Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор

На правах рукописи

Крылова Наталья Владимировна

Клеточные и молекулярные механизмы

противовирусной защиты при клещевом энцефалите

14.03.09. – Клиническая иммунология, аллергология

03.02.02. - Вирусология

Диссертация на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор,

Г.Н. Леонова

Академик РАМН, доктор медицинских наук,

Н.Н. Беседнова

Москва - 2014

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИФА - иммуноферментный анализ

КонА - конканавалин А

КЭ - клещевой энцефалит

Мн - моноциты

Мф – макрофаги

МКБ-10 – Международная классификация болезней Десятого пересмотра

МКБ-10 рубрика А84.0 – Дальневосточный клещевой энцефалит

Нф – нейтрофилы

РНК - рибонуклеиновая кислота

СПЭВ - перевиваемая культура клеток почек эмбриона свиньи

СГТ (СГТА) - средняя геометрических титров антител

ТЦД₅₀ – 50% тканевая цитопатическая доза

ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы

ЦНС – центральная нервная система

ЦПД - цитопатическое действие

CD - антигены кластеров дифференцировки клеток

CR - рецептор для компонентов комплемента

CTL - цитотоксические лимфоциты

С1, -3, -4, -5 – компоненты комплемента

DCs – дендритные клетки

FcR -рецептор для Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина

IL - интерлейкин

IgA-, M, -G – иммуноглобулины соответствующих классов

ICAM - молекулы межклеточной адгезии

IFN - интерферон

LD₅₀ – 50% летальная доза

МНС - главный комплекс гистосовместимости

NK - естественные киллеры

NKT - клетки — натуральные киллеры-Т-лимфоциты

PAMP - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (структуры)

PRRs - паттерн-распознающие рецепторы

TCR - T- клеточный рецептор

Thl, Th2 - субпопуляции CD4⁺ Т-лимфоцитов (хелперов)

TLR - Toll- подобный рецептор

TNF- фактор некроза опухоли

Название вирусов:

ВКЭ, TBEV - вирус клещевого энцефалита, tick-borne encephalitis virus;

DENV - Dengue virus, вирус Денге;

JEV — Japanese encephalitis virus, вирус Японского энцефалита;

WNV - West Nile virus, вирус лихорадки Западного Нила;

YFV - yellow fever virus, вирус Жёлтой лихорадки

HCV - вирус гепатита С.

Введение

Актуальность проблемы. Многолетнее изучение клещевого энцефалита (КЭ) позволило решить целый ряд фундаментальных вопросов этой патологии. Установлены этиология, основы патогенеза, описаны клинические проявления заболевания, разработаны методы диагностики и лечения, внедрен ряд профилактических мероприятий. Однако до сих пор эта нейроинфекция остается одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций на Евразийском континенте [44, 100, 116, 175, 286, 361, 410].

Несмотря на проводимые санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприятия и снижение уровня заболеваемости, наблюдаемое с начала XXI века, количество ежегодно регистрируемых заболеваний КЭ в Российской Федерации (РФ) остается достаточно высоким, расширяется нозоареал инфекции, что способствует увеличению инфицированности городского населения, высоким остается процент инвалидизации переболевших и число летальных исходов [97]. В целом по РФ последние пять лет (2008 – 2012 гг.) уровень заболеваемости КЭ находился в пределах: в 2008 г. – 1,9; 2009 г. - 2,6; 2010 г. - 2,2; 2011 г. – 2,5; 2012 г. – 1,9 на 100 тыс. населения [97]. В Приморском крае показатели заболеваемости КЭ в эти годы были: в 2008г. - 1,3; 2009 г. - 2,3; 2010 г. - 2,9; 2011 г. – 1,5; 2012 г. – 1,5 на 100 тыс. населения [98]. При этом показатели летальности по Приморскому краю в 2012г. (3,4%) в 2,4 раза превышали таковые по РФ (1,4%). Случаи смерти от КЭ в Приморском крае регистрируются ежегодно и составляют от 3,4% до 15,9% [98].

Анализ мер специфической профилактики КЭ свидетельствует о том, что в период 2008-2012 гг. произошло увеличение охвата населения профилактическими прививками против КЭ (в 2008г. было вакцинировано и ревакцинировано против КЭ 2718000чел., в 2012г. – 3242222 чел.) [97]. В Приморском крае за последние 5 лет вакцинация населения против КЭ, с учетом ранее сделанных прививок, увеличилась с 3,7% в 2008г. до 14,4% в 2012г. Необходимо отметить наличие заболеваемости КЭ у лиц, ранее привитых от этой инфекции: в общем, по РФ уровень заболеваемости населения, вакцинированного от КЭ, в 2012 г. составлял 3,9%, в Приморском крае – 3,4 % [98].

В последнее десятилетие в Приморском крае, как и в целом по РФ, наблюдается изменение клинической картины КЭ, связанной с преобладанием лихорадочных и инаппарантных форм этой инфекции. В 2012 г. число заболеваний с лихорадочной формой КЭ в крае составило 58,6%, инаппарантной - 17,2%, менингеальной – 13,8%, очаговой – 10,3% [98]. Кроме того, следует отметить чёткую тенденцию к увеличению случаев длительной персистенции антигена вируса КЭ, выраженность клинических проявлений, которой варьирует от бессимптомного носительства до манифестации процесса [43, 89, 150].

Известно, что иммуноопосредованные механизмы играют существенную роль в патогенезе КЭ, обусловливая клинический полиморфизм заболевания и исход патологического процесса [130, 237, 423, 456]. Однако, несмотря на проводимые исследования, функциональное состояние иммунной системы организма на начальном этапе развития различных вариантов инфекционного процесса, вызванного вирусом КЭ, остается недостаточно изученным. Между тем, использование иммунологических показателей, как факторов прогнозирования характера течения заболевания, что, прежде всего, необходимо, для дифференцированного подхода к терапии на ранних стадиях КЭ, является одним из перспективных направлений исследований.

Установлено, что неудачи вакцинопрофилактики сопровождают применение даже современных вакцин. При этом особенности функционирования иммунной системы вакцинированных пациентов при инфицировании ВКЭ, и даже заболевании КЭ, практически не изучены. В то же время изучение случаев заболевания вакцинированных лиц важно для оценки эффективности вакцинации и для решения вопроса о необходимости изменения рекомендаций по схемам ревакцинации.

Большинство авторов, описывающих явление клинического полиморфизма КЭ, связывают его с генотипической и фенотипической вариабельностью региональных популяций вируса КЭ [63, 88, 167]. На протяжении двух последних десятилетий в НИИЭМ СО РАМН и Лимнологическом институте СО РАН под руководством Г.Н. Леоновой и С.И.Беликова проводятся исследования по изучению биологических и молекулярно-генетических свойств разных штаммов вируса КЭ дальневосточной популяции [5, 13, 19, 69]. К началу нашей работы отсутствовали данные о взаимодействии штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с рецепторным аппаратом клеток врожденного и адаптивного иммунитета, не было сведений о влиянии этих штаммов на динамику продукции цитокинов. Это обусловило необходимость изучения способности штаммов вируса КЭ к модуляции иммунокомпетентных клеток на начальных этапах инфицирования и ее влияния на последующее развитие инфекционного процесса.

Основными нерешенными проблемами этиотропной терапии КЭ в современных условиях являются её недостаточная эффективность и вероятность развития побочных эффектов [40, 47, 72, 121, 150]. В этой связи, поиск препаратов, которые бы не только ингибировали репликацию вируса и элиминировали его из организма, но и корригировали индуцированное вирусом иммунодефицитное состояние, остается актуальным.

В настоящее время интерес ученых направлен на освоение и изучение морских гидробионтов в качестве источников получения новых биологически активных веществ. В России изучением биологически активных веществ морских гидробионтов интенсивно занимаются в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ), Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центре) и НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Среди природных морских биополимеров несомненный интерес представляют тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, и люромарин – полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae. Эти биополимеры обладают широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами [11, 24, 42, 74, 106, 127], что явилось основанием для изучения эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ для обоснования возможности их применения в комплексной терапии КЭ.

Вышеизложенное определяет актуальность и необходимость изучения иммунных механизмов начального этапа инфекционного процесса, обусловленного штаммами вируса КЭ, что создает предпосылки для разработки иммунологических подходов к ранней диагностике, прогнозу, лечению и профилактике заболевания.

1. Определить варианты развития инфекционного процесса у пациентов с КЭ на эндемичной территории Приморского края Дальнего Востока.

2. Дать комплексную оценку состояния врожденного и адаптивного иммунитета у вакцинированных и невакцинированных пациентов на ранней стадии инфицирования вирусом КЭ и установить иммунологические маркеры риска, предопределяющие длительную персистенцию возбудителя в организме;

3. Провести сравнительное изучение факторов клеточной и гуморальной защиты у привитых и непривитых пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде инфекционного процесса и определить иммунопатогенетические критерии тяжести течения и исхода заболевания;

4. Исследовать в экспериментах (ex vivo, in vitro и in vivo) процесс взаимодействия штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа с разной молекулярно-генетической характеристикой и биологическими свойствами с иммунокомпетентными клетками, используя в качестве критериев оценки экспрессию адгезивных и активационных молекул на поверхности клеток врожденного и адаптивного иммунитета;

5. Изучить на культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров, а также в крови и мозге мышей линии BALB/c инфекционный потенциал и цитокин-индуцирующую способность разных штаммов ВКЭ;

6. Дать сравнительную оценку эффективности некоторых официнальных препаратов и новых биологически активных веществ из морских гидробионтов (люромарин, тинростим) по отношению к вирусу КЭ на экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На ранней стадии инфекционного процесса у пациентов, невакцинированных и вакцинированных против КЭ, охарактеризовано состояние функциональной активности эффекторной фазы врожденного иммунитета в зависимости от уровня антигенемии ВКЭ. Невысокая антигенная нагрузка и активация клеточных и гуморальных факторов врожденного иммунитета способствует быстрой элиминации вируса, отсутствие их активации и высокий уровень антигенемии являются предикторами длительной персистенции вируса.

2. При манифестных формах КЭ в остром периоде заболевания умеренная активация клеточного, гуморального и цитокинового иммунного ответа у невакцинированных, а также вакцинированных против КЭ пациентов предопределяет развитие более легкого течения заболевания. Иммунопатогенетическими предикторами развития тяжелого течения КЭ являются: снижение содержания CD3⁺-, CD4⁺-Т-лимфоцитов, NK-клеток, иммуноглобулинов (IgG1, IgG3) и повышение количества В-лимфоцитов, увеличение концентраций цитокинов (IL-4, IL-10) и высокий уровень вирусспецифических IgM.

3. Штаммы вируса КЭ, изолированные от больных с разными клиническими формами инфекции, в зависимости от молекулярно-генетической характеристики и биологических свойств разнонаправлено модулируют рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию цитокинов. Высоковирулентный штамм ex vivo снижает экспрессию адгезивных (CD11b и ICAM-1) и активационных (CD69, CD25, CD95) молекул на клетках врожденного и адаптивного иммунитета и in vivo индуцирует высокий уровень системного и локального цитокинового ответа (TNFα, IL-6, IFNγ). Слабовирулентные штаммы ex vivo усиливают экспрессию молекул адгезии и активации и in vivo стимулируют высокий уровень продукции IL-10.

4. Биополимеры из морских гидробионтов - люромарин и тинростим с широким спектром биологического действия и иммуномодулирующими свойствами, проявляют in vitro и in vivo вирусингибирующую и протективную активность в отношении вируса КЭ. Экспериментально обоснована эффективность использования этих иммуномодуляторов в комплексной терапии КЭ.

Научная новизна исследования

На основе комплекса полученных данных существенно расширена концепция иммунопатогенеза КЭ. Представлены данные о роли клеточно-молекулярных иммуноопосредованных механизмов начального этапа инфекционного процесса, индуцированного штаммами вируса КЭ дальневосточного субтипа, и последующего развития и исхода вирусной инфекции.

На раннем этапе инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ выявлены различия в механизмах элиминации патогена, связанные с величиной антигенной нагрузки и особенностями активации иммунной системы. Установлено, что у невакцинированных пациентов с невысоким уровнем антигенемии ВКЭ происходит активация ключевых эффекторов врожденного иммунитета (NK-, NKT-клеток, IFNα), обусловливающая быструю элиминацию патогена, тогда как отсутствие их активации и более высокий уровень антигенемии приводит к длительной персистенции возбудителя.

В остром периоде заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ (лихорадочная, очаговые) выявлены значимые различия в субпопуляционном составе лимфоцитов, степени активации гуморального иммунитета, изменениях цитокинового профиля. Установлены иммунологические критерии, предопределяющие тяжелое течение КЭ: доминирование гуморального иммунного ответа по Th2 типу и снижение количества Т- и NK-клеток, реализующих киллерные механизмы цитотоксичности.

Показано, что у лиц, ранее вакцинированных против КЭ, различное течение инфекционного процесса (быстрая или замедленная элиминация антигена ВКЭ, или легкое течение лихорадочной формы КЭ) определяется разной эффективностью поствакцинального вирусспецифического иммунного ответа и степенью активации эффекторной фазы адаптивного иммунитета, индуцированной вирусом.

Установлено, что штаммы вируса КЭ, изолированные от пациентов с разными клиническими формами заболевания, в экспериментах ex vivo, in vitro, in vivo проявляют различные биологические свойства (вирулентность, скорость репродукции, нейроинвазивность). Способность штаммов разнонаправленно модулировать ранние этапы активации иммунокомпетентных клеток (экспрессию молекул CD11b, ICAM-1, CD69, CD25, CD95) и последующую продукцию цитокинов (IL-8, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6 и IL-10) оказывает существенное влияние на разнообразие течения и исходов инфекционного процесса.

В экспериментах установлена вирусингибирующая и протективная активность в отношении вируса КЭ биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих широким спектром биологического действия, в том числе и иммуномодулирующими свойствами. Их комбинированное применение с официнальными препаратами (рибавирином и циклофероном) усиливает протективный эффект, что свидетельствует о перспективности использования такой терапии при КЭ.

Практическая значимость работы

Полученные данные о начальных этапах иммунной защиты против вируса КЭ позволяют расширить стратегию прогнозирования течения и исхода инфекционного процесса с целью своевременного проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений.

Выявлены иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать: на ранней стадии инфекционного процесса у пациентов с антигенемией ВКЭ - замедленную элиминацию возбудителя, а в острой фазе заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ - тяжесть течения и исход вирусной инфекции.

Показано, что наличие высокого уровня вирусспецифического иммунного ответа, обусловленного вакцинацией, является важным фактором, способным предотвратить заболевание КЭ, обеспечить быструю элиминацию вируса или легкое течение этой нейроинфекции.

Полученные данные о различной способности штаммов ВКЭ модулировать рецепторный аппарат иммунокомпетентных клеток и продукцию этими клетками цитокинов не только расширяют знания о патогенезе при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, но и открывают перспективы для новых эффективных подходов в терапии данного заболевания. Моделирование ex vivo взаимодействия штаммов ВКЭ с рецепторным аппаратом иммунокомпетентных клеток может быть использовано как при изучении функциональной активности клеток, участвующих в инфекционном процессе, так и для направленного поиска терапевтических средств, влияющих на инфицированные вирусом клетки-мишени. Возможность динамического мониторинга функционального состояния иммунокомпетентных клеток, инфицированных ex vivo, может быть использована и при других вирусных инфекциях.

В экспериментах in vitro и in vivo показана перспективность использования в комбинированной терапии КЭ биополимеров из морских гидробионтов - люромарина и тинростима, обладающих противовирусной активностью в отношении ВКЭ, а также иммуномодулирующими свойствами, что позволяет сочетать этиотропное и патогенетическое лечение данной вирусной инфекции.

• патент РФ № 2439566 С1 «Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита» / Леонова Г.Н., Крылова Н.В.; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН; заявка № 2010138768 от 20.09.2010; опубл. 10.01.2012. Бюл. №1. – 8 с.

• патент РФ № 2432959 С1 «Средство, обладающее антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабетическим, противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием» / Попов А.М., Артюков А.А., Кривошапко О.Н., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Козловская Э.П.; заявитель и патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ ДВО РАН); заявка №2010141686/15 от 11.10.2010; опубл. 10.11.2011. Бюл. № 31. – 11 с.

• патент РФ № 2466190 С1 «Способ определения степени цитопатогенности вирусов» / Плехова Н.Г., Сомова Л.М., Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Ляпун И.Н.; заявитель и патентообладатель Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН; заявка № 2011112215 от 30.03.2011; опубл. 10.11.2012. Бюл. №11. – 7 с.

Основные положения и результаты работы были представлены на межрегиональной конференции с международным участием «Вакцинопрофилактика: проблемы настоящего и будущего» (Владивосток, 2000), международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003), 4-ой межгосударственной научно-практической конференции государств -участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), 6-ом конгрессе Северо-Балтийских стран по инфекционным болезням (Паланга, Литва, 2004), конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004), 4-ой научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 2004), международной научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Таиланд, 2004), Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХ1 веке» (Томск, 2006), X Международный симпозиум по клещевым заболеваниям (Вена, 2009), III Ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2011), XV Международный конгресс по вирусологии (Саппоро, 2011), Всероссийские форумы с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2006, 2007, 2008, 2009), юбилейные конференции, посвященные 75-летию открытия клещевого энцефалита (Иркутск, 2012, Хабаровск, 2012, Москва, 2013).

Апробация диссертации состоялась 22 октября 2013 г. на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ имени Г.П. Сомова» и 10 декабря на заседании Ученого совета ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, в том числе 29 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации материалов докторских диссертаций, 2 монографии, получено 3 патента на изобретение.

Работа выполнена при поддержке гранта МНТЦ «Молекулярно-генетическая, биологическая и патогенетическая характеристика популяции вируса клещевого энцефалита» (№ 4006 2010-2012гг.).