I. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

иммунофлюоресценции (РИФ). РИФ в непрямом варианте может быть рекомендован как основной

серологический метод для определения антител в сыворотке крови людей с подозрением на

легионеллез. Реакция иммунофлюоресценции является высокоспецифичной и достаточно

чувствительной.
Техника постановки
    На  чистое обезжиренное предметное стекло наносят 3 отдельных

небольших

убитую
кипячением    2-суточную    культуру    L.   pneumophila,  

выращенную   на
угольно-дрожжевом  агаре,  содержащем  L-цистеин  (0,4  г/л)  и 

пирофосфат

работе
                                                                2

разведении

После
подсушивания антигена на воздухе в течение 10 - 15 минут препарат

фиксируют
в ацетоне 15 минут и снова подсушивают в течение 2 - 3 минут на

воздухе при

мазков
следует  обвести стеклографом, что в дальнейшем препятствует слиянию

капель
сыворотки  в  различных разведениях. Стекла с антигеном помещают во

влажную
камеру  (чашка  Петри  с  увлажненной  фильтровальной  бумагой  на 

дне)  и
препараты  с  антигеном обрабатывают сывороткой больных в разведениях

1:32,
1:64,  1:128.  Первое  разведение  сыворотки  1:8  делают  в 0,5-

процентном
растворе  яичного желтка в забуференном физрастворе (pH - 7,2),
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
последующие
двукратные   разведения  сыворотки  проводят  в  забуференном 

физрастворе.

влажной
камере, после чего промывают 5 - 10 минут фосфатным буфером (ФСБ) pH

= 7,2,
дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Далее препарат

обрабатывают

рабочем
разведении.  Инкубируют 30 минут при 37 °С во влажной камере,

промывают 5 -
10 минут в ФСБ pH = 7,2, споласкивают дистиллированной водой,

высушивают на

Такой
препарат  готов  для  просмотра в люминесцентном микроскопе. При

постановке
реакции   иммунофлюоресценции   необходимо  делать  положительный 

контроль
(антиген   с   положительной   кроличьей   легионеллезной  

сывороткой)   и
отрицательный контроль (антиген с нормальной сывороткой).
Учет и оценка реакции
Препарат микроскопируют в падающем свете люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ. Для

микроскопии используют иммерсионный объектив 90 х (1,25) и окуляр 5 х 7 и нефлюоресцирующее

иммерсионное масло.
В положительных случаях, т.е. когда исследуемая сыворотка содержит специфические антитела,

после обработки данного препарата люминесцирующей сывороткой против глобулинов человека,

выявляется специфическое яркое зелено-желтое свечение бактерий на темном фоне препарата. При

специфической флюоресценции удается обнаружить более яркое свечение периферии бактериальной

клетки и более слабое в ее центральной части. Для оценки интенсивности специфического свечения

используют четырехкрестовую систему:

контрастирующие с темным телом клетки;

исследуемой сыворотки принимают последнее разведение, которое обеспечивает бактериальной

клетке специфическое свечение, оцениваемое на "++++" и "+++". Разведение сыворотки, при котором

отмечается слабое свечение бактериальной клетки, оцениваемое на "++" и "+", не учитывают.

сывороткой) должен давать яркое специфическое свечение легионелл, в отрицательном контроле

(препарат легионеллезный антиген с нормальной кроличьей сывороткой) свечение отсутствует

полностью.

антител в 4 - 128 раз в сыворотках реконвалесцентов, по сравнению с первой сывороткой,

полученной в острый период заболевания. В случаях, когда проанализировать динамику изменения

не представляется возможным, диагноз ставится по высокому уровню специфических антител (титр

не менее 1:64). Появление специфических антител у отдельных больных может происходить уже к 6 -

7 дню от начала заболевания. Титры быстро возрастают на 2 - 3 неделе, достигая максимальных

значений к 5 неделе от начала заболевания. В последующие месяцы титры уменьшаются. Необходимо

учитывать возможность выявления перекрестных реакций сыворотки больных легионеллезом в РИФ

с антигенами пситтакоза и лихорадки КУ. Однако титр антител в реакции с гомологичной культурой

обычно бывает выше, чем с гетерологичной, что является основой для дифференциальной

диагностики.