Реакция прямой иммунофлюоресценции

легионеллезного антигена. Этот метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

Прямой иммунофлюоресцентный метод позволяет обнаружить возбудитель L. pneumophila в

отпечатках из свежих и замороженных кусочков легких, в гистологических срезах, плевральном

экссудате, мокроте, материале бронхоскопии, а также при идентификации выделенных культур.
Техника приготовления препаратов
На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала (или делают отпечаток органов) и

делают тонкий мазок, т.к. в слишком густом мазке не удается отметить свечение отдельных клеток.

Препарат подсушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне в течение 15

минут. Границу исследуемого материала, нанесенного на предметное стекло, отмечают стеклографом

с обратной стороны препарата. Препараты хранят при +4 °С до обработки люминесцирующей

сывороткой.

Петри с кусочком смоченной в воде фильтровальной бумаги), наносят каплю "рабочего разведения"

температуре 37 °С. Затем мазки промывают 10 - 15 минут в фосфатном буфере pH = 7,2,

дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят глицериновую среду, покрывают

покровным стеклом и просматривают в люминесцентном микроскопе.

надобности.

микроскопа используют иммерсионный объектив 90 х (1,25) и окуляры 5 х 7 и нефлюоресцирующее

иммерсионное масло. Для получения яркого свечения бактерий необходимо тщательно центрировать

осветительную систему микроскопа и подбирать соответствующие светофильтры. Наличие в

препарате клеток бактерий следует контролировать с помощью фазово-контрастного устройства.
В положительных случаях после обработки данного препарата специфической легионеллезной

люминесцирующей сывороткой в люминесцентном микроскопе обнаруживается специфическое

изумрудно-зеленое свечение легионеллезных бактерий.
Степень яркости люминесценции бактерий, "окрашенных" люминесцирующими антителами,

принято обозначать в крестах (см. выше). Специфическим считается свечение с яркостью "++++" и

"+++", свечение с яркостью "++" и "+" принято считать неспецифическим. Обнаружение светящегося

ореола хотя бы у 3 - 5 клеток в каждом поле зрения свидетельствует о наличии в исследуемом

материале L. pneumophila.
Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии микроорганизма или о содержании в

исследуемом материале в низкой концентрации, не выявляемой иммунофлюоресцентным методом

при прямом исследовании без подращивания или обогащения.
При исследовании различных препаратов необходимо иметь в качестве контроля мазок,

приготовленный из 500 млн. взвеси легионеллезных бактерий, обработанных люминесцирующей

сывороткой.
Несмотря на то, что "рабочее разведение" сыворотки указано на этикетке ампулы, для каждой

сыворотки его следует устанавливать опытным путем, т.к. оно может меняться в зависимости от

конкретных условий микроскопирования препаратов.
С этой целью в ряде пробирок делают кратные (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) разведения

люминесцирующей сыворотки, используя при этом физиологический раствор pH = 7,2. Каждым

разведением сыворотки обрабатывают заранее приготовленный, фиксированный и подсушенный

препарат с мазком из 500 млн. взвеси легионеллезных бактерий. Дальнейшая обработка препаратов

идет по ранее описанной (для прямого варианта РИФ) методике. "Рабочим разведением" сыворотки

считается то наибольшее разведение, при котором выявляется специфическое сверкающее зелено-

желтое свечение бактериальной клетки на темном фоне препарата.