 12000 об/мин при 4°С, надосадочная жидкость тщательно удалялась. Осадок высушивался при 41°С (не более) в настольном термостате до полного высыхания (контролировалось визуально). После высушивания к осадку добавлялось 15 мкл формамида, перемешивалось на вортексе и инкубировалось 5-10 мин при 41°С или 20-30 мин при комнатной температуре для полного растворения осадка. После этого пробы были готовы для последующей процедуры секвенирования или хранились до исследования при температуре минус 20°С.

Проведение реакции секвенирования

Секвенатор 3130 Genetic Analyzer подготавливался к эксплуатации, а именно: устанавливались капилляры выбранного размера, проводилась калибровка прибора под используемый набор реагентов, инсталлировалось программное обеспечение (Run 3130 Data Collection v 3.0; Sequencing Analysis 5.2; Seqscape v 2.5), выбирался используемый тип полимера, загружались необходимые протоколы работы.

На первом этапе анализа использовалась программа Sequencing Analysis 5.2, которая позволяла посмотреть первичные данные и оценить ряд параметров, таких как общий уровень сигнала по каждому из четырех нуклеотидов (высота пиков), уровень фонового сигнала, степень достоверности идентификации (расшифровки) каждого нуклеотида в сиквенсе и др.

4. 
   Методы статистической обработки результатов