Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор

Рисунок 11. Экспрессия активационных молекул на поверхности NK-клеток (CD56) и Т-лимфоцитов (CD4 и CD8) через 24 часа инкубации со штаммами вируса КЭ, выраженная в %: А) экспрессия CD69; Б) экспрессия CD25; В) экспрессия CD95.

(рис.8А) и активным выходом из клеток во внеклеточное пространство (рис.8Б). Тем не менее, репликация в клетках этого штамма, отличающегося по своей биологической характеристике от штамма Dal, инициировала раннюю активацию клеток врожденного и адаптивного иммунитета. Усиление экспрессии штаммом Р-196 ранних активационных маркеров на моноцитах, NK-клетках и CD8⁺Т-лимфоцитах, т.е. на клетках, способных оказывать цитотоксическое действие на инфицированные клетки-мишени, свидетельствует о запуске каскада защитных механизмов, способствующих эффективной элиминации этого штамма.

Следующим этапом в изучении влияния штаммов ВКЭ на функциональную активность иммунокомпетентных клеток in vitro стало исследование продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови.

7.2 Динамика продукции цитокинов лейкоцитами крови in vitro под влиянием штаммов вируса КЭ с разной биологической характеристикой

В настоящее время активно изучается модуляция продукции цитокинов различными вирусами, во многом обусловливающая тяжесть и характер течения инфекционного процесса [38, 39]. Исследование продукции и секреции цитокинов в модельных системах in vitro позволяет оценить раннюю реакцию клеток в ответ на воздействие различных стимулов, в том числе и вирусных антигенов [166, 238]. В данном разделе работы процесс взаимодействия вируса КЭ с иммунокомпетентными клетками воспроизводился на мононуклеарных лейкоцитах человека, выделенных из крови здоровых доноров (n=10), которые инфицировали штаммами (Dal, Kip-94, Р-196) ВКЭ в одинаковой дозе 2 lg ТЦД₅₀/1х10⁶. Этот методический прием позволил нам более длительно (в течение 5 суток) наблюдать за особенностями накопления штаммов вируса в культуре мононуклеарных лейкоцитов и дать характеристику изменений продукции цитокинов в зависимости от штамма вируса и продолжительности антигенной стимуляции.

Проведено сравнительное изучение накопления штаммов (Dal, Kip-94, Р-196) вируса КЭ, выделенных у больных с различными формами заболевания, в культуральной жидкости мононуклеарных лейкоцитов (рис.12).

Рисунок 12. Динамика репродукции штаммов вируса КЭ в супернатантах культуры мононуклеарных клеток человека (n=10 доноров). По оси абсцисс – время наблюдения в часах и сутках, по оси ординат – титры вируса в lg ТЦД₅₀ (титрование на культуре клеток СПЭВ).

Установлено, что штамм Dal, выделенный от больного с очаговой формой инфекции, проявляет способность к накоплению вируса в супернатантах клеток только через 24 час. Затем показатели титров вируса быстро увеличивались в динамике с максимальными значениями на 2-3 сутки после инфицирования (3,0±0,5 lgТЦД50), проявляя выраженное цитопатическое действие до конца срока наблюдения. Штамм Kip-94, выделенный от больного с лихорадочной формой КЭ, медленнее накапливался в супернатантах культур клеток, достигая максимальных значений к 4-м суткам после инфицирования (2,0±0,4 lgТЦД50). При инфицировании культуры лейкоцитов штаммом Р-196, выделенным от пациента с инаппарантной формой инфекции, через 6 часов в культуральной жидкости отмечали наличие вируса (1,0±0,2 lgТЦД50). Затем происходило длительное до 4-х сут удержание показателей количества вируса на этом уровне и только к 5-м суткам отмечалось их некоторое повышение (1,5±0,2 lgТЦД50).

Судя по этим данным, можно сказать о том, что высоковирулентный штамм Dal (из кластера Sofjin-подобных штаммов) быстро проникает в мононуклеарные лейкоциты и активно реплицируется в них на протяжении 24 час, и затем вирус из клеток поступает в культуральную жидкость, где происходит его быстрое накопление. Штаммы Kip-94 (из кластера Oshima-подобных штаммов) и P-196 (из кластера Senzhang-подобных штаммов) накапливались в культуральной жидкости гораздо медленнее. Вероятно, несхожесть механизмов накопления штаммов внутри клеток и в культуральной жидкости сопряжена с их особенностями молекулярно-генетической характеристики. Также для других вирусов (WNV и вируса гриппа А) было показано, что ускоренная репликация вируса является одной из вирусных стратегий избегания иммунного, в том числе IFN ответа организма [253, 278, 332, 412].

7.2.2 Влияние штаммов ВКЭ на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарными клетками крови in vitro

Цитокин IL-8, относящийся к группе СХС-хемокинов, продуцируется многими видами клеток под действием разных флавивирусов, в том числе и вируса КЭ [203, 255, 349, 404]. Нами было установлено, что штаммы вируса КЭ активно индуцируют in vitro продукцию IL-8 мононуклеарными лейкоцитами во все сроки наблюдения. Цитокининдуцирующая активность штамма вируса Dal была значимо выше, чем у штаммов Kip-94 и P-196 (p≤0,05), в то же время значения показателей продукции IL-8, индуцируемых штаммами Kip-94 и P-196, не отличались между собой (p>0,05) (табл.14).

Уровень продукции IL-8 клетками, инфицированными штаммом Dal, повышался ко 2-м суткам культивирования, достигая пика на 3-и сутки, и оставался на высоком уровне до конца срока наблюдения. Максимальные значения показателей продукции исследуемого цитокина при инфицировании клеток штаммом Dal (1360 (1260-1400) pg/ml) были в 2,6 раза выше, чем в неинфицированной культуре клеток (515 (450-585) pg/ml). Наибольшая цитокининдуцирующая активность штамма Kip-94 зарегистрирована на 4-е сутки культивирования клеток (990 (926-1155) pg/ml, в контроле - 550 (495-600) pg/ml, p=0,002), а у штамма P-196 – на 5-е сутки (790 (705-950) pg/ml, в контроле – 580 (510-645) pg/ml, p=0,043).

Полученные нами данные совпадают с результатами исследований других авторов [233, 242, 377, 428], показавших, что белок NS5 флавивирусов DENV и HCV индуцирует экспрессию IL-8 в культуре дендритных и мононуклеарных клеток человека. Кроме того, этими авторами была выявлена нейтрализация IL-8, индуцированным флавивирусами, противовирусного действия IFNα, что способствовало усилению вирусной репликации.

TNFα продуцируется, главным образом, активированными моноцитами и макрофагами в ответ на воздействие различных флавивирусов как in vitro, так и in vivo [46, 217, 233, 319, 387, 428]. Мы установили, что исследуемые штаммы вируса КЭ стимулировали in vitro продукцию TNFα с первых суток культивирования их с мононуклеарными лейкоцитами (табл.14). Однако интенсивность продукции этого цитокина, вырабатываемого клетками под воздействием вируса, отличалась у разных штаммов. Наиболее высокую цитокининдуцирующую активность проявлял штамм Dal. Для этого штамма была характерна следующая динамика индукции TNFα: показатели продукции цитокина невысокие в 1-е сутки культивирования клеток резко увеличились ко 2-м суткам, достигли своего пика к 3-м суткам, затем постепенно снижались к 5-м суткам наблюдения. При этом максимальные значения показателей продукции цитокина при инфицировании клеток штаммом Dal (62,9 (54,0-71,3) pg/ml) были в 10 раз выше, чем в неинфицированной культуре клеток (5,4 (4,0-6,8) pg/ml). Динамика индукции TNFα штаммами Kip-94 и P-196 была иная: показатели продукции цитокина увеличивались постепенно, достигая своего
Таблица 14

Динамика продукции провоспалительных цитокинов (pg/ml) в культуре мононуклеарных лейкоцитов человека, инфицированных разными штаммами вируса клещевого энцефалита