На правах рукописи жилова марьянна борисовна эффективность и безопасность многокурсовой

Оценка распределения частот генотипов полиморфного локуса 32864 гена XPС также не выявила различий у больных псориазом и здоровых лиц: по генотипу ТТ (OR=0,77; 95% CI 0,04 -16,58; p=1), генотипу ТС (OR=1,31; 95% CI 0,04 -16,58; p=1). Таб. 22.

Сравнительный анализ частот полиморфизмов гена XPC 32828 не выявил существенных различий у генотипа СС (OR=0,55; 95% CI 0,06-4,74; p=1) и GG (OR=1,82; 95% CI 0,21-1,82, p=1). Таб.23.

Оценка распределения частот генотипов полиморфного локуса 27495Т>С гена XPF между группами больных псориазом и контролем не обнаружила достоверные отличия: у больных псориазом наблюдалась частота полиморфизма 27495Т>С, соответствующего гомозиготному генотипу СС в положении 27495 гена XPF (OR=8,14; 95%CI 1,03;64,34; χ2=5,33; p=0,020). У лиц контрольной группы частота гетерозиготного генотипа ТС в положении 27495 гена XPF (OR=0,26; 95%CI 0,08-0,86; P=0,02). Частота встречаемости генотипа ТТ в обоих группах не различалась (OR=0,81; 95%CI 0,29-2,24; P=0,02). Таб. 24.

Оценка распределения частот генотипов полиморфного локуса 27095 Т>С гена XPF между группами больных псориазом и контролем не выявила различий генотипов AG (OR=0,24; 95% CI 0,01-4,02; p=0,36), АА (OR=0,25; 95% CI 0,0-13,22; p=0,36). Таб. 25.

Таблица 25.

Частота генотипов полиморфизма 28095гена XPF

генотипы	Частота генотипов полиморфизма 28095гена XPF		р	OR [CI 95%]
	Псориаз (n=80) абс.значение/частота	Контроль (n=20) абс.значение/частота
Генотип AA	0/0,0	0/0,0	0,3616 (F)	0,25 [0,0-13,22]
Генотип AG	1/0,0125	1/0,05		0,24 [0,01-4,02]
Генотип GG	79/0,9875	19/0,95		4,16 [0,25-69,53]

Таким образом, при проведении анализа нуклеотидной последовательности генов XPD, XPC, XPF, ERCC1 и XRCC1, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК, у больных псориазом и здоровых добровольцев были обнаружены следующие полиморфные варианты: 35931 A>C XPD; 32724C>A XPC; 32864T>C XPC, 32828C>G XPC , 33343T>A XPC, 33350A>G XPC,; 27495Т>С, 28095G>A XPF;19007G>A ERCC1 и 28152G>A XRCC1.

При сравнительной оценке частот полиморфных вариантов генов XPC, XPD, XPF, XRCC1, ERCC1 больных псориазом, имевших фототоксические реакции и не имевших фототоксические реакции при проведении фототерапии установлено отсутствие достоверно значимых отличий в частоте встречаемости полиморфизмов генов XPD, XPC, ERCC1, XRCC1. Установлено статистически значимое преобладание генотипа СС гена XPF в позиции 27945 у больных без фототоксических реакций по сравнению с больными, имевшими фототоксические реакции (38,7%; 8%); OR=13,38; 95%CI (2,61;68,57); χ² = 12,7; p=0,0004. Частота встречаемости генотипа ТТ гена XPF в позиции 27945 у больных с фототоксическими реакциями была так же статистически значимо выше (OR=0,22; 95% СI(0,05;0,88); χ²⁼5,03; p=0,03). Следует учитывать, что следствием полиморфизма в положении 27945 гена XPF является синонимическая аминокислотная замена серина на серин в белке XPF. Следовательно, если данный полиморфизм достоверно ассоциирован с фототоксическим эффектом, то влияние данной замены на функцию кодируемого белка может происходить на уровне транскрипции. Наличие достоверной ассоциации генотипа СС в положении 27945 гена XPF (полиморфизм T>С) с отсутствием развития фототоксической эритемы у больных псориазом может свидетельствовать о возможной протективной роли данного генотипа в отношении развития фототоксической эритемы у больных псориазом при проведении им фототерапии и может быть учтено при выборе метода терапии.

С целью изучения возможной ассоциации между симптомами хронического фотоповреждения кожи и генетическим полиморфизмом системы эксцизионной репарации ДНК было проведено сопоставление данных секвенирования генов эксцизионной системы репарации ДНК у больных с симпомами хронического фотоповреждения кожи и больных, у которых эти признаки не встречались. У больных псориазом, длительно получающих фототерапию, наиболее часто встречающимися симптомами хронического фотоповреждения кожи были: веснушки и лентиго (n=42), необратимая стойкая гиперпигментация (n=25), себорейный кератоз (n=8).

Частота генотипа ТТ гена XPF 28945 у больных с лентиго составила 66,7% (28/42), не имевших лентиго 7,8% (11/14), p=0,05; частота генотипа СС была 30,9% (13/42) и 21,4% (3/14) соответственно, p>0,05. Частота встречаемости генотипа ТТ гена ERCC1 19007 у больных, имевших лентиго составила 38,1% (16/42), без лентиго 64,2% (9/14) , p>0,05. Генотип ТС встречался у 52,4% (22/42) больных, имевших лентиго и у 28,6% ( 4/14) без лентиго, p>0,05. Генотип АА гена XPD (23экзон) у больных, имевших лентиго имели 33,3% (14/42), без лентиго в 42,8% (6/14). Генотип АС отмечался у 57,1% (24/42) и 42,8% (6/14) cоответственно. Нуклеотидную замену соответствующую генотипу СС имели 9,5% (4/42) и 14,3% (4/14) соответственно, p>0,05. Генотип GA гена XRCC1 (экзон10) имели 71,4% (n=30) с лентиго и 78,5 (n=11/14) без лентиго. Генотип GG гена XRCC1 (экзон10) имели 26,1% (n=11/42) и 21,4% (3/14) соответственно, p>0,05. Таким образом, не обнаружено взаимосвязи между развитием лентиго и нуклеотидными заменами генов эксцизионной системы репарации ДНК.

У пациентов с диффузной необратимой гиперпигментацией полиморфные варианты генов XPD 6491, XPC 32864, XPC 33343, XPC 33350, XPF 28095 не встречались.

Частота генотипа ТТ гена XPF в позиции 27945 у больных с диффузной стойкой гиперпиментацией составила 72% (18/25), без гиперпигментации – 67,7% (21/31); генотип СС этого гена имели 28% (7/25) и 29% (9/31) соответственно. Достоверных различий в генотипах не отмечалось.

Генотип ТТ гена ERCC1 (exon4) имели 32% (8/25) больных с гиперпигментацией и 54,8% (17/31) больных без гиперпигментации; генотип ТС - 56% (14/25) и 38,7% (12/31); генотип СС - 12% (3/25) и 6,5% (2/31) больных соответственно, р>0,05.

У больных с диффузной стойкой гиперпигментацией генотип АА гена XPD (exon23) встречался у 24% (6/25) больных с гиперпигментацией и у 45,1% (14/31) больных без данного симптома; генотип АС имели 68% (17/25) и 41,9% (13/31); генотип СС - 8% (2/25) и 12,9% (4/31) соответственно, р>0,05.

Частота генотипа GG гена XRCC1 (еxon10) у больных с гиперпигментацией составила 40% (10/25), без этого признака – 16,1% (5/31), OR=3,47; (1-12,07); χ² = 4,02; р=0,02.

Была выявлена достоверно более высокая частота встречаемости гетерозиготного генотипа GА гена XRCC1 (еxon10) у больных не имеющих гиперпигментацию по сравнению с больными имеющими данный признак ( 83,9%; 26/31 и 56%; 14/25) (OR=0,24; СI95% -0,07-0,85; χ² = 35,27; р=0,03). Данное обстоятельство может свидетельствовать об участии гена XRCC1 в регуляции пролиферации меланоцитов при длительном применении методов фототерапии. Наличие ассоциации генотипа GG гена XRCC1(еxon10) с развитием диффузной стойкой гиперпигментации у больных псориазом, получавших в течение жизни многокурсовую фототерапию и достоверно значимого отсутствия данного признака у больных с генотипом GА, может свидетельствовать о генетической предрасположенности лиц с данным генотипом к развитию диффузной стойкой гиперпигментации.

У пациентов с себорейным кератозом полиморфные варианты генов XPD6491, XPC32864, XPC 33343, XPC 33350, XPF28095 не встречались.

Частота генотипа ТТ гена XPF в позиции 27945 у больных себорейным кератозом составила 75% (n=6), без актинического кератоза– 68,75% ( n=33); генотип СС этого гена имели 25% (n=2) и 29,1% (n=14) соответственно.

Генотип ТТ гена ERCC1 (exon4) имели 37,5% (n=3) больных с актиническим кератозом и 45,8% (n=22) больных него; генотип ТА имели 50% (n=4) и45,8% (n=22); генотип СС - 12,5% (n=1) и 8,3% (n=4) больных соответственно.

У больных с себорейным кератозом генотип АА гена XPD (exon23) встречался у 37,5% (n=3) больных и у 35,4% (n=17) больных без данного симптома; генотип АС соответственно имели 50% (n=4) и 54,1% (n=26); генотип СС 12,5% (n=1%) и 10% (n=51) соответственно. Частота генотипа GG XRCC1 28152 у больных себорейным кератозом составила 12,5% (n=1), без этого признака – 27,1%% (n=13), частота генотипа GA составила 75% (n=6) и 72,9% (n=35) соответственно. Статистический анализ по сравниваемым группам пациентов, у которых развился себорейный кератоз, и у которых данный признак не определялся не проводился ввиду малого количества наблюдений.


5.3 Результаты поиска мутаций генов эксцизионной системы репарации ДНК (XPC, XPD, XPF, XRCC1, ERCC1) в коже больных псориазом после однократных курсов и многокурсового лечения методами ультрафиолетовой терапии (ПУВА-терапия, УФВ-311).

С целью поиска возможных мутаций генов эксцизионной системы репарации ДНК (XPC, XPD,XPF,XRCC1, ERCC1) были исследованы образцы крови (до лечения) и биоптаты кожи после лечения у 80 больных псориазом после однократного курса и многокурсового лечения методами ультрафиолетовой терапии (УФВ-311, ПУВА-терапия). Впервые курс фототерапии был проведен 24 больным, многокурсовое лечение получили 56 больных. Результаты секвенирования генов из биообразцов крови сравнивались с биоптатами кожи (без псориатических высыпаний), полученными после проведенного однокурсового или многокурсового лечения.

В результате проведенных молекулярно-генетических исследований у больных псориазом до лечения (исследование образцов крови) генотип GG гена XPD в позиции 6491 был установлен у 100% (n=80) больных. В функционально значимом участке гена XPD генотип СС в позиции 35931 был обнаружен у 8-и больных псориазом (10,0%); у остальных пациентов генотипы в данной позиции распределялись следующим образом: гомозиготный генотип АА – у 33 пациентов (41,25%) и гетерозиготный генотип АС - у 39 (48,75%).

При секвенировании гена ХРС в позиции 32724 у 23 больных (28,75%) была установлен генотип AA, у 58 пациентов регистрировался гомозиготный генотип СС ( 71,25%) .

Генотип СТ гена ХРС 32864 был установлен у 2 больных (2,5%), у 78 пациентов регистрировался гомозиготный генотип ТТ (97,5%).

Наличие гетерозиготного генотипа GC в позиции 32828 гена ХРС было отмечено у 7 больных (8,75%), у 73 пациентов регистрировался гомозиготный генотип СС (91,25%);

Генотип АА гена ХРС 33343 был установлен у 2 больных псориазом (2,5%), у 78 больных регистрировался гомозиготный генотип ТТ ( 97,5%);

Гомозиготный генотип GG гена ХРС в позиции 33350 был установлен у 3 (3,75%) больных, у 77 пациентов регистрировался гомозиготный генотип АА (96,25%);

При секвенировании функционально значимого участка гена XPF у больных псориазом были обнаружены нуклеотидные замены:

- в позициях 27945 (TT/TC/CC) и 28095 (GG/AG). При этом у 24 больных псориазом (30%) в позиции 27945 обнаружена замена нуклеотидов 27945 T>C (гомозиготный генотип СС), у 8 больных обнаружена замена нуклеотидов 27945 T>C (гетерозиготный генотип ТС) (10%), у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип ТТ (48/80; 60%);

- у одного больного (1,25%) обнаружена нуклеотидная замена в позиции 28095G>A, гетерозиготный генотип AG (аллели GG, AG), у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип GG (79/80; 98,75%).

При секвенировании функционально значимого участка гена ERCC1 у 32 больных псориазом были обнаружены нуклеотидные замена в позиции 19007 Т>С: гомозиготный генотип GG (9/80; 11,25%), гетерозиготный генотип GA (39/80; 48,75%) у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип ТТ (32/80; 40%).

При секвенировании функционально значимого участка гена гена XRCC1 у одного пациента регистрировалась нуклеотидная замена в позиции 28152 G>A, гомозиготный генотип АА (1,25%); у остальных пациентов выявлен гомозиготный генотип GG (24/80; 30%) и гетерозиготный генотип GA (55/80; 68,75%).

После курса обнаруженные нуклеотидные замены выявлялись у больных псориазом при исследовании биоптатов кожи с той же частотой, что и до лечения, различий в частоте выявляемых полиморфизмов не было также выявлено между группами больных псориазом, получивших однокурсовое лечение и многокурсовую фототерапию. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии возникновения клинически значимых мутаций в генах эксцизионной системы репарации ДН у больных псориазом после проведенной терапии методами ПУВА-терапии и узкополосной (311 нм) фототерапии.

Проведение больным псориазом однократных и многократных курсов ПУВА-терапии и узкополосной фототерапии 311 нм не вызывало у них клинически значимых мутаций генов эксцизионной системы репарации ДНК в коже.


5.4 Результаты секвенирования генов эксцизионной системой репарации ДНК (XPC, XPD, XPF, XRCC1, ERCC1) у больных псориазом, здоровых добровольцев и больных злокачественной меланомой кожи.

В исследование вошли 80 больных средне-тяжелыми и тяжелыми формами псориаза, получающих методы фототерапии, 24 больных со злокачественной меланомой кожи и 20 здоровых лиц. Все обследуемые лица относились к русской этнической группе. С целью изучения молекулярно-генетических маркеров повышенного риска развития злокачественной меланомы кожи были изучены и сопоставлены частоты распределения нуклеотидных замен функционально значимых участков генов эксцизионной системы репарации ДНК (16 экзона гена XPC в позициях 32724, 33343, 32828, 33350, 32864; 9 экзона гена XPD в позиции 6491; 23 экзона гена XPD в позиции 35931; 11 экзона гена XPF в позициях 28095,27945; 4 экзона гена ERCC1 в позиции 19007; 10 экзона гена XRCC1 в позиции 28152 у всех обследуемых лиц. В качестве биоматериала для исследования использовались биообразцы цельной крови.

В результате проведенных молекулярно-генетических исследований у 24 больных злокачественной меланомой кожи нуклеотидных замен гена XPD 6491 (GG/AA) выявлено не было.

В функционально значимом участке 23 экзона гена XPD замена нуклеотидов 35931А>С соответствующая гомозиготному генотипу СС (или двум аллелям С); была обнаружена у 14 больных (58,3%) - у остальных пациентов генотипы в данной позиции распределялись следующим образом: гомозиготный генотип АА – у 3 пациентов (12,5%) и гетерозиготный генотип АС - у 7 человек (29,17%). При секвенировании функционально значимого участка гена XPC у больных псориазом были обнаружены нуклеотидные замены в позициях 32724 (CC/AA), 32864 (TT/CC), 32828 (СC/GC), 33343 (TT/TA/AA) и 33350 (AA/AG/GG):

- у 7 больных (29,17%) была обнаружена замена нуклеотидов в позиции 32724 С>А, соответствующая гомозиготному генотипу AA (или двум аллелям А); у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип СС (17/24; 70,83%) .

- у 4 больных (16,67%) была обнаружена замена нуклеотидов в позиции 32828 С>G, соответствующая гетерозиготному генотипу GC (аллели С и G); у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип СС (20/24; 83,33%).

В позиции 33343 Т>A, нуклеотидная замена, соответствующая гомозиготному генотипу ТА была выявлена у 6 больных (25%); у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип ТТ (18/24; 75%).

В позиции 32864 T>C у пациентов регистрировался гомозиготный генотип ТТ (22/24; 91,67%) и гомозиготный генотип СС (2/24; 8,33%).

В позиции 33350 A>G нуклеотидная замена, соответствующая генотипу AG установлена у 6 больных ( 25%), у остальных регистрировался гомозиготный генотип АА (16/24;66,67%) и гомозиготный генотип GG – у 2(8,33%)

При секвенировании функционально значимого участка гена XPF у больных злокачественной меланомой кожи была обнаружена нуклеотидная замена в позиции 27945 (TT/TC/CC), соответствующая гетерозиготному генотипу ТС у 15 пациентов (62,5%), у 1 (4,17%) – гомозиготный генотип СС, у остальных больных регистрировался гомозиготный генотип ТТ (8/24; 33,33%). Нуклеотидная замена в позиции 28095G>A соответствующая гетерозиготному генотипу AG была выявлена у 3 больных (12,5%), генотип АА - у 1(4,17%), у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип GG (20/24; 83,33%).

При секвенировании функционально значимого участка гена ХRCC1 у 11 больных была обнаружена нуклеотидная замена в позиции 28152 А>G, гомозиготный генотип GG (5/24; 20,83%); гетерозиготный генотип GA встречался у 7 (29,17%), у остальных пациентов регистрировался гомозиготный генотип АА (1/2/24; 50%).

При секвенировании функционально значимого участка гена ERCC1 в позиции 19007 Т>C у 3 пациентов выявлен гомозиготный генотип CC (20,83%), гетерозиготный генотип ТС у 6 (25%), гомозиготный генотип ТТ отмечался у 13 (54,17%).

Было проведено статиcтическое сравнение частот встречаемости между группами малой выборки с использованием критерия Х². В связи с наличием в исследовании множественных сравнений (до 4) и относительно небольшой выборки, α – уровень значимости для p был снижен до 0,05/4=0,0125 (поправка Бонферрони).

У больных меланомой кожи полиморфных вариантов генов XPD 6491 не выявлено.

Отмечено достоверно значимое увеличение частоты встречаемости генотипа СС гена XPD 35931 у больных меланомой кожи по сравнению с больными псориазом (OR=12,6; (4,23-37,54); р<0,0001) и здоровыми добровольцами OR=5,6; (1,43-21,89); р=0,006) . Таб. 27.

Не установлено различий в частоте встречаемости аллелей и генотипов гена ERCC1 19007 (ТТ/ТС/CC) у больных злокачественной меланомой кожи по сравнению с больными псориазом и здоровыми лицами. Таб.28.

Сравнительный анализ аллелей и генотипов генов ERCC1 19007, XRCC1 28152, XPC 32724, 32864, 32828, 33343, 33350, XPF 27095 не выявил существенных различий в частоте встречаемости полиморфизмов у больных меланомой кожи по сравнению со здоровыми лицами и больными псориазом.

Анализ полиморфных вариантов гена XPC 32724, 32864, 32828 не выявил статистически значимых различия в распределении частот генотипов между больными меланомой и здоровыми, больными псориазом и меланомой кожи.

При этом у больных меланомой кожи наблюдалось достоверно более высокая в сравнении с больными псориазом частота гомозиготного генотипа ТС в положении 27945 гена XPF (OR=15; 95%CI 4,8-45,2; р<0,0001). У здоровых лиц и больных меланой различий в частоте данного генотипа не отмечалось (OR=3,98; 95% CI 1,1-13,6; P=0,0586). Таб.29.

Наиболее существенным результатом исследования явилось выявление генотипа СС гена XPD в позиции 35931, который достоверно преобладал у больных меланомой кожи по сравнению с больными псориазом и здоровыми лицами. и генотипа ТС гена XPF в позиции 27945, который достоверно чаще встречался у больных меланомой кожи по сравнению с больными псориазом, р<0,0001. Установлен молекулярный предиктор повышенного риска развития злокачественной меланомы кожи у здоровых лиц: генотип СС гена XPD в позиции 35931 (р=0,006). Полученные нами результаты, свидетельствуют об ассоциации полиморфизма А>C гена XPD в позиции 35931 (XPD /ERCC2 SNP rs13181) с риском развития меланомы кожи, что подтверждается данными метаанализа зарубежных авторов. При этом частота распределения полиморфизмов данного гена имеет существенные различия в разных популяционных группах