Глава 7. Особенности взаимодействия дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита с клетками иммунной системы

В настоящее время большое внимание исследователей в области молекулярной биологии флавивирусов, и в том числе вируса КЭ, уделяется поиску связи между мутациями в геноме вирусов и тяжестью заболевания [4, 5, 360, 376]. На протяжении двух последних десятилетий в НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН и Лимнологическом институте СО РАН под руководством Г.Н. Леоновой и С.И.Беликова проводятся исследования по изучению свойств штаммов вируса КЭ с различной молекулярно-генетической характеристикой. Было выполнено полногеномное секвенирование 35 штаммов вируса КЭ, изолированных от людей с различными формами заболевания. Установлено, что все штаммы вируса, независимо от тяжести заболевания, вызванного ими, принадлежат к дальневосточному субтипу вируса КЭ [5, 13]. По результатам полногеномного секвенирования штаммов ВКЭ было построено филогенетическое древо, на котором исследуемые штаммы сформировали три кластера (I - Oshima-, II – Sofjin-, III – Senzhang-подобные штаммы) [19].

Для выполнения дальнейших исследований мы целенаправленно выбрали из каждого кластера филогенетического древа по одному штамму (табл.12). Штамм Dal'negorsk (Dal), выделенный из мозга умершего с очаговой формой КЭ, относится к группе Sofjin-подобных штаммов. Штамм Kiparis-94 (К-94), изолированный из крови пациента с лихорадочной формой КЭ, расположился в группе Oshima-подобных штаммов. А штамм Primorye-196 (P-196), изолированный из крови пациента с инаппарантной формой КЭ, находится в группе Senzhang-подобных штаммов.

Целью настоящего раздела исследований явилось изучение влияния штаммов ВКЭ с различной биологической и молекулярно-генетической характеристикой на функциональную активность иммунокомпетентных клеток.

Таблица 12

Характеристика штаммов вируса КЭ, изолированных от пациентов

с разными формами КЭ

№

Штаммы

Форма заболевания КЭ

Материализоляции

Номер в GeneBank

Титр вируса на СПЭВ (lgТЦД50)

Титр вируса на неинбредных мышах при п/к заражении (lgLD50 в 1 мл)

1

Dal'negorsk (Dal)

очаговая

Мозг умершего больного

FJ402886

9,0

9,5

2

Kiparis-94 (К-94)

лихорадочная

кровь

JQ825146

6,0

8,7

3

Primorye-196 (P-196)

инаппарантная

кровь

JQ825155

5,0

3,7

Примечание: СПЭВ – перевиваемая культура клеток почек эмбриона свиньи; ТЦД₅₀ – 50% тканевая цитопатическая доза; LD₅₀ – 50% летальная доза.
7.1 Динамика экспрессии адгезионных и активационных маркеров на клетках крови ex vivo под влиянием штаммов вируса КЭ

В последние годы пристальное внимание уделяется изучению начальных этапов вирусной инфекции, в том числе, взаимодействию вируса с клетками врожденного и адаптивного иммунитета. Модуляция вирусом экспрессии мембраноассоциированных структур этих клеток вызывает изменение их функциональной активности, что, во многом, предопределяет дальнейшее течение и исход инфекционного процесса.

Следует отметить, что в данном разделе работы исследование взаимодействия штаммов вируса с иммунокомпетентными клетками проводилось на модели цельной крови здоровых доноров ex vivo. Использование цельной крови не требует выделения и подготовки клеток к культивированию, что устраняет неспецифическую активацию клеток на этапах сепарации, и при этом сохраняется существующий in vivo баланс различных типов клеток крови. Следовательно, оценка экспрессии адгезионных и активационных маркеров на клетках цельной крови способствует максимальному отражению процессов, происходящих in vivo.

В настоящих исследованиях были использованы два штамма ВКЭ (Dal и P-196), которые в дозе 2 lg ТЦД₅₀/0,1мл вносили в пробы крови, полученной от здоровых доноров (n=10). В контрольных (без вируса) и опытных пробах, инкубированных в СО₂-инкубаторе при 37⁰С, через 3 и 24 часа оценивали экспрессию молекул адгезии и активации на поверхности клеток крови, а также определяли накопление вируса в клетках и в супернатантах.

Первоначально проведено изучение накопления антигена этих штаммов вируса КЭ в пробах донорской крови. Внутриклеточное накопление вируса оценивали по антигенной активности штаммов к специфическим антителам вируса КЭ в реакции НМФА, а во внеклеточной жидкости – по цитопатическому действию (рис.8).

Рисунок 8. Динамика репликации штаммов вируса КЭ в пробах донорской крови (n=10 доноров): А) в лейкоцитах крови (в реакции НМФА; Б) в супернатантах клеток (титрование на культуре клеток СПЭВ). По оси абсцисс – время наблюдения в часах, по оси ординат: А) обратные титры антител; Б) титры вируса в lg ТЦД₅₀ .

Установлено, что динамика накопления вируса в клетках крови различается для штаммов ВКЭ (рис.8А). Так, к 24 часам после инфицирования штамм Dal, вызвавший очаговую форму инфекции, имел высокий показатель антигенной активности, его титр составил 1:80. К этому времени у штамма Р-196, вызвавшего инаппарантную форму КЭ, этот показатель был значимо ниже, его титр составил 1:20. Накопление штаммов вируса во внеклеточной среде имело противоположную динамику (рис.8Б). Штамм Dal во внеклеточном пространстве был выявлен только к 24 часам. В то же время титр штамма Р-196 в супернатантах клеток спустя 3 часа после заражения составлял 1,0±0,2 lg ТЦД_50, а к 12 часам увеличился до 2,0±0,3 lg ТЦД₅₀.

7.1.2 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию молекул адгезии и активационного маркера CD69 клетками врожденного иммунитета

На ранних этапах активации клеток врожденного иммунитета важную роль играют молекулы клеточной адгезии, опосредующие связывание клеток с внеклеточным матриксом или соседними клетками [210]. Среди молекул клеточной адгезии наиболее прямое отношение к межклеточным взаимодействиям в иммунных процессах, таких как клеточно-опосредованная цитотоксичность, фагоцитоз, хемотаксис и активация клеток, имеют интегрины и их рецепторы [440, 443].

Для объяснения механизмов начальной стадии активации клеток врожденного иммунитета под действием штаммов вируса КЭ было изучено их влияние на динамику экспрессии молекул CD11b, принадлежащих семейству β₂-интегринов, и их лигандов - CD54, относящихся к суперсемейству иммуноглобулинов.

Известно, что молекулы CD11b, конститутивно экспрессируются на моноцитах, гранулоцитах и NK-клетках [324, 486]. Проведенный нами цитометрический анализ экспрессии CD11b показал, что уже к 3-му часу инкубации клеток крови эти молекулы выявляются на поверхности 100% инфицированных и неинфицированных клеток. Однако уровень экспрессии рецептора CD11b на поверхности клеток, оцениваемый по значению средней интенсивности флюоресценции (MFI), был различным в опытных и контрольных пробах (табл.13). Наибольший эффект в изменении экспрессии CD11b на клетках врожденного иммунитета оказывал P-196 штамм ВКЭ. Интенсивность флюоресценции исследуемых молекул адгезии на моноцитах, гранулоцитах (к 3-му часу) и NK-клетках (к 24-му часу) при инкубации их со штаммом P-196 была значимо выше, чем на неинфицированных клетках (p≤0,05), и клетках, инфицированных штаммом Dal (p≤0,05). При культивировании клеток крови со штаммом Dal вируса КЭ через 24 часа было зарегистрировано снижение экспрессии CD11b на моноцитах (p=0,030), в то же время на гранулоцитах и NK-клетках интенсивность флюоресценции исследуемых адгезивных молекул значимо не отличалась от таковой на интактных клетках (p>0,05).

Другие исследуемые нами молекулы межклеточной адгезии - CD54 (ICAM-1) экспрессируются конститутивно на эндотелиальных клетках, а для их выраженной экспрессии на лейкоцитах периферической крови необходима активация клеток цитокинами – IL-1, IFNγ или TNFα [416]. В проведенных нами исследованиях максимальный уровень экспрессии CD54 на клетках крови отмечался через 24 часа инкубации (табл.13).

Максимальная интенсивность флюоресценции исследуемого маркера отмечалась в популяции моноцитарных и гранулоцитарных клеток. Штамм P-196 также увеличивал уровень экспрессии CD54 на моноцитах и гранулоцитах в 1,8 раза по сравнению с таковым на неинфицированных клетках (p≤0,05). В то же время при инфицировании клеток крови штаммом Dal выявлено значимое снижение интенсивности флюоресценции ICAM-1 на поверхности моноцитарных клеток (p=0,032), а на гранулоцитах и NK-клетках экспрессия CD54 была в пределах вариабельности значений в контрольных пробах.

Таблица 13

Динамика экспрессии адгезионных и активационных молекул на клетках

Молекула CD69 является самым ранним активационным антигеном, экспрессирующимся на поверхности лимфоцитов, моноцитов и NK-клеток в течение 1-2 часов после активации клеток [224, 279, 326, 374]. В то же время, Craston R. et al. (1997) показали, что динамика экспрессии CD69 во многом зависит как от типа клеток, на которых этот маркер экспрессируется, так и от типа стимуляции.

Нами установлено, что через 24 часа инкубации клеток крови со штаммом P-196 вируса КЭ уровень экспрессии CD69 на моноцитах и гранулоцитах увеличивался в 4,5 раза, а на NK-клетках в 7,5 раз по сравнению с таковым на неинфицированных клетках (p≤0,05) (табл.13). Инфицирование клеток крови штаммом Dal в эти же сроки выявило значимое снижение интенсивности флюоресценции CD69 на поверхности моноцитов и NK-клеток по сравнению с таковой на неинфицированных клетках (p≤0,05).

На рис.9 представлен пример распределения активационного маркера CD69 на моноцитах периферической крови доноров через 24 часа культивирования со штаммами ВКЭ.

7.1.3 Влияние штаммов вируса КЭ на экспрессию активационных молекул Т-лимфоцитами и NK-клетками периферической крови человека

Передача активационного сигнала, приводящего к активации лимфоцитов, состоит в развитии каскада реакций, завершающихся экспрессией различных генов и их рецепторов на поверхности клетки, так называемых активационных антигенов лимфоцитов. Описано несколько десятков активационных антигенов, экспрессирующихся на мембране лимфоцитов [156]. Наиболее часто в качестве маркеров активации исследуют CD69, CD25 и CD95, экспрессия которых характеризует прохождение определенного этапа клеточного цикла.

В проведенных нами исследованиях установлено, что через 3 часа инкубации клеток крови со штаммами вируса КЭ количество Т-лимфоцитов и

А Б В
Рисунок 9. Уровень экспрессии активационного маркера CD69 на поверхности моноцитов через 24 часа инкубации клеток крови со штаммами вируса КЭ.

NK-клеток, экспрессирующих CD69, не отличалось от показателей в контрольных пробах (p>0,05). После 24 часов инкубации клеток крови со штаммом вируса Р-196 выявили значимое увеличение экспрессии этого активационного маркера на NK-клетках и на субпопуляциях Т-лимфоцитов (CD4⁺, CD8⁺) и по сравнению с неинфицированными клетками (p≤0,05) (рис.10, рис.11А). Наиболее значимое повышение уровня CD69 зарегистрировано на NK-лимфоцитах. После инкубации клеток с Dal штаммом вируса экспрессия CD69 на поверхности NK-клеток и CD8⁺-Т-лимфоцитов была значимо снижена по сравнению с неинфицированными клетками (p≤0,05) (рис.10, рис.11А).

CD69 имеет прямое отношение к активации генов, ответственных за синтез IL-2, и сигналы, поступающие от CD69, вызывают увеличение продукции этого цитокина и количества рецепторов к нему на клетках - CD25 [374]. Экспрессия CD25 является обязательным этапом активации иммунной системы и признаком готовности лимфоцитов к вступлению в пролиферацию и дифференцировку. В свою очередь, величина экспрессии активационного маркера CD95 (Fas-антиген) отражает готовность лимфоцитов вступить в апоптоз. Взаимодействие Fas-рецептора клетки-мишени с Fas-лигандом, экспрессируемым цитотоксическими Т-лимфоцитами, запускает апоптотический механизм цитолиза клетки-мишени [350].

Мы зарегистрировали увеличение уровня экспрессии CD25 только на CD8⁺-Т-лимфоцитах и NK-клетках через 24 часа инкубации клеток крови с Р-196 штаммом вируса КЭ (рис.11Б). При этом доля NK-клеток, экспрессирующих CD25, увеличилась до 18,6±3,7% (контроль – 6,2±1,8%), а CD8⁺-лимфоцитов – до 9,3±2,1% (контроль – 3,0±0,9%). Можно предположить, что индукция вирусом экспрессии этого активационного маркера на CD8⁺-Т-лимфоцитах свидетельствует о готовности этих клеток вступить в пролиферацию, а повышение экспрессии на NK-клетках, вероятно, сопряжено с усилением их цитотоксической функции. К этому периоду наблюдения на клетках, инкубированных с Dal штаммом вируса, отмечалось значимое

Рисунок 10. Экспрессия активационного маркера CD69 на NK-клетках (CD3^-CD56⁺), CD3⁺CD8⁺-лимфоцитах, CD3⁺CD4⁺-лимфоцитах периферической крови доноров через 24 часа инкубации со штаммами вируса КЭ. Верхний ряд – неинфицированные клетки, средний – клетки, инфицированные штаммом P-196 ВКЭ, нижний – клетки, инфицированные штаммом Dal ВКЭ.

Исследование экспрессии активационного маркера CD95 на лимфоцитах показало, что через 24 часа его уровень повышен только на CD56-лимфоцитах, инкубированных с Р-196 штаммом вируса КЭ (рис.11В). Этот штамм вируса индуцировал 13,0±3,3% клеток, готовых вступить в апоптоз (в контроле – 6,1±1,8%). Инфицирование клеток штаммом Dal значимо снижало экспрессию CD95 на NK-клетках (p≤0,05).

Таким образом, в результате изучения влияния разных штаммов вируса КЭ на процесс ранней активации клеток крови выявлено их разнонаправленное действие на моноциты, гранулоциты, Т-лимфоциты и NK-клетки человека. Так, в течение 24 часов (исследуемый нами период времени) штамм Р-196, вызвавший инаппарантную форму КЭ, усиливал экспрессию молекул межклеточной адгезии и активационных молекул на мембранах клеток (рис.9, рис.10, рис.11), а штамм Dal – снижал экспрессию данных молекул (рис.9, рис.10, рис.11). Мы установили, что штамм Dal, являясь высоковирулентным для человека, активно размножается в клетках крови в течение первых 24 часов (рис.8А), но при этом наблюдается замедленный выход вирусных частиц во внеклеточное пространство (рис.8Б). Можно предположить, что аналогично другим высоковирулентным штаммам ВКЭ [466], активная репликация Dal штамма вируса КЭ происходит во внутриклеточных эндоплазматических компартментах, недоступных для PRRs. Это обусловливает задержку по времени индукции активации этих клеток, более поздний синтез биологически активных веществ, в том числе и IFN, что, в конечном итоге, позволяет вирусу более эффективно распространяться в организме.

В эти же сроки наблюдения (24 часа) другой штамм вируса КЭ – Р-196, являясь слабовирулентным для человека, характеризовался замедленным проникновением в клетки крови, невысоким уровнем накопления вируса в них