Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор
Глава 3. Современные средства этиотропной терапии при флавивирусных инфекциях
Скачать 2.16 Mb.
|
- Навигация по данной странице:
- 3.1. Противовирусные препараты, обладающие прямым этиотропным действием (химиопрепараты и интерфероны)
- 3.2.Препараты, обладающие иммуномодулирующими и противовирусными свойствами
- 3.3.Иммуномодуляторы природного происхождения
- СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 4. Материалы и методы исследования
- 4.1 Материалы исследования
- I. Верифицирование диагноза КЭ
- II . Общеклинические методы исследования
- III . Иммунологические исследования
- IV . Вирусологические исследования
- V . Исследование противовирусной активности препаратов
- VI . Статистический анализ
| Глава 3. Современные средства этиотропной терапии при флавивирусных инфекциях
На современном этапе стало совершенно очевидным, что лечение при флавивирусных инфекциях должно быть направлено не только на элиминацию возбудителя, но и на восстановление инверсированного иммунного ответа макроорганизма, а также на подавление индуцированных вирусом иммунопатологических реакций. Соответственно выделяют несколько мишеней терапевтического воздействия: ингибиция репликации вируса и его элиминация из организма, коррекция вторичного иммунодефицита, модуляция специфического иммунного ответа и предупреждение персистенции вируса. 3.1. Противовирусные препараты, обладающие прямым этиотропным действием (химиопрепараты и интерфероны) Химиотерапия против вирусных инфекций разрабатывается с использованием двух принципиально разных стратегий. При применении первой, традиционной стратегии блокируются функции вируса, при второй - блокируются функции клетки, необходимые для размножения вируса. Второй подход, находящийся в стадии разработки, осложняется тем, что он может препятствовать нормальной клеточной функции, но его потенциальные преимущества состоят в том, что терапия действенна в отношении всех вирусов одного и того же рода, и появление резистентности к этому типу химиотерапии наблюдается в редких случаях [281, 419]. Механизм действия традиционных противовирусных химиопрепаратов заключается в избирательном подавлении отдельных этапов репродукции вирусов без существенного нарушения жизнедеятельности клеток макроорганизма. Последнее обстоятельство определяет основную сложность получения высокоэффективных противовирусных препаратов, так как обязательный внутриклеточный этап размножения вирусов тесным образом связан с функционированием инфицированных клеток. Более того, синтез вирусных геномов и белков, транспорт вирусных компонентов и сборка новых вирионов осуществляются инфицированными клетками, и лишь немногие из этих процессов вирусоспецифичны. Поэтому основным требованием, предъявляемым к противовирусным препаратам, является избирательное подавление репродукции вируса без побочного действия на жизненные функции клеток хозяина. Проведенный скрининг сотен тысяч химических соединений показал, что противовирусными свойствами обладают лишь немногие из них [35]. Это, прежде всего группа аномальных нуклеозидов, к которым относится рибавирин – один из наиболее важных антифлавивирусных препаратов.
Рибавирин характеризуется широким спектром противовирусного действия и эффективностью при заболеваниях, вызываемых ДНК- и РНК-содержащими вирусами (грипп, аденовирусные, герпетические инфекции, гепатиты А, В и С, геморрагические лихорадки) [3, 49, 126]. Как было показано, в отношении многих флавивирусов, рибавирин проявлял противовирусную активность in vitro, но оказался не в состоянии защитить экспериментально инфицированных животных [306, 336, 338, 357, 406]. Кроме того, монотерапия рибавирином оказалась мало эффективной при лечении хронического гепатита С [413]. Однако сочетание рибавирина с пегилированным IFNα стало традиционной стандартной терапией пациентов с ХГС [254, 264]. Опубликованы сведения о клинической эффективности рибавирина в сочетании с рекомбинантным IFNα2 (интераль) в терапии острых и хронических форм КЭ [57, 144]. Таким образом, поиск и внедрение новых противовирусных препаратов высокоэффективных при флавивирусных инфекциях продолжает оставаться актуальным. Так, например, для преодоления гемолитической анемии, вызываемой рибавирином, исследователи уже разработали аналог рибавирина, новую категорию IMPDH ингибиторов. Одно из соединений – вирамидин - продемонстрировало значительную противовирусную активность и эритроцит-щадящие свойства и в настоящее время находится в 3-ей фазе клинических испытаний. Еще один активный аналог merimepodip проходит 2 фазу испытаний [282]. - Интерфероны Наиболее важными свойствами IFN являются их способность оказывать прямое противовирусное действие, а также участвовать в регуляции иммунных процессов. Сочетание этих свойств служит основанием для широкого применения интерферонов в качестве лечебных препаратов. В настоящее время десятки фармацевтических фирм производят широкий перечень лекарственных форм препаратов IFN. Существующие медицинские препараты интерферонов делятся на природные человеческие лейкоцитарные IFN (первое поколение) и полученные с помощью методов генной инженерии рекомбинантные IFN (второе поколение). В последние годы отмечается стремительное расширение масштабов использования рекомбинантных IFN и сокращение применения природных препаратов, что связано с дефицитом сырья (донорская кровь) для производства последних и с высокой стоимостью конечного продукта [36]. Наиболее широко испытаны различные лекарственные формы природных и рекомбинантных IFNα, опыт, клинического использования которых насчитывает более 30 лет. Для IFNα противовирусная активность является основной и наиболее детально изученной. Многолетнее клиническое применение этих препаратов позволяет говорить об их универсально широком диапазоне антивирусных эффектов и возможности использования их при самых различных вирусных инфекциях. При флавивирусных инфекциях эффективность терапии препаратами IFNα изучали многие исследователи. На моделях in vitro и in vivo было показано, что применение IFNα приводит к снижению вирусной нагрузки и смертности при инфицировании разными флавивирусами [191, 195, 219, 336]. Кроме того, было показано нейропротекторное действие IFNα/β на модели нейрональных клеток, инфицированных WNV [424]. Терапия препаратами IFNα2b снижала неврологические осложнения у людей в случае энцефалитов, вызванных вирусами St. Louis и WNV [220, 267, 475]. Назначение IFNα2а детям, инфицированным JEV, улучшило исход заболевания [335]. В комплексной терапии КЭ использовались препараты IFNα как человеческие лейкоцитарные, так и рекомбинантные. Так, О.Ю. Устиновой (1996) было показано, что включение препаратов IFNα2b (реаферона и виферона) в комплексную терапию пациентов с менингеальной формой КЭ сокращает продолжительность и выраженность основных клинических симптомов болезни. В то же время автор отмечает, что назначение этих препаратов пациентам с очаговыми формами КЭ хоть и увеличивало продолжительность жизни больных, однако не предотвращало наступления летального исхода. В настоящее время прошел клинические испытания, и с 2011 года разрешен к применению в составе комплексной терапии КЭ отечественный препарат «Реаферон-ЕС-Липинт», являющийся липосомальным пероральным рекомбинантным IFNα2b. Авторами [108, 123] было показано, что терапия Реаферон-ЕС-Липинтом у пациентов с лихорадочной и менингеальной формой КЭ сокращает продолжительность лихорадочного периода, предупреждает развитие двухволнового течения КЭ, препятствует хронизации процесса. Однако при анализе итогов клинических испытаний интерферонов было отмечено, что уровень лечебного действия этих препаратов оказался ниже того, который можно было бы ожидать из представлений, основанных на экспериментальных данных, полученных in vitro и in vivo [343]. Это можно объяснить тем, что эффект интерферонотерапии оказался зависим от многих факторов: от вида и тяжести течения инфекции, от индивидуальной чувствительности к IFN, от доз, частоты, продолжительности, путей введения препарата, сочетания его с другими био- и химиопрепаратами [36]. Кроме того, к другим недостаткам интерферонотерапии относят высокую стоимость препаратов, широкий перечень противопоказаний к ее назначению, длительность терапии, наличие побочных эффектов. Это создает необходимость поиска новых эффективных безвредных средств, в том числе с иммуномодулирующей активностью.
Способностью индуцировать IFN обладают различные соединения, многие вирусы и микроорганизмы, продукты из них, природные полифенолы и широкий круг синтетических соединений. Созданные индукторы IFN представляют собой весьма многочисленное семейство высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, единичные представители которого отобраны для терапевтического использования. Следует особо подчеркнуть, что все наиболее известные индукторы интерферона разработаны отечественными учеными (коллектив под руководством Ф.И.Ершова лаборатории онтогенеза вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН). Изучение специфической активности таких индукторов обнаружило их важнейшее свойство – широкий диапазон антивирусной активности. Помимо противовирусного этиотропного действия практически все они обладают, подобно IFN, выраженной иммуномодулирующей активностью, что позволяет отнести их к бифункциональным препаратам [421]. Использование индукторов интерферона различной природы показало, что их активность во многом совпадает с ранее выявленной активностью препаратов IFN, но индукторы интерферона имеют ряд преимуществ перед ними:1) не имеют побочных эффектов, наблюдаемых при передозировке препаратов IFN; 2) не требуется многократного введения [37] . Исследования (in vitro и in vivo) противовирусной активности индукторов интерферона при флавивирусных инфекциях проводились некоторыми зарубежными авторами [245, 266, 338, 345]. Отечественными учеными при инфекциях, вызванных флавивирусами, в том числе и при ВКЭ, была изучена экспериментальная и клиническая эффективность целого ряда низко- и высокомолекулярных природных и синтетических индукторов интерферона: циклоферона, ридостина, кагоцела, 4-йодантипирина [34, 61, 131, 168, 171]. - Циклоферон (меглюмина акридонацетат) – российский низкомолекулярный индуктор интерферона. Механизм действия препарата заключается в его способности индуцировать образование эндогенных IFNα/β в высоких титрах, сохраняющихся в течение 3-х суток, что и определяет широкий спектр его биологической активности (противовирусной, иммуномодулирующей, противовоспалительной) [133]. Препарат обладает как прямым, так и опосредованным действиями на различные звенья иммунитета. Иммуномодулирующий эффект циклоферона выражается в стимуляции стволовых клеток костного мозга, активации Мф и их миграции в ткани, активации и завершенности фагоцитоза. Воздействие циклоферона на Т-клеточный иммунитет, выражающееся в нормализации субпопуляций Т-лимфоцитов, повышении активности NK-клеток и CTL, осуществляется, скорее всего, не непосредственно этим препаратом, а индуцированным им эндогенным IFN. Циклоферон стимулирует также и гуморальный иммунитет, что проявляется в увеличении концентрации высокоавидных антител [37, 161]. Циклоферон активен в отношении многих вирусов: КЭ, гриппа, гепатита, герпеса, цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, вируса папилломы, различных энтеровирусов. Ряд авторов показали, что использование циклоферона в комплексной терапии пациентов с лихорадочной и менингеальной формами КЭ приводит к более быстрому купированию клинических симптомов заболевания, сокращению сроков лечения в стационаре, коррекции иммунологических показателей и предупреждает развитие двухволнового течения [130, 133]. - 4-йодантипирин (1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон) – индуктор интерферона, синтезированный в Томском политехническом университете [136], разрешенный, как и вышеперечисленные препараты, Минздравом РФ к медицинскому применению в качестве противовирусного препарата для лечения и профилактики КЭ. Точный механизм действия 4-йодантипирина пока не установлен. Однако в результате исследований были выявлены его интерфероногенные и противовоспалительные свойства. Установлено, что 4-йодантипирин не прямо, а опосредовано усиливает продукцию эндогенных IFNα/β, вероятно, за счет своей способности подавлять синтез простагландинов, которые оказывают ингибирующее действие на продукцию интерферонов. В экспериментах in vitro и in vivo было показано, что препарат способен подавлять репродукцию ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов. 4-йодантипирин оказывает стабилизирующий эффект на биологические мембраны, что может также обусловливать торможение проникновения вируса в клетку. Иммуномодулирующее действие препарата обусловлено индукцией синтеза вируснейтрализующих антител и стимуляцией клеточного иммунитета - зрелых Т- лимфоцитов, NK-клеток [54, 85, 95, 120]. Установлено, что применение 4-йодантипирина в комплексной терапии КЭ снижало продолжительность лихорадочного периода, длительность субфебрилитета и общеинфекционных проявлений, а также сроки пребывания в стационаре, реже наблюдался постинфекционный астенический синдром [137]. Таким образом, к настоящему времени индукторы интерферона заняли достойное место в комплексной терапии вирусных инфекций как противовирусные препараты и корректоры иммунитета, обеспечивающие эффективное завершение терапии и предотвращение хронизации инфекционного процесса и его рецидивы. Одним из вероятных подходов к коррекции иммунных нарушений у пациентов с флавивирусными инфекциями может явиться включение в комплексную терапию новых эффективных и безвредных иммуномодуляторов, в том числе и природного происхождения. 3.3.Иммуномодуляторы природного происхождения Известно, что около половины всех имеющихся на настоящий момент лекарственных средств разработаны на основе соединений, имеющих природное происхождение. С этой целью традиционно использовались высшие растения, и до сих пор почти все используемые в лечебных целях природные продукты или их производные были получены из наземных организмов [394]. Однако в мировом океане имеется огромное количество биоресурсов, содержащих биологически активные вещества (БАВ). Исследования последних лет показали, что многие из морских естественных соединений являются структурно уникальными, отсутствуют у наземных организмов и часто превосходят аналоги наземного происхождения по биологической или фармакологической активности [11, 32, 405]. Анализ этих работ показывает, что наиболее интересными источниками фармакологически активных соединений являются морские беспозвоночные (губки, моллюски, асцидии) и водоросли [11, 42, 291]. В России изучением биологически активных веществ морских гидробионтов наиболее активно занимаются в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (ТИБОХ), Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйственном центре (ТИНРО-центре) и НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Был исследован целый ряд соединений морского происхождения (белков, полисахаридов, пептидов, полифенолов и др.), обладающих высокой биологической, в том числе, иммуномодулирующей активностью и создана основа для конструирования оригинальных иммуномодуляторов. В настоящей работе для изучения противовирусной активности биополимеров из морских гидробионтов, разработанных в вышеперечисленных институтах, особое внимание было уделено исследованию тинростима - комплекса пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister, и люромарина – полифенольного комплекса, выделенного из морских трав семейства Zosteraceae (Zostera marina и Zostera asiatica). Выбор представленных выше биополимеров определялся тем, что эти вещества обладают широким спектром биологического действия, позволяющим рассматривать их как потенциальные объекты для будущих лекарств. Важным обстоятельством являлось и то, что тинростим уже выпускается в виде биологически активной добавке к пище и используется практическими врачами в качестве средства сопровождения базисной терапии при некоторых заболеваниях [10, 60, 125]. Изучение пептидов, выделенных из природных источников и обладающих высокой биологической, в том числе, иммуномодулирующей активностью, является одним из перспективных направлений в иммунофармакологии. Иммунорегуляторными пептидами первого поколения были лекарственные средства, представляющие комплекс пептидов, экстрагированных из тимуса (тактивин, тималин, тимоптин, тимактид и др.), костного мозга (миелопид), эпифиза (эпиталамин), простаты (простатилен) [11, 87, 92]. Трудность стандартизации препаратов первого поколения привела к созданию синтетических препаратов второго и третьего поколения (тимоген, тимопентин, иммунофан, спленин) и низкомолекулярных иммуномодулирующих олигопептидов (гепон, глутоксим и аллоферон) [155, 156]. С самого начала истории изучения пептидов они нашли достаточно широкое применение в инфекционной патологии и, в частности, при вирусных инфекциях. К настоящему времени накоплен большой опыт клинического использования таких классических иммунокорректоров пептидной природы, как тактивин, тималин, тимоптин и др., которые широко применяются в комплексной терапии герпесвирусной инфекции, гепатите, гриппе и ОРВИ и др. [12, 33]. Цикл работ дальневосточных ученых посвящен результатам получения и изучения пептидов иммуномодулирующего действия из костного мозга морских млекопитающих [104], из молок лососевых рыб выделен полипептидный препарат молокин [62]. Из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister выделен комплекс пептидов – тинростим [106]. Иммуномодулирующие свойства этого пептидного соединения были исследованы А.К. Гажа (1994), Н.Н. Беседновой (2004), Т.С. Запорожец (2006). Установлено, что тинростим стимулирует гуморальный иммунный ответ, фагоцитоз, оказывает активирующее воздействие на ферменты антиоксидантной системы, проявляет апоптозрегулирующую активность. Кроме того, тинростим влиял на перекисное окисление липидов, реакции сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, обладал противовоспалительными свойствами [125]. Учитывая иммуномодулирующие свойства тинростима, представляется важным исследовать его противовирусную активность в отношении вируса КЭ и обосновать целесообразность его применения в комплексной терапии КЭ. Другим классом природных соединений, обладающих широким спектром биологической активности, являются растительные полифенолы. В лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН был выделен из морских трав семейства Zosteraceae (Z. marina и Z. asiatica) полифенольный комплекс «люромарин», состоящий из розмариновой кислоты (45%), дисульфата лютеолина (45%) и лютеолина (10%) [74, 127]. Ранее установлено, что полигидроксилированный фенол розмариновая кислота и флавон лютеолин, имеющие широкое распространение среди пищевых и лекарственных растений, являются биологически активными веществами с разносторонним спектром действия [268, 473, 480]. В настоящее время установлено, что основные фармакологические эффекты розмариновой кислоты и лютеолина связаны с высокой антиоксидантной и противовоспалительной активностью, а также с модуляцией функциональной активности иммунокомпетентных клеток [199, 276, 342, 434]. Важно подчеркнуть, что эти соединения хорошо абсорбируются кожей и всасываются из желудочно-кишечного тракта в кровь. Розмариновая кислота и лютеолин обладают активностью в отношении вирусов герпеса, гриппа, кори и болезни Ньюкастла [198, 302]. Исследования J. Ghosh et al. (2007) показали, что розмариновая кислота обладает высокой противовирусной активностью при инфицировании мышей JEV. Было установлено, что полифенольный комплекс «люромарин» обладает антиоксидантным, кардиопротекторным, противовоспалительным и гепатопротекторным действием [74, 117]. Авторы предполагают, что розмариновая кислота, лютеолин и его сульфатированные формы в составе комплекса «люромарин» вероятно выступают как лиганды PPAR (группа ядерных факторов транскрипции) и играют роль в уменьшении проявлений патологий, связанных с метаболическим синдромом [118, 402]. На основе этих соединений и их композиций предполагается создание новых БАД и лекарственных средств. В этой связи представляло интерес изучить активность этого комплексного соединения в отношении вируса КЭ. * * *
Таким образом, анализ литературных данных позволяет заключить, что, несмотря на значительное число исследований по взаимодействию флавивирусов с различными звеньями иммунной системы, механизмы модуляции этими вирусами гуморальных и клеточных факторов врожденного и адаптивного иммунитета исследованы недостаточно. Так, данные литературы о состоянии иммунной системы при манифестных формах КЭ фрагментарны, что не позволяет составить целостного представления о роли изменений функционирования иммунной системы организма в патогенезе формирования вирусной инфекции. Выявление прогностически значимых иммунопатогенетических маркеров риска, характеризующих тяжесть течения и исход заболевания, является мало разработанным разделом исследований. Практически полностью отсутствуют исследования, касающиеся состояния гуморального и клеточного врожденного иммунитета и цитокиновой системы на раннем этапе инфицирования вирусом КЭ и поиска иммунологических маркеров, характеризующих длительную персистенцию возбудителя в организме. Отсутствуют данные о проведении исследований по сравнительному изучению особенностей функционирования иммунной системы пациентов с КЭ в группах невакцинированных и вакцинированных против этой инфекции лиц. Следует подчеркнуть, что в литературе нет данных о клинически бессимптомных случаях КЭ инфекции, при которых заболевание было предотвращено анамнестическим иммунным ответом на основе предыдущей вакцинации. Между тем, изучение неудач вакцинации имеет большое значение для мониторинга и оценки воздействия иммунизации на организм, а также для оценки эффективности вакцины и для возможных изменений в рекомендуемых схемах вакцинации. Поскольку лечение пациентов с КЭ должно быть комплексным, включающим использование средств патогенетической терапии в сочетании с противовирусными и иммуномодулирующими препаратами, то поиск и применение новых препаратов природного происхождения представляется перспективным. Этим важнейшим вопросам посвящена настоящая работа, в которой при комплексном исследовании состояния иммунной системы пациентов с КЭ, сделан акцент на сравнительном изучении особенностей функционирования этой системы у невакцинированных и вакцинированных против этой инфекции лиц. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 4. Материалы и методы исследования Экспериментальные и клинико-лабораторные исследования проведены на базе лабораторий клещевого энцефалита и иммунологии ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН. Отдельные разделы работы выполнены в комплексе с лабораторией биотехнологии ФГБУН Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Центром по борьбе с клещевым энцефалитом в Приморском крае и инфекционным отделением краевой клинической больницы № 2. Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» СО РАМН (протокол №1от 03.02.2008 г).
В настоящей работе приведены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования пациентов с клещевым энцефалитом, наблюдавшихся в период 2008-2012 гг. Было обследовано 252 человека (141 мужчин и 111 женщин). Критериями включения пациентов в исследование явились: возраст от 18 до 60 лет, верифицированный диагноз клещевого энцефалита (инаппарантная, лихорадочная и очаговые формы) и отсутствие сопутствующих других клещевых инфекций. Критериями исключения пациентов из исследования были: системные инфекционные заболевания и обострения хронических воспалительных процессов другой этиологии, сахарный диабет, онкологические заболевания. Контрольную группу составили 25 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (14 мужчины и 11 женщин в возрасте от 20 до 55 лет). Диагнозы инаппарантной и манифестных форм клещевого энцефалита устанавливали на основании клинико-эпидемиологических данных и результатов специфического обследования (наличие антигена вируса и вирусспецифических антител классов IgM и IgG). Кроме того, все пациенты были обследованы на наличие иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ) путем выявления в ИФА антител классов IgM и IgG. Пациенты с диагнозом ИКБ не были включены в анализируемые нами группы больных. В зависимости от диагноза клещевого энцефалита обследованные пациенты были разделены на две группы: первую группу составили 185 пациентов без клинических проявлений заболевания, вторую – 67 больных с манифестными формами КЭ (рис.1). Обследование проводили до назначения специфической противовирусной и иммунокорригирующей терапии. А) Пациенты с антигенемией ВКЭ без клинических проявлений инфекции В обследование были включены 185 человек (91 мужчин и 94 женщин), у которых на 2 – 4 сутки после укуса клеща в крови был выявлен антиген вируса КЭ (рис.1). Обследованные лица, у которых на 2-4 сутки в крови был обнаружен антиген вируса КЭ, повторно обследованы через 1 месяц и при необходимости через 6 и более месяцев. Пациенты, у которых через 1 месяц антиген ВКЭ не обнаруживали, были отнесены к I группе (лица с кратковременной антигенемией). Ко II группе были отнесены пациенты с длительным (более 6 месяцев) бессимптомным носительством антигена вируса (лица с длительной антигенемией). Все обследованные пациенты в этих группах подразделялись на непривитых и привитых против КЭ. Невакцинированные лица с жалобами на укус клеща после обнаружения специфического антигена получали однократно профилактическую дозу (1мл/10 кг массы тела) противоклещевого иммуноглобулина согласно санитарно–эпидемиологическим правилам «Профилактика клещевого вирусного энцефалита» [135], вакцинированным лицам противоклещевой Вакц. (n=0) Невакц.(n=6) Вакц. (n=17) Вакц. (n=11) Вакц. (n=51) Вакц. (n=0) Невакц.(n=16) Невакц.(n=28) Невакц. (n=30) Пациенты с очаг.формами (летал.исход) (n=6) Пациенты с очаг.формами (благ.исход) (n=16) Пациенты с лихорад. формой (n=45) Невакц. (n=93) Пациенты с длител. антигенемией (n=44) Пациенты с кратковрем. антигенемией (n=144) Пациенты с клещевым энцефалитом (n=252) Пациенты с манифестными формами КЭ (n=67) Пациенты с антигенемией ВКЭ (без клинических проявлений) (n=185) Рисунок 1. Группы пациентов с клещевым энцефалитом, включенные в обследование иммуноглобулин не вводили. Венозную кровь для иммунологических и вирусологических исследований забирали дважды: первый раз - на 2 – 4 сутки после укуса клеща, до введения противоклещевого иммуноглобулина и второй раз - через месяц. Б) Пациенты с манифестными формами КЭ Было обследовано 67 пациентов (50 мужчин и 17 женщин), находившихся на стационарном лечении в больницах Приморского края, с манифестными (лихорадочной и очаговыми) формами КЭ (рис.1). Диагноз клещевого энцефалита (рубрика А 84.0 по МКБ 10) в остром периоде заболевания (3–9 сутки) верифицировали на основании данных оценки неврологического статуса, определения уровня вирусспецифических антител класса IgM и IgG. Выделено 3 группы: 1 группа – пациенты с лихорадочной формой КЭ средней тяжести (невакцинированные и вакцинированные против КЭ), 2 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ с благоприятным исходом, 3 группа – пациенты с очаговыми формами КЭ с летальным исходом. Для иммунологических и вирусологических исследований использовали венозную кровь пациентов, взятую в острый период (первая неделя) заболевания. 4.1.2 Характеристика лабораторных животных Экспериментальные исследования выполнены на 480 мышах линии BALB/c (гаплотип Н-2d), а также на 1660 неинбредных мышах, полученных из питомника РАМН “Столбовая”, находившихся на стандартной диете в боксированных помещениях. Возраст животных-самцов составил 2-3 месяца, масса 10-12 г. Протокол экспериментальной части исследования на этапах содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта соответствовал принципам биологической этики, изложенным в международных и российских нормативных документах по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [122, 270]. Работа одобрена Этическим комитетом ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии» СО РАМН (протокол № 5 от 05.11.2007 г.).
Для изучения взаимодействия штаммов вируса КЭ с иммунокомпетентными клетками и для исследования противовирусной активности препаратов были использованы региональные (дальневосточные) штаммы вируса КЭ - Dal´negorsk (Dal), Kiparis-94 (Kip-94), Primorye-196 (P-196), изолированные сотрудниками лаборатории клещевого энцефалита НИИЭМ СО РАМН из разных источников в разных районах Приморского края. Штамм Dal был выделен из мозга умершего больного с очаговой формой КЭ в высокоэндемичном Дальнереченском районе Приморского края в 1973 г. Штамм Kip-94 изолирован из лейкоцитов крови больного с лихорадочной формой КЭ, заражение которого произошло в Надеждинском районе края в 1997 году. Штамм P-196 выделен из лейкоцитов крови человека с инаппарантной формой КЭ, инфицирование которого произошло на территории бухты Лазурной Приморского края. В работе использованы 5-6 пассажи этих штаммов вируса КЭ на мышах двухсуточного возраста.
Титрование штаммов, реакцию нейтрализации и определение противовирусной активности препаратов in vitro проводили на перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ). В качестве среды роста клеток использовали среду 199 с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота и 100 ЕД/мл гентамицина. В качестве поддерживающей среды для клеточной культуры использовали ту же самую смесь, но с добавлением 1% сыворотки и гентамицина. 4.1.5. Исследуемые препараты Изучена противовирусная активность люромарина и тинростима - биополимеров из морских гидробионтов, обладающих высокой биологической, в том числе, иммуномодулирующей активностью. Выделение, изучение химического состава и структуры биополимеров из морских гидробионтов проведены в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (люромарин) и ФГУП Тихоокеанском рыбохозяйственном научном центре (тинростим) с применением современных методов. Люромарин - полифенольный комплекс, выделенный из морских трав семейства Zosteraceae (Zostera marina и Zostera asiatica) А.М. Поповым с соавт.[74, 107, 117], содержит розмариновую кислоту (45%), дисульфат лютеолина (45%) и лютеолин (10%). Метод выделения – экстракция морских трав семейства Zosteraceae 96% этиловым спиртом и очистка целевого продукта на гидрофобном сорбенте [74, 107]. Тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара Berritiuthis magister Л.М. Эпштейном с соавт. [106], содержит 84% низкомолекулярных пептидов молекулярной массой от 1 до 12,5 кДа и >16% свободных аминокислот, представленных, в основном, аспарагиновой, глутаминовой кислотой и лизином. Около 10% от общего количества свободных аминокислот составляет таурин [106]. Пептидные компоненты представлены несколькими пептидными фракциями, состоящими из 17 аминокислот с преобладанием аспарагиновой и глутаминовой кислот (их сумма составляет 37,5% общего количества аминокислот). Метод выделения - экстракция водорастворимых пептидов в слабокислых растворах с последующим извлечением их с использованием ступенчатой ультрафильтрации, позволяющей разделять и концентрировать пептидные компоненты в зависимости от молекулярной массы [106]. Для сравнительной оценки эффективности люромарина и тинростима в отношении вируса КЭ были использованы официнальные препараты, применяемые в клинике для лечения КЭ: - рибавирин – синтетический аналог нуклеозидов (ЗАО «Вертекс», Санкт-Петербург); - противоклещевой иммуноглобулин – антитела против клещевого энцефалита класса IgG, титры не менее 1:80 (НПО «Микроген», Хабаровск); - реаферон-ЕС – рекомбинантный альфа-2b-интерферон (ЗАО «Вектор-Медика», Новосибирск); - циклоферон - метилглюкамина акридонацетат (ООО НТФФ «Полисан», Санкт-Петербург); - 4-йодантипирин - 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон (ООО «НТМ», Томск). 4.2.Методы исследований Все направления, методы и объем проведенных исследований представлены в таблице 1. Таблица 1 Направления, методы и объем исследований
I. Верифицирование диагноза КЭ 4.2.1 Выявление антигена вируса КЭ в крови пациентов с ВКЭ Для выявления антигена вируса КЭ в лейкоцитах крови использовали экспресс-диагностику КЭ [105] при помощи иммуноферментной тест-системы производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Учет результатов проводили по уровню оптической плотности (ОП), измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). Уровень антигенемии оценивали по показателю коэффициента (К): К = ОП исследуемой пробы / ОП контроля. 4.2.2 Определение вирусспецифических антител класса IgG и IgM в сыворотке крови пациентов с ВКЭ Вирусспецифические антитела класса IgG и IgM определяли в сыворотке крови обследованных лиц методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «ВектоВКЭ-IgG» и «ВектоВКЭ-IgM» («Вектор-Бест», Новосибирск). Постановку реакции проводили согласно инструкции к наборам. Учет результатов проводили по оптической плотности на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Зависимость ОП от концентрации антител IgG к вирусу КЭ определяли путем построения калибровочной кривой и выражали в титрах. Для интерпретации результатов исследования содержания антител IgM к вирусу КЭ использовали коэффициент позитивности (КП): КП = ОП исследуемой пробы / ОП крит. ОП крит.=ОП ср.К- +0,2, где ОП ср.К - среднее значение оптической плотности в лунках с отрицательным контрольным образцом .
Для определения авидности антител класса IgG в сыворотке крови обследуемых лиц применяли модифицированный вариант ИФА, выполняемый на серийно выпускаемых тест-системах «ВектоВКЭ - IgG», производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Модификация иммуноанализа заключалась в следующем: пробы сыворотки, разведенные 1:100, помещали в дубликатах в лунки стрипов с иммобилизованными антигенами. После инкубации при 37°С в течение 1 ч планшеты отмывали пятикратно раствором фосфатно-солевого буфера (рН 7,2), содержащего 0,1% Tween 20 (ФСБ-Т). Затем половину лунок заполняли ФСБ-Т, а другую - раствором детергента. В качестве денатурирующего агента использовали раствор мочевины с концентрацией 8 моль/л в ФСБ-Т. Через 15 мин планшеты двукратно отмывали раствором ФСБ-Т и далее анализ проводили в соответствии с инструкцией к тест-системе [58]. Индекс авидности (ИА) антител в пробах сыворотки крови рассчитывали для положительных проб как отношение величины ОП образца, полученной при проведении анализа с добавлением раствора денатурирующего агента (ОПмоч), к величине ОП, полученной без его добавления (ОПбез моч) и выражали в %: ИА = ОПмоч х 100% / ОПбез моч Значения ИА 50% и более указывали на то, что в сыворотках крови содержатся авидные антитела, менее 50% - неавидные антитела [58].
Реакцию нейтрализации на перевиваемой культуре клеток СПЭВ использовали для определения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови обследованных. Учет результатов проводили по цитопатическому эффекту [25]. Для постановки реакции готовили двукратные разведения предварительно прогретых до 56°С исследуемых сывороток крови, а также выбирали рабочую дозу регионального штамма Dal вируса КЭ, содержащую 2 lg ТЦД50 вирусной суспензии. Затем соединяли равные объемы каждого разведения исследуемой сыворотки и рабочей дозы вируса КЭ и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. После чего этой смесью заражали суточный монослой клеток СПЭВ в культуральных 24-хлуночных планшетах. Для контроля выбранной дозы вируса КЭ, в отдельные лунки планшета с культурой клеток СПЭВ вносили только рабочие разведения вируса. В дальнейшем из лунок удаляли смесь, которой заражали культуру клеток и добавляли среду поддержки. После этого планшеты инкубировали в СО2- инкубаторе при 37°С 5-7 дней под контролем цитопатического действия вируса. За титр нейтрализующих антител принимали предельное разведение сыворотки крови, которое подавляло цитопатогенное действие вируса на 50%, по сравнению с контролем вируса. II. Общеклинические методы исследования 4.2.5 Общий клинический анализ крови Определение общего количества лейкоцитов и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [147]. Для оценки степени интоксикации и в качестве косвенного признака состояния иммунной системы использовали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ), который рассчитывали по показателям клинического анализа крови по формуле: ЛИИ= (S+2P+4M) /(C+L)(E+1) [148], где обозначено количество: S-сегментоядерных нейтрофилов, Р-палочкоядерных нейтрофилов, М-миелоцитов, С-моноцитов, L-лимфоцитов, Е-эозинофилов. Показатели ЛИИ оценивали следующим образом: от 0,5 до 2,0 усл. ед. - удовлетворительная функция; от 2,1 до 7,0 усл. ед. - компенсированная недостаточность; от 7,1 до 12,0 усл. ед. - декомпенсированная недостаточность [148].
Определение популяционного и субпопуляционного спектра лимфоцитов крови обследованных пациентов, а также исследование экспрессии адгезионных и активационных маркеров на поверхности иммунокомпетентных клеток в пробах крови, инфицированной ex vivo штаммами ВКЭ, проводили с использованием моноклональных антител (мАТ) против соответствующих антигенов [124, 431]. Оценку уровня экспрессии мембранных молекул осуществляли стандартным методом двух- или трехцветного иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови с использованием коммерческих лизирующего/фиксирующего (FACS Lysing Solution, Becton Dickinson) и оптимизированного фосфатно-солевого буфера для клеток крови (CellWash, Becton Dickinson) и панели мАТ (Beckman Coulter) согласно инструкции производителя. В настоящей работе были использованы следующие мАТ к молекулам CD45-FITC/CD14-PE, CD3-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC, CD14-FITC, CD56-FITC, CD19-PE, CD(16+56)-PE, CD4-PE, CD8-PE, CD11b-PE, CD54-PE, CD69-PE, CD25-PE, CD95-PE, HLA-DR-PE, CD3-PC5 и соответствующие изотипические контроли. Цитофлюорометрию осуществляли на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), при этом в каждой пробе анализировали не менее 10000 клеток. Гейтирование субпопуляций гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, NK-клеток – с помощью трехцветного анализа по параметрам CD16 или CD56 в зоне CD3-негативных лимфоцитов. Данные анализировали, используя программное обеспечение CellQuest Pro (Becton Dickinson) (рис.2). 
Рисунок 2. Распределение основных популяций лейкоцитов периферической крови по параметрам прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания. R1 - популяция лимфоцитов; R2 - популяция гранулоцитов; R3 - популяция моноцитов. Результаты анализа представлены как процент лимфоцитов или моноцитов, экспрессирующих исследуемые маркеры. Данные, характеризующие экспрессию CD11b, CD54 и CD69 на клетках, представлены в виде средней интенсивности флюоресценции популяции клеток (MFI), отражающей количество (плотность) рецепторов на клетке. 4.2.7 Определение основных классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (IgG, IgM, IgA) Исследование уровня IgG, IgM, IgA в сыворотке крови пациентов, инфицированных вирусом КЭ, проводили методом радиальной иммунодиффузии [182]. Для достижения сопоставимости результатов, определение уровня иммуноглобулинов проводили одновременно. Гепаринизированную венозную кровь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут, сыворотку отбирали, замораживали и хранили до использования при - 20°С. 4.2.8 Исследование концентрации подклассов иммуноглобулина IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) в сыворотке крови Уровень подклассов иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 определяли в сыворотке крови обследованных пациентов методом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «Подклассы IgG» («Вектор-Бест», Новосибирск). Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). 4.2.9. Исследование концентрации ЦИК в сыворотке крови Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови пациентов, инфицированных вирусом КЭ, определяли методом селективной преципитации 3,75% раствором полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ-6000) (Panreac sintesis, Испания) с последующим спектрофотометрическим измерением оптической плотности полученного преципитата в опытном и контрольном образцах [28]. Оптическую плотность образцов определяли на спектрофотометре (СФ-26, Россия) при длине волны 450 нм. Разницу в оптической плотности опытной и контрольной проб, умноженную на 1000, считали показателем уровня ЦИК и выражали в условных единицах (усл. ед.). 4.2.10 Определение размеров ЦИК в сыворотке крови Способ заключается в использовании растворов ПЭГ-6000 разной концентрации для преципитации иммунных комплексов различной молекулярной массы [143]. Сыворотки крови обследуемых пациентов смешивали с 3% и 4% растворами ПЭГ-6000, инкубировали 18 часов при 4°С, после чего центрифугировали 20 минут в режиме 6000 об/мин при 4°С. Осадок растворяли в 2 мл 0,1 М раствора NaOH. На спектрофотометре (СФ-26, Россия) определяли оптическую плотность полученных растворов при длине волны 280 нм. Размер ЦИК оценивали по коэффициенту К=С1/С2, где С1 и С2 – концентрации иммунных комплексов, выделенных при преципитации, соответственно, 4% и 3% ПЭГ-6000. Комплексы считали крупными при К<1,1, при 1,1 4.2.11 Исследование концентрации компонентов комплемента в сыворотке крови Количественное определение компонентов комплемента (C1-ингибитор, C3, С3а, C4, C5, С5а) в сыворотке крови обследованных лиц проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с прилагаемой к наборам инструкцией. Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). 4.2.12 Исследование концентрации цитокинов А) Определение концентрации цитокинов (IL-8, IL-1b, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6, IL-4, IL-10) в сыворотке крови обследованных пациентов, а также исследование уровня цитокинов (IL-8, TNFα, IFNα, IFNγ) в супернатантах культур мононуклеарных клеток проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) в соответствии с прилагаемой к наборам инструкцией. Б) Концентрацию цитокинов (TNFα, IL-6, IFNγ, IL-10) в сыворотке крови и супернатантах гомогенатов мозга мышей линии BALB/c определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем «R&D Systems» (США) согласно инструкциям производителя. Результаты регистрировали по уровню оптической плотности, измеряемой при 450 нм на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). Концентрацию цитокинов определяли путем построения калибровочной кривой и выражали в пикограммах на мл.
Для определения продукции цитокинов в культурах интактных и митоген-индуцированных клеток периферической крови обследованных пациентов, гепаринизированную венозную кровь разводили в 3 раза стерильной средой RPMI 1640, содержащей 3% L-глутамина (Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина. Подготовленные таким образом образцы крови культивировали в круглодонных, стерильных пробирках в присутствии конканавалина А (КонА, Sigma, в конечной концентрации 10 мкг/мл), а также в отсутствии митогенной стимуляции. Культивирование проводили при 37°С в CO2-инкубаторе в течение 48 часов, затем центрифугировали в течение 5 мин при 1000 об/мин, после чего отбирали супернатанты, замораживали и хранили до тестирования при -20°С [259]. Определение концентрации цитокинов (IL-8, IL-1b, IFNα, TNFα, IFNγ, IL-6, IL-4, IL-10) в супернатантах осуществляли с помощью диагностических наборов ООО «Цитокин» (Санкт-Петербург) методом твердофазного ИФА в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Учет результатов производили на фотометре для микропланшетов iMark (Bio-Rad, США). Концентрацию цитокинов определяли путем построения калибровочной кривой и выражали в пикограммах на мл. IV. Вирусологические исследования 4.2.14 Титрование вируса на культуре клеток СПЭВ Цитопатическую активность региональных штаммов вируса КЭ изучали при титровании вируса на культуре клеток СПЭВ. Инфекционную активность штаммов вируса КЭ определяли путем заражения монослоя перевиваемой культуры клеток СПЭВ. Готовили десятикратные разведения суспензии изучаемого штамма вируса КЭ на питательной среде, которыми заражали (по 0,1мл) монослой клеток в культуральных 24-хлуночных планшетах. После этого планшеты инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 ч. Затем удаляли вирус, а в лунки добавляли среду поддержки и инкубировали в термостате при 37°С 5-7 дней под контролем цитопатического действия вируса. За титр вируса принимали максимальное разведение вируса, при котором наблюдался цитопатический эффект и выражали в lg ТЦД50. 4.2.15 Титрование вируса КЭ на мышах Титры инфекционного вируса определяли на неинбредных мышах весом 6-8 г и мышах линии BALB/c весом 10-12 г. Для этого готовили десятикратные разведения вируссодержащего материала в среде 199 и заражали подкожно по 0,1 мл. Наблюдение за мышами проводили ежедневно, в течение 21 дня, регистрируя число павших животных. Титр вируса определяли по формуле L.J. Reed и Н. Muench (1938) и выражали в lg LD50. 4.2.16 Моделирование инфекции КЭ на мышах линии BALB/c Для моделирования инфекции мышей линии BALB/c весом 10-14 г заражали подкожно региональными штаммами вируса КЭ (Dal, Kip-94, P-196) в одинаковой инфицирующей дозе - 3 lg ТЦД50/0,2 мл. Животным контрольной группы вводили среду 199. Мышей, инфицированных штаммами вируса КЭ, разделяли на две подгруппы. Первые подгруппы (n=20 для каждого штамма) служили для контроля летальности, которую оценивали по % погибших животных и средней продолжительности жизни. Животных 2-х подгрупп (n=80 для каждой группы) использовали для получения образцов сыворотки крови и мозга. На 0, 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 21 сутки по 10 мышей, зараженных каждым из штаммов ВКЭ, умерщвляли, брали образцы мозга и крови, которые хранили при температуре - 80°С до использования. После размораживания половину каждого образца мозга гомогенизировали в 0,5мл раствора ФСБ (рН 7,2), центрифугировали 20 минут при 6000 об/мин, после чего отбирали супернатант. Образцы сыворотки крови и супернатанты гомогенатов мозга инфицированных мышей использовали для определения титров вируса КЭ (на культуре клеток СПЭВ) и для изучения динамики продукции цитокинов (в ИФА с использованием тест-систем «R&D Systems»). 4.2.17 Моделирование инфекции КЭ в пробах цельной крови доноров Свежую гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) здоровых доноров (n=10) заражали вирусом КЭ путем внесения в пробы цельной крови штаммов Dal и P-196 вируса КЭ в инфицирующей дозе 2 lg ТЦД50/0,1мл. В контрольных (без вируса) и опытных пробах, инкубированных в СО2-инкубаторе при 37°С, через 3, 6, 12 и 24 часа определяли накопление вируса в клетках и в супернатантах, а также оценивали экспрессию молекул адгезии и активации на поверхности клеток крови. 4.2.18 Моделирование инфекции КЭ в культуре мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови доноров проводили с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-верографина путем центрифугирования [160]. Цельную венозную гепаринизированную кровь (25 ЕД/мл) доноров (n=10) инкубировали 40-60 мин при 37°С для отделения плазмы от эритроцитов. Слой плазмы наслаивали на градиент плотности фиколл-верографина («Pharmacia», плотностью 1,077 г/см3) и центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Мононуклеарные клетки, образовавшие интерфазное кольцо, собирали и трехкратно отмывали питательной средой RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), последовательно ресуспендируя и центрифугируя по 10 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, а оставшийся осадок ресуспендировали в среде RPMI-1640. Жизнеспособность выделенных мононуклеарных лейкоцитов, которую оценивали по окрашиванию клеток 0,5% раствором трипанового синего («Serva», США), составляла более 95%. Инфицирование культуры мононуклеарных клеток. Мононуклеарные лейкоциты разводили до концентрации 2,0x106клеток/мл средой RPMI-1640 и инфицировали штаммами (Dal, Kip-94, Р-196) вируса КЭ в одинаковой дозе 2 lg ТЦД50/1х106 клеток. Клетки инкубировали с каждым штаммом вируса в течение 1 часа при 37°С, после чего мононуклеарные лейкоциты трехкратно отмывали средой RPMI-1640 и культивировали в полной питательной среде: RPMI-1640 («Serva») с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma»), 2 мМ L-глутамина («ПанЭко») и 80 мкг/мл гентамицина («Pharmacia»). Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37˚С в течение 5 сут. Для изучения динамики накопления штаммов вируса и продукции цитокинов в культуре мононуклеарных лейкоцитов, супернатанты отбирали на 3, 6, 12 час и 1, 2, 3, 4, 5 сут культивирования и хранили при температуре - 80°С до использования.
Для постановки НМФА в качестве антигенов использовали региональные штаммы Dal и P-196 вируса КЭ, которыми в дозе 2 lg ТЦД50/0,1мл заражали пробы цельной крови, полученной от здоровых доноров (n=10). Инфицированные пробы крови инкубировали в CO2-инкубаторе при 37°С в течение 3, 6, 12, 24 часов, после чего из этих инфицированных клеток готовили слайды с последующей фиксацией клеток охлажденным ацетоном в течение 20 мин. Затем на клетки слайдов наносили в двукратных разведениях человеческую сыворотку, содержащую антитела класса IgG к вирусу КЭ в титре 1:800. Слайды инкубировали во влажной камере 1 час при 37°С, затем отмывали рабочим раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (рН 7,2) в течение 10 мин и высушивали при комнатной температуре. Затем на препараты наносили антивидовые флуоресцирующие иммуноглобулины против иммуноглобулинов человека («Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва). Препараты вновь инкубировали во влажной камере в течение 1 часа при 37°С, промывали рабочим раствором ФСБ (рН7,2) и просматривали в люминесцентном микроскопе. По конечному разведению сыворотки (титру сыворотки), при котором наблюдалось специфическое свечение антигена в клетках, судили о динамике накопления антигена ВКЭ в клетках донорской крови [25]. V. Исследование противовирусной активности препаратов 4.2.20 Определение противовирусной активности препаратов в культуре клеток СПЭВ Выявление противовирусной активности исследуемых препаратов в отношении вируса КЭ в опытах in vitro проводили на перевиваемой линии клеток почек эмбрионов свиней (СПЭВ). Клетки культивировали в 24-луночных пластиковых панелях со средой 199, 10% сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл гентамицина. Поддерживающая среда содержала 1% эмбриональной сыворотки. Для оценки цитотоксичности препаратов использовали односуточный монослой культуры клеток СПЭВ. Ростовую среду удаляли, после чего вносили свежую поддерживающую среду, содержащую различные концентрации исследуемых препаратов. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе в течение 5 суток при 37°С. Результаты регистрировали по появлению цитодеструктивных изменений монослоя клеток. Контролем являлся монослой клеток, в который была внесена поддерживающая среда без препарата. В качестве показателя токсичности каждого препарата для данной культуры клеток служила максимально переносимая концентрация (МПК), которая составляет ½ максимальной концентрации препарата, не оказывающей на клетки токсичного действия (по данным прижизненного морфологического исследования и нарушения поглощения клетками витального красителя) [134]. Для определения противовирусного действия препаратов монослой культуры клеток инфицировали 10-кратными разведениями штамма Dal вируса КЭ с инфекционным титром 107 ТЦД50/0,2 мл. Исследуемые препараты в различных концентрациях (опыт) или разводящую среду (контроль) вносили через 1 час после инфицирования клеток вирусом и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5 суток. Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по соотношению инфекционной активности вируса в опытных и контрольных образцах. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vitro, являлись следующие общепринятые показатели [134]: снижение инфекционного титра вируса под воздействием препарата (∆, lg); коэффициент ингибирования (Ки, %) и химиотерапевтический индекс (ХТИ). Снижение уровня накопления вируса под влиянием препарата (∆, lg) определяли по формуле: ∆ = Ак – Ао, где Ак – уровень накопления вируса при культивировании без внесения в питательную среду изучаемого препарата (lg ТЦД 50/мл); Ао - уровень накопления вируса при культивировании с внесением в питательную среду изучаемого препарата (lg ТЦД50/мл). Коэффициент ингибирования (КИ,%) рассчитывают по формуле: Ки = (Ак – Ао)/Ак •100%. За величину ХТИ принимали соотношение максимально переносимой концентрации (МПК) к минимально эффективной вирусингибирующей концентрации (МЭК) – концентрация препарата, снижающая титр вируса не менее чем на 2 lg ТЦИД50 [134]. 4.2.21 Определение протективной активности препаратов при экспериментальной инфекции, вызываемой вирусом КЭ у мышей Для моделирования экспериментального КЭ использовали неинбредных мышей массой 10-12 г, которых инфицировали штаммом Dal вируса КЭ подкожно в дозе 100 LD50/0,2 мл. Животные получали исследуемые препараты через 1 час после заражения вирусом. В качестве контролей служила группа инфицированных вирусом КЭ мышей, не получавших препараты. Наблюдали за животными 21 день. Основными критериями оценки эффективности препаратов in vivo являлись [134] показатели летальности (отношение павших животных к общему количеству мышей в группе, в %) и средней продолжительности жизни (СПЖ) животных в группе (в сутках). Среднюю продолжительность жизни животных определяли методом Мейнелл [8]: СПЖ = N/∑[ni/i], где N - общее количество экспериментальных животных, ni - количество животных погибших в i-тые сутки, где i = [1; ∞].
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ «Statistica-6» и «Exсel» [23, 27]. Использовались следующие методы статистического анализа: проверка нормальности распределения количественных признаков в группах с использованием W-критерия Шапиро-Уилка. При нормальном распределении количественных признаков для оценки значимости различий использовали t-критерий Стьюдента (для независимых выборок). Для оценки значимости различий количественных признаков при распределении, отличающемся от нормального, использовали критерий Манна-Уитни (U) для несвязанных между собой вариационных рядов; критерий Вилкоксона для связанных выборок. С целью выявления особенностей уровня антигенемии у инфицированных пациентов использовали метод многомерной статистики (кластерный анализ методом Варда). Для сравнения выживаемости животных двух групп применяли логранговый критерий z (с поправкой Йетса), характеризующий значимость различий. Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: средняя арифметическая (М), стандартное отклонение (σ), медиана (Me), интерквартильный размах (LQ-UQ), объем анализируемой подгруппы (n), достигнутый уровень значимости (р). Уровень доверительной вероятности был задан равным 95%.
Каталог: sites -> 4fc2ad8be2e7980003000004 -> assets sites -> Мобильный телефон стал неотъемлемым атрибутом повседневной жизни человека, удобно устроившись в нашем кармане или сумочке. Он приносит нам множество возможностей, невообразимых ещё каких-то десять лет назад sites -> Хроническая сердечная недостаточность и депрессия у лиц пожилого возраста sites -> Ирвин Ялом Лечение от любви и другие психотерапевтические новеллы sites -> Оценка элементного статуса в определении нутриентной обеспеченности организма. Значение нарушений элементного статуса при различной патологии sites -> Проблема безопасности продуктов питания Скачать 2.16 Mb. Поделитесь с Вашими друзьями:
|