Глава 6. Комплексная оценка состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания

В последнее десятилетие в структуре заболеваемости КЭ в Приморском крае наблюдается изменение клинической картины, связанной с преобладанием лихорадочных и инаппарантных форм этой инфекции. В 2012г. число заболеваний с инаппарантной формой увеличилось до 17,2% против 15,9 % в 2009г., уменьшилось число очаговых форм КВЭ до 10,3% против 27,3% в 2009г. и лихорадочных – до 58,6% против 65,5% соответственно, однако в 2012г. отмечалось увеличение менингеальных форм – 13,8% против 2,3% в 2009г. При этом случаи смерти от КЭ в Приморском крае регистрируются ежегодно, и составляют от 3,4% до 15,9% [98]. В числе больных КЭ были лица, вакцинированные против этой инфекции, удельный вес которых составлял от 3,4% до 10,1% [68]. Летальных исходов в группе привитых лиц не зарегистрировано, большинство случаев заболевания ограничилось лихорадочной (90,2%), менингеальной – 4,2% и очаговыми формами – 5,6% [68]. В период с 2008 года по 2012 год среди заболевших вакцинированных лиц в 100% были выявлены случаи только лихорадочной формы заболевания.

Целью настоящего раздела исследований явилось сравнительное изучение функциональной активности клеточного и гуморального иммунитета и цитокиновой системы пациентов с манифестными формами в остром периоде заболевания КЭ.

Всего обследовано 67 пациентов с зарегистрированным диагнозом КЭ (рубрика А 84.0 по МКБ 10). Выделены 3 группы: 1 группа – больные лихорадочной формой КЭ средней степени тяжести (невакцинированные и вакцинированные); 2 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом; 3 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ и летальным исходом.

Как видно из табл. 8, в первые дни заболевания (3-7 день) у всех пациентов 1-ой группы абсолютное количество лейкоцитов и лимфоцитов находилось в пределах вариабельности нормальных значений. В этот же период у пациентов 2-ой и 3-ей группы наблюдался умеренный лейкоцитоз (абсолютное количество лейкоцитов составило 9,1±2,3х10⁹/л и 10,2 (8,3-12,2)х10⁹/л, соответственно), а у больных 3-ей группы - относительная лимфопения (абсолютное количество лимфоцитов было - 1,4 (1,1-1,5) х10⁹/л).

Дополнительно, для оценки степени интоксикации определяли лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), который можно использовать в качестве косвенного признака состояния иммунной системы и ее реактивности. У пациентов 1-ой группы ЛИИ не отличался от такового у здоровых доноров (0,65±0,15 и 0,51±0,10, p=0,380, соответственно), что свидетельствовало об удовлетворительном состоянии их иммунной системы. В то же время значимое повышение ЛИИ у пациентов с очаговыми формами КЭ (2-ая и 3-я группы) (2,62±0,7 и 6,43 (3,2-8,4), p≤0,05) по сравнению со здоровыми донорами (0,51±0,10) расценивалось как недостаточность иммунной системы.

При анализе показателей, характеризующих структуру основных субпопуляций лимфоцитов, у пациентов всех трех групп, за исключением вакцинированных ранее лиц, были выявлены признаки Т-клеточного дефицита, связанного со значимым уменьшением количества лимфоцитов, экспрессирующих CD3⁺- и CD4⁺-антигены (p≤0,05) (табл.8). При этом в острый период болезни у невакцинированных пациентов 1-ой группы регистрировалось снижение лишь относительного содержания этих субпопуляций по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров. У вакцинированных пациентов этой группы количество CD3⁺ и CD4⁺-лимфоцитов не отличалось от такового у здоровых доноров. В то же время у

Таблица 8

Субпопуляционный состав лимфоцитов у пациентов с манифестными формами КЭ в острый период заболевания

пациентов 2-ой и 3-ей групп выявлено значимое уменьшение относительного содержания и абсолютного количества CD3⁺CD19^- и CD3⁺CD4⁺-лимфоцитов. Значимое уменьшение содержания цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺) обнаружено только у пациентов 3-ей группы. Иммунорегуляторный индекс (ИРИ), характеризующий соотношение между субпопуляциями CD4⁺- и CD8+-лимфоцитов периферической крови, у пациентов с лихорадочной формой КЭ находился в пределах вариабельности нормальных значений. Снижение ИРИ при очаговых формах КЭ было обусловлено уменьшением количества CD4⁺Т-клеток, а у пациентов с неблагоприятным исходом еще и снижением содержания CD8⁺Т-лимфоцитов (1,3±0,4 и 1,1 (1,0-1,3), соответственно).

При изучении В-клеточного звена иммунитета количество CD3^–CD19⁺-лимфоцитов не изменялось только у невакцинированных пациентов 1-ой группы. У вакцинированных лиц 1-ой группы и пациентов 2-ой и 3-ей групп регистрировалось значимое увеличение относительного содержания и абсолютного количества этих клеток по сравнению с показателями в группе здоровых доноров.

Исследование субпопуляций NK- и NKT-клеток, обладающих цитотоксической активностью, показало, что изменения количества этих клеток носили разнонаправленный характер в зависимости от формы заболевания КЭ (табл.8). У пациентов с лихорадочной формой КЭ в остром периоде заболевания относительное содержание и абсолютное количество CD3^–CD16⁺CD56⁺- и CD3⁺CD16⁺CD56⁺ -лимфоцитов было значимо повышено по сравнению с таковыми показателями у здоровых лиц (p≤0,05). У пациентов с очаговыми формами заболевания наблюдалось снижение числа этих клеток, наиболее выраженное у лиц 3-ей группы (p≤0,05).

В острый период заболевания у пациентов с лихорадочной формой КЭ выявлялось значимое увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные антигены (CD3⁺CD25⁺, HLA-DR⁺, CD3⁺CD95⁺). В то же время у пациентов с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом признаки Т-клеточной активации отсутствовали (p>0,05), с летальным исходом – экспрессия активационных маркеров была снижена (p≤0,05). Показатели, отражающие соотношение пролиферативных и элиминационных процессов (CD25⁺/CD95⁺), у обследованных пациентов различались. Так, у пациентов 1-ой группы это соотношение, будучи выше аналогичного показателя у здоровых доноров, оставалось в пределах нормативных значений (1,0 – 2,0). Снижение показателей этого соотношения при неблагоприятном исходе у больных очаговыми формами КЭ (0,76 – 0,80) свидетельствовало о выраженной вирусиндуцированной супрессии клеточного звена иммунитета этих пациентов.

Установленные в настоящем исследовании изменения в субпопуляционном составе Т-лимфоцитов не только подтверждают наличие Т-клеточного дефицита у невакцинированных пациентов с разными формами КЭ, но и позволяют рассматривать эти изменения как дополнительные лабораторные критерии, указывающие на прогрессирование заболевания. Наиболее важным в плане прогноза течения КЭ является определение изменений относительного содержания и абсолютного количества следующих популяций лимфоцитов: CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, NK, NKT, CD25⁺, CD95⁺ (табл.8). Снижение показателей CD4⁺/CD8⁺ и CD25⁺/CD95⁺ является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания КЭ.

Для верификации КЭ в остром периоде решающее значение имеет обнаружение в крови больных вирусспецифических антител класса IgM. В наших исследованиях у всех пациентов с лихорадочной формой КЭ в этот период уровень вирусспецифических IgM был невысоким (табл.9). Содержание антител у вакцинированных и невакцинированных пациентов этой группы значимо различалось (1,2±0,3 и 2,0±0,5, p=0,004). Уровень антител класса IgM у пациентов с очаговыми формами КЭ было значимо выше (8,6 ± 1,8 и 8,9±2,1), чем у лиц 1-ой группы (p=0,000). В то же время только у пациентов 1-ой группы, ранее вакцинированных против КЭ, в остром периоде выявлялись вирусспецифические антитела класса IgG и вируснейтрализующие антитела (СГТА составила 45±11) (табл.9).

Таблица 9

Уровень вирусспецифических антител в остром периоде заболевания у пациентов с манифестными формами КЭ

Таблица 10

При изучении продукции отдельных подклассов IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) установлено, что у пациентов 1-ой группы содержание IgG1, IgG2 и IgG4 не отличалось от такового у здоровых доноров (табл.10). В то же время у этих пациентов зарегистрировано значимое повышение концентраций IgG3 (p≤0,05), играющего важную роль в противовирусном иммунитете. Показатели IgG1/IgG3, характеризующие соотношение Th2-зависимых IgG1-антител и Th1-зависимых IgG3-антител, у пациентов 1-ой группы были ниже, чем таковые у здоровых доноров (p≤0,05), что можно расценить как раннюю поляризацию иммунного ответа в сторону Th1-типа. В этот же период у пациентов 2-ой и 3-ей групп отмечено снижение содержания подклассов IgG1и IgG3 по сравнению с таковыми показателями у здоровых доноров (p≤0,05), что может рассматриваться как один из критериев, характеризующих тяжесть течения заболевания.

Исследование процесса иммунокомплексообразования у пациентов с манифестными формами КЭ показало, что в остром периоде заболевания у всех обследованных лиц уровень ЦИК был значимо выше, чем в группе здоровых доноров (p≤0,05). Следует отметить, что у пациентов с разными формами КЭ были выявлены различия качественного состава ЦИК (рис.6). Так, у вакцинированных и невакцинированных пациентов 1-ой группы размеры иммунных комплексов значимо не отличались от таковых у здоровых лиц.

Анализ качественного состава ЦИК у пациентов с очаговыми формами КЭ показал изменение размеров иммунных комплексов в сторону снижения количества крупномолекулярных ЦИК и увеличения средне- и низкомолекулярных ЦИК (рис.6). Повышение уровня ЦИК в сыворотке крови преимущественно за счет низкомолекулярных и среднемолекулярных иммунных комплексов может быть одним из условий развития у данных групп пациентов иммунопатологических реакций, что согласуется с данными других исследователей [149, 151].

Таким образом, у пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания была выявлена разная степень активации гуморального иммунитета. У пациентов с лихорадочной формой КЭ отмечалась адекватная активация гуморальных факторов иммунитета, сопровождающаяся невысоким повышением уровня вирусспецифических антител класса IgM, подкласса IgG3, преобладанием ЦИК крупных размеров и активацией компонентов комплемента. У вакцинированных пациентов этой же группы отмечалось более легкое течение инфекционного процесса, которое, кроме того, было сопряжено с наличием вирусспецифических антител класса IgG и менее выраженной активацией системы комплемента. При очаговых формах КЭ установлена дисфункция гуморального иммунитета, характеризующаяся повышенным синтезом общих и вирусспецифических антител класса IgM на фоне сниженного содержания общего сывороточного IgG и его подклассов IgG1 и IgG3. Кроме того, у этих больных происходит гиперактивация системы комплемента и повышение содержания ЦИК средних и мелких размеров.

Исследование цитокинового профиля пациентов с манифестными формами КЭ выявило различный уровень продукции цитокинов в острый период заболевания (3-7 день) (табл. 11). В этот период у пациентов с лихорадочной формой КЭ концентрации провоспалительных цитокинов (IL-8, IL-1β, IFNα, TNFα) - основных участников регуляторной сети при развитии острого воспаления, в 2-3 раза превышали аналогичные показатели у здоровых лиц (p≤0,05). При этом уровень вышеназванных цитокинов у вакцинированных лиц 1-ой группы был значимо ниже такового у невакцинированных лиц этой группы (p≤0,05). У пациентов с очаговыми формами КЭ уровень продукции IL-8, IL-1β, TNFα различался: при неблагоприятном исходе содержание этих цитокинов в сыворотке крови было в 3 - 10 раз, а при благоприятном исходе – в 1,4-1,6 раз выше, чем таковое в группе здоровых лиц. В то же время концентрации цитокина IFNα у этих больных находились в пределах вариабельности нормальных значений (p>0,05).

В острой фазе заболевания содержание противовоспалительных цитокинов (IL-4 и IL-10) было значимо повышено только в группе пациентов с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом (p≤0,05). У остальных обследованных пациентов концентрации IL-4 и IL-10 не отличались от таковых у здоровых людей (табл.11). Соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (TNFα/IL-4) при очаговых формах КЭ с неблагоприятным и

Таблица 11.

Концентрация цитокинов в сыворотке крови пациентов с манифестными формами КЭ

в острый период заболевания

благоприятным исходом резко различалось (8,2 (6,0-9,3) и 1,1±0,3, p=0,000, соответственно). Известно, что лишь умеренное повышение значений показателя TNFα/IL-4 в острой фазе инфекционного процесса соответствует общеиммунологическим закономерностям [43, 82]. Таким образом, резкое повышение или отсутствие изменений этого показателя в остром периоде заболевания могут свидетельствовать о тяжелом течении инфекционного процесса.

Рядом авторов продемонстрировано патологическое действие на ЦНС высоких концентраций IL-6 [46, 67, 184]. В ходе проведенного исследования нами зарегистрировано повышение уровня IL-6 у пациентов с манифестными формами КЭ (табл. 11). Исключение составили вакцинированные пациенты с лихорадочной формой заболевания, у которых содержание в сыворотке крови IL-6 находилось в пределах вариабельности нормальных значений. У пациентов 3-ей группы средние значения содержания этого цитокина уже на 3-7 день заболевания четырехкратно превышали нормативные значения (16,2 (12,5-18,0) и 3,9±1,1, соответственно). Таким образом, раннее повышение содержания IL-6 в крови может быть расценено как прогностически неблагоприятный признак, соответствующий наиболее тяжелому течению болезни с поражением нервной системы.

Нами было установлено, что уровень провоспалительного цитокина - IFNγ, являющимся также иммунорегуляторным цитокином, у пациентов с манифестными формами КЭ был выше, чем у здоровых доноров (p≤0,05). При этом содержание IFNγ у вакцинированных пациентов с лихорадочной формой КЭ значимо превышало таковое у невакцинированных пациентов этой группы (p=0,006). Соотношение IFNγ/IL-4, характеризующее уровень цитокинового баланса Th1- и Th2-лимфоцитов, у пациентов с лихорадочной формой КЭ и очаговыми формами КЭ (с неблагоприятным исходом) было значимо выше, чем в группе здоровых доноров (p≤0,05), что можно расценивать как поляризацию иммунного ответа в сторону Th1-типа. У пациентов с очаговыми формами КЭ и благоприятным исходом показатели отношения IFNγ/IL-4 были ниже, чем в группе здоровых доноров (p≤0,05), что указывало на преобладание Th2-типа иммунного ответа.

Для изучения резервного потенциала иммунокомпетентных клеток была проведена оценка способности клеток периферической крови пациентов с манифестными формами КЭ к продукции цитокинов ex vivo. Сравнительный анализ продукции цитокинов в культурах интактных и индуцированных КонА клеток цельной крови пациентов с различными формами КЭ показал, что при стимуляции КонА наблюдалось усиление продукции всех исследуемых цитокинов (IL-8, IL-1β, INFα, INFγ, IL-6, IL-4 и IL-10). При этом индекс стимуляции (ИС), характеризующий отношение индуцированной продукции цитокинов к интактной продукции, у лиц 1-ой группы находился в пределах вариабельности нормальных значений, что свидетельствовало о достаточных резервных возможностях клеток крови этих пациентов (p>0,05) (рис.7).

Рисунок 7. Индекс стимуляции (индуцированной/интактной) продукции цитокинов у пациентов с манифестными формами КЭ в остром периоде заболевания

Значимое снижение этого показателя зарегистрировано только у пациентов с очаговой симптоматикой КЭ при исследовании продукции TNFα и IFNγ, что можно расценивать как ограниченные резервные возможности их иммунокомпетентных клеток.

Таким образом, цитокиновый статус у пациентов с лихорадочной формой КЭ и легким течением заболевания в острой фазе инфекционного процесса характеризовался умеренной активацией цитокинов Th1-типа и цитокининдуцирующей способности клеток. Обнаружение у пациентов в первую неделю заболевания иммуносупрессорных изменений в системе цитокинов, а именно: снижение цитокининдуцирующей функции иммунокомпетентных клеток на фоне дефицита продукции провоспалительных цитокинов и ранней поляризации иммунного ответа в сторону Th2-типа, обусловило тяжелое течение заболевания (очаговые формы с благоприятным исходом). При летальном исходе у пациентов с очаговыми формами КЭ в острой фазе инфекционного процесса регистрировалась дисфункция цитокиновой системы активационного типа, характеризующаяся Th1-типом иммунного ответа и гиперпродукцией провоспалительных цитокинов, приведших к резкому снижению резервного потенциала иммунокомпетентных клеток.

* * *

Комплексное изучение функционального состояния иммунной системы пациентов с манифестными формами КЭ показало, что неадекватность иммунного ответа в острой фазе инфекционного процесса во многом предопределяет тяжесть течения и исход заболевания.

Таким образом, различная степень иммуносупрессии у пациентов с инаппарантными и манифестными формами КЭ зависит от функциональной активности иммунной системы пациентов, которая разнопланово реагирует на возбудитель, попавший в организм. В последующем разделе работы будет изучено влияние разных по биологической и молекулярно-генетической характеристике штаммов вируса КЭ на функциональную активность иммунокомпетентных клеток в экспериментальных условиях.