2. Реакция иммуноферментного анализа (ИФА)
для определения легионеллезного антигена
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Реакция иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет определить легионеллезный антиген в
клиническом материале (моча, мокрота, бронхиальные смывы) при экспериментальных и
клинических исследованиях.
Техника постановки реакции
В лунки полистироловых планшетов вносят по 100 мкл
легионеллезных
иммуноглобулинов в концентрации 20 - 30 мкг/мл в карбонат-
бикарбонатном
буфере (КББ) pH = 9,5. Планшеты инкубируют при температуре 37 °С в
течение
2 часов или в течение 18 часов при +4 °С. Затем планшеты трижды
отмывают
ФСБ с 0,05% твина 20, просушивают. В лунки сенсибилизированных
планшетов
вносят разведения исследуемого материала (антигена) в объеме
100 мкл.
Разведения антигена делают на ФСБ с 0,05% твина 20. Инкубация 1 час
при 37
°С. Затем планшеты трижды отмывают по 5 минут ФСБ с 0,05% твина 20. В
лунки
отмытого планшета вносят конъюгат (легионеллезные
иммуноглобулины с
ферментом пероксидазы хрена). Конъюгат разводят тем же буфером с
твином 20
("рабочее разведение" конъюгата указано на этикетке). После 1-
часовой
инкубации при 37 °С лунки планшета тщательно
отмывают от
непрореагировавшего конъюгата. Затем в лунки планшета вносят по
100 мкл
свежеприготовленного субстрат-индикаторного раствора, содержащего
0,04%
О-фенилендиамина в 0,1 М цитратно-фасфатном буфере pH = 6,0 и
присутствии
0,006% H O . Инкубируют 30 минут в темноте при комнатной
температуре.
2 2
Реакцию останавливают равным объемом 1 н раствора серной кислоты.
Учет результатов
Реакцию учитывают визуально или фотометрически по изменению окраски субстрата в
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
опытных лунках. Появление желто-оранжевого окрашивания в лунках с антигенсодержащими
пробами при его отсутствии в контрольных отрицательных пробах свидетельствует о положительной
реакции. При фотометрическом учете результатов при 492 нм проба считается положительной, если
ОП опыта в 2 раза и более превышает ОП контроля. В качестве отрицательных контролей
обязательны контроль субстрата и контроль сорбции конъюгата.
Специфичность анализа подтверждается реакцией торможения, избытком легионеллезных
антител и реакцией с гетерологичными антигенами грамотрицательных бактерий.
Поделитесь с Вашими друзьями: |