Глава 1. Клинико-патогенетическая характеристика клещевого энцефалита

Согласно последней таксономической классификации, род Flavivirus семейства Flaviviridae включает более 70 вирусов. Большинство представителей данного рода относят к группе арбовирусов, т.е. их жизненный цикл включает стадию репликации в организме кровососущих членистоногих. Около 40 флавивирусов передаётся через укусы комаров, 16 - укусы клещей, а для оставшихся представителей рода переносчик неизвестен [369]. Все вирусы данного семейства имеют схожие антигенные характеристики, но на основании типирования поликлональными гипериммунными сыворотками, среди флавивирусов выделяют 4 главных серокомплекса: Денге, клещевой энцефалит, жёлтая лихорадка и японский энцефалит [299]. Данные возбудители вызывают у человека широкий спектр заболеваний, включающий лихорадку, лихорадку с геморрагическими проявлениями и энцефалит. На сегодняшний день флавивирусы продолжают оставаться самыми значимыми для мирового здравоохранения возбудителями эмерджентных инфекций. В первую очередь это касается возбудителей лихорадки Денге (DENV), японского энцефалита (JEV) и жёлтой лихорадки (YFV). Другие представители флавивирусов, такие как вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и лихорадки Западного Нила (WNV), представляют проблему для эндемичных регионов.

Все флавивирусы имеют сходное строение вириона, организацию генома, стратегию репликации, но вызывают различную патологическую реакцию инфицированного организма [360].

Флавивирусы - небольшие оболочечные частицы сферической формы (40-60 нм), содержащие нуклеокапсид (25-30 нм). Нуклеокапсид состоит из множества копий капсидного белка С и молекулы РНК, окружён липидной мембраной, в которую включены два вирусных белка: маленький мембранный белок М и большой белок оболочки Е [360].

Геном флавивирусов представляет собой одноцепочечную молекулу РНК положительной полярности около 11 тыс. нуклеотидов [112, 371]. РНК содержит одну открытую рамку считывания, которую окружают с обеих сторон короткие нетранслируемые регионы: 5'- и 3' [454]. В геноме ближе к 5'-концу закодированы структурные белки, С, ргМ и Е, ближе к 3'-концу расположены гены неструктурных белков: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 [360].

Флавивирусы проникают в клетку-мишень после взаимодействия оболочечного белка Е c рецепторами клетки путем клатрин-опосредованного эндоцитоза [234]. Низкий уровень рН в эндосомах инициирует слияние вирусной и клеточной мембран, опосредованное структурной перестройкой белка Е, что приводит к выходу в цитоплазму нуклеокапсида с вирусной РНК [396]. В результате трансляции образуется полипротеин, который подвергается ко- и посттрансляционному процессингу, в котором участвуют вирусная NS2b-NS3 протеаза, а также протеаза клетки – сигналаза. Процессинг приводит к образованию структурных и неструктурных вирусных белков [275]. Сборка вирусных частиц происходит в просвете эндоплазматического ретикулума и дальнейшее созревание этих вирусных частиц происходит в сети транс-Гольджи, где предшественник белка М (prM) расщепляется фурином до зрелого белка М, что приводит к конформационной перестройке Е белка [458]. После реорганизации поверхности вириона зрелый инфекционный вирус выходит из клетки [235].

1.2.Клинико-патогенетические особенности клещевого энцефалита

До сих пор молекулярные основы патогенеза флавивирусных энцефалитов, в том числе и КЭ, остаются не полностью понятными. Все еще продолжают исследовать многие невыясненные аспекты флавивирусной репликации, инвазии этими вирусами центральной нервной системы (ЦНС) и характера иммунного ответа организма.

В то же время многообразные клинические проявления и течение КЭ достаточно полно описаны в классических руководствах по данному заболеванию как отечественными, так и зарубежными авторами [47, 114, 165, 286, 292]. КЭ может протекать в трех формах: острой (лихорадочная, менингеальная и очаговые формы), хронической и бессимптомной (инаппарантной). Наряду с этим, в комплексных клинико-эпидемиологических исследованиях рядом авторов [40, 73, 79, 262, 436, 467] было установлено, что в различных природных очагах клиника КЭ имеет свои отличительные особенности. При сравнительном анализе клинической картины, характера течения и исходов КЭ [101] в 3-х эндемичных зонах РФ (Дальний Восток, Восточная Сибирь и Северо-Западный регион), где доминируют штаммы ВКЭ разных генотипов (дальневосточный, сибирский и западноевропейский соответственно), отмечены существенные различия. Так, на территории Восточно-Сибирского региона, по сравнению с Дальневосточным регионом, заболевание характеризуется более мягким течением, меньшим числом осложнений и низкой летальностью (2,4% - в Приангарье и 24,4% - на Дальнем Востоке). На Северо-Западе РФ (Ленинградская область) преобладает менингеальная форма (60%), очаговые формы встречаются также часто (19%). В то же время такое генетическое распределение штаммов ВКЭ является достаточно условным, так как на разных территориях одновременно циркулируют варианты одного генотипа вируса с разной степенью патогенности, способные вызывать заболевания различной тяжести [109, 115, 141].

Современные представления о патогенезе КЭ складываются из результатов клинических наблюдений, данных аутопсии погибших больных и исследований с использованием различных лабораторных животных.

Основным путем инфицирования человека вирусом КЭ в естественных условиях является трансмиссивный путь при укусе клеща. При присасывании инфицированного клеща вирус проникает через кожу и размножается в месте укуса, прежде всего, в дендритных клетках. Генерализация инфекции происходит гематогенным и лимфогенным путями, а инвазия центральной нервной системы возможна разными путями (гематогенным, лимфогенным или нейрональным) [47, 319, 383, 387, 472].

Вирусемия при КЭ имеет двухволновый характер: кратковременная первичная, а затем (в конце инкубационного периода) повторная вирусемия, совпадающая по времени с размножением и накоплением вируса во внутренних органах с последующим проникновением его в ЦНС. Первичную вирусемию у людей выявляют уже на 1-3 сутки после укуса клеща [20, 77]. Однако такая вирусемия носит кратковременный характер и может закончиться на стадии размножения вируса в месте укуса или кратковременной первичной вирусемией, что в клинике будет соответствовать инаппарантной форме КЭ.

При лимфо- и гематогенном путях диссеминации вирус размножается в эндотелии кровеносных и лимфатических сосудов, лейкоцитах крови, клетках ретикулоэндотелиальной системы, печени, почек и селезёнки, что характеризует висцеральную фазу развития КЭ. Эта стадия является важным патогенетическим звеном КЭ, обеспечивающим широкую диссеминацию вируса в организме, с последующим проникновением его через гематоэнцефалический барьер в ЦНС и наступлением нейрональной фазы заболевания.

Несмотря на то, что ВКЭ является нейротропным вирусом, механизмы, лежащие в основе того, как вирус получает доступ к ЦНС, не полностью поняты. Существует несколько различных гипотез проникновения ВКЭ через ГЭБ: а) цитокин-опосредованный вход в ЦНС; б) теория ''троянского коня''; в) вход вируса в сосудистые эндотелиальные клетки капилляров головного мозга, трансцитоз, и освобождение вируса в паренхиму мозга [423, 465]. В случае цитокин-опосредованного входа вируса в ЦНС, цитокины TNFα и IL-6 усиливают проницаемость ГЭБ, что способствует проникновению вируса в ЦНС [252, 470]. Повышенные уровни TNFα в сыворотке крови больных КЭ наблюдаются уже с первой недели госпитализации [203]. В экспериментах на крысах и мышах было показано, что IL-6 усиливает проницаемость ГЭБ [392]. Так называемый механизм ''троянского коня'' основан на миграции клеток иммунной системы, инфицированных ВКЭ, (например, дендритные клетки, нейтрофилы, моноциты, макрофаги, Т-клетки) через ГЭБ в ЦНС, инициализации инфекции ВКЭ в тканях ЦНС [465]. Инфекция и репликация ВКЭ в эндотелиальных клетках или сосудистом сплетении и почкование вируса на паренхиматозной стороне представляют собой еще одно возможное объяснение. Кроме того, предполагается, что у пациентов с тяжелыми формами КЭ, проникновение через ГЭБ базируется на повышении в сыворотке крови уровня нейроспецифических белков, таких как α-1 мозговой глобулин или нейро-специфическая енолаза [73, 430].

Предполагается, что вторая волна вирусемии, сопровождающаяся поражением ЦНС, возникает только у 35% пациентов, у которых наблюдается экстраневральное размножение возбудителя [367]. Распространение вируса на этом этапе эффективно сдерживается развивающимся иммунным ответом: индукцией вирусспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и антител, в первую очередь к белку Е. Однако, тропизм вируса КЭ к лимфоидным органам и клеткам иммунной системы способен изменять характер иммунных реакций. Было показано, что тяжесть клинического течения КЭ коррелируют с глубиной и продолжительностью вирусиндуцированной депрессии клеточного иммунитета [65, 149], с длительной персистенцией вирусспецифических IgM, указывающих на нарушение эффекторных функций Т-лимфоцитов [163], а также с дисфункцией цитокинового звена иммунного ответа [46, 150].

Таким образом, для быстрого проникновения возбудителя в мозг и вовлечения в патологический процесс ЦНС с развитием очаговых форм КЭ основное значение имеют такие факторы, как вирулентность штаммов вируса, и вирус-индуцированный тип иммунного ответа организма. По последним данным Л.М. Сомовой (2010) выделено три клинико-морфологических варианта дальневосточного КЭ: 1) Остро протекающий КЭ, характеризующийся выраженными общемозговыми расстройствами, высокой летальностью в течение первой недели заболевания. Тяжелое быстрое повреждение нейронов имеет прямую связь с внутриклеточной репродукцией вируса и с преобладанием реакций ГНТ; 2) Наиболее типичным для очаговых форм КЭ, является замедленный темп развития изменений в ЦНС, характеризующийся иммунопатологической реакцией по типу ГЗТ; 3) лихорадочные и инаппарантные (бессимптомные) формы КЭ [109, 170].

Г.Н. Леонова с соавторами (2007) показали, что основную долю (до 70%) дальневосточной популяции вируса КЭ составляют ненейроинвазивные штаммы, большинство из которых обладают способностью к быстрой элиминации из организма, не вызывая манифестных форм инфекции. У большинства людей, из крови которых были выделены эти штаммы, регистрировали инаппарантную форму КЭ. В то же время, далеко не все ненейроинвазивные штаммы КЭ элиминировали, часть из них способна длительно сохраняться в организме и вызывать иммунопатологические состояния в условиях длительной антигенемии [15, 56]. Значительно меньшую долю вирусной популяции (до 30%) составляют нейроинвазивные штаммы. Такие штаммы, изолированные из крови людей, вызывают разные формы КЭ (инаппарантную, лихорадочную, очаговые). Г.Н. Леонова с соавторами (2007) полагают, что процентное соотношение нейроинвазивных и ненейроинвазивных штаммов на разных эндемичных территориях может различаться.

Следует отметить, что многолетние исследования в области молекулярной биологии флавивирусов, и в том числе вируса КЭ, показали связь между мутациями в геноме вирусов и тяжестью заболевания [360, 376]. На протяжении двух последних десятилетий в НИИЭМ СО РАМН и Лимнологическом институте СО РАН под руководством Г.Н. Леоновой и С.И.Беликова были проведены исследования нуклеотидных последовательностей полных геномов 35 штаммов дальневосточного субтипа вируса КЭ, обладающих разной вирулентностью для человека. При анализе полногеномных нуклеотидных последовательностей этих штаммов С.И. Беликов с соавт. (2007) сделали выводы о том, что существует связь между участками генома вируса КЭ и его вирулентностью. Таких потенциально важных участков предположительно четыре, и они локализованы в районах, кодирующих капсидный белок С, неструктурные белки NS1, NS3 и 3׳-нетранслируемый участок вирусной РНК.

Кроме того, филогенетический анализ штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа, выделенных от людей с различными клиническими формами заболевания на территории Приморского края, показал, что все они имели общего предка. При этом высокая вирулентность штаммов является предковым состоянием признака по отношению к штаммам с низкой вирулентностью [5, 13, 69]. Низковирулентные штаммы эволюционно появились позднее, чем высоковирулентные, и поэтому низкая вирулентность штаммов вируса КЭ является более прогрессивным признаком.

Однако свойства штаммов вирусов являются лишь одним из факторов, влияющих на тяжесть течения заболевания. Другими факторами являются генетические и иммунологические особенности пациентов, влияющие на взаимодействие с возбудителем. Так, поражение органов иммунной системы при КЭ является ведущим звеном патогенеза, обусловливающим клинический полиморфизм заболевания и исход патологического процесса.

Таким образом, современный прогресс в молекулярной биологии и вирусологии позволяет изучать взаимодействие вируса КЭ с организмом на всех трех уровнях: организменном, клеточном и молекулярном. При этом инфекционный процесс, обусловленный дальневосточным субтипом вируса КЭ, и особенности взаимодействия высоко- и низковирулентных штаммов этого субтипа вируса КЭ с клетками иммунной системы организма практически не изучены.


Глава 2. Современные представления о врожденных и адаптивных факторах иммунитета при флавивирусных инфекциях

2.1 Роль факторов врожденного иммунитета при флавивирусных инфекциях

К настоящему времени иммунная система позвоночных рассматривается во взаимосвязи двух систем – врожденного (естественного) и адаптивного (приобретенного) иммунитета [269], которые обеспечивают защиту организма от инфекции и способствуют элиминации трансформированных клеток хозяина [190]. Первой свои защитные реакции, реализует эволюционно более древняя система врожденного иммунитета. Индуктивная фаза этого иммунного ответа основана на распознавании различных, ассоциированных с патогенами молекулярных паттернов - PAMP (pathogen-associated molecular patterns). Распознавание PAMP с помощью наследственно закодированных рецепторов - паттернраспознающих рецепторов - PRRs (pattern-recognition receptors) приводит к активации клеток врожденного иммунитета [90, 339, 348, 378, 450]. Содержанием эффекторной фазы является осуществление защитных функций клетками (фагоцитоз, контактный цитолиз) и гуморальными системами (цитокины, комплемент). Активация врожденного звена иммунитета происходит в течение первых минут после инвазии инфекционного патогена, а максимум эффекторных реакций развивается в течение нескольких часов после инфицирования [7, 52, 174].

- Нейтрофилы

Нейтрофилы (Нф) являются преобладающей популяцией лейкоцитов крови, относящихся к числу самых реактивных клеток организма. Они одними из первых отвечают на повреждающие факторы и антигенную агрессию [390]. Нф характеризуются экспрессией на своей поверхности ряда молекул: CD13; CD14; β₂-интегринов (CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18); Fc-рецепторов (CD32 и CD16) и разнообразных PRRs. Функция Нф тесно связана с воспалительными каскадными реакциями: образования цитокинов, активации систем комплемента, свертывания крови и фибринолиза [9]. Сочетание высокого эффекторного потенциала со способностью к быстрой его реализации делает эти клетки оптимально приспособленными для осуществления ранних этапов иммунной защиты организма.

При флавивирусных инфекциях участие Нф в инфекционном процессе отмечалось многими авторами [47, 319, 346, 384]. Было показано, что разные флавивирусы (DENV, JEV, WNV, ВКЭ) на начальной стадии заболевания вызывают развитие лейкопении и нейтропении, впоследствии сменяющиеся лейкоцитозом и нейтрофилезом. При этом в экспериментах in vitro было установлено, что флавивирусы, в том числе и ВКЭ, не просто поглощаются лейкоцитами, но репродуцируются в них, накапливаются и выходят из клеток, что объясняет один из механизмов возникновения ранней вирусемии при этих инфекциях [77]. В то же время ряд авторов выявили, что Нф, инфицированные флавивирусами, продуцируют реактивные метаболиты кислорода («кислородный взрыв»), приводящие к апоптозу этих клеток [59, 248], что может быть одним из ранних защитных механизмов уничтожения вирусов. Наиболее ярко двухфазный ответ Нф при флавивирусных инфекциях был продемонстрирован в недавнем исследовании Bai F. et al. (2010) на примере инфекции, вызванной WNV. Авторами было показано, что истощение Нф (при введении антител к Нф) у мышей перед инфицированием WNV приводило к значительному снижению вирусной нагрузки и смертности животных. С другой стороны, снижение количества Нф после заражения приводило к более высокому уровню вирусемии и смертности. Следовательно, хотя Нф и служат резервуаром для репликации флавивирусов на ранних стадиях инфекции и, таким образом, усиливают ее, тем не менее, эти клетки проявляют высокую противовирусную активность на поздних стадиях инфекции, которая приводит к элиминации вируса. В совокупности эти данные указывают на сложную и ранее недооцененную роль Нф при флавивирусных инфекциях, требующую дальнейших исследований участия этих клеток в патогенезе различных клинических форм КЭ.

Моноциты (Мн) и макрофаги (Мф) образуют мононуклеарную фагоцитирующую систему, функциональные свойства которой настолько многообразны, что ее неполноценность, как следствие или причина патологического процесса, со временем неизбежно формирует системное поражение организма, сопровождающееся иммунологической недостаточностью [153]. Мн/Мф экспрессируют на плазматической мембране широкий спектр рецепторов, опосредующих их взаимодействие с другими клетками, внеклеточным матриксом и лигандами, различными патогенами. Для Мн/Мф характерна экспрессия CD14 – основного маркера этих клеток, разнообразие FcR (CD64, CD32 и CD16), молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II, молекул адгезии (β₁-и β₂-интегрины), PRRs. Основными PRRs для распознавания вирусов, в том числе и флавивирусов, являются, в первую очередь, мембранно-связанные TLR (TLR3, 7, 8 и 9), локализованные преимущественно в эндосомах клеток, а также цитоплазматические RIG-подобные рецепторы (RIG-1 и MDA-5) [31, 319, 348, 425].

В связи со значительными различиями свойств Мн/Мф и Нф физиологическая роль этих клеток практически не перекрывается, даже несмотря на то, что основная функция тех и других – фагоцитоз. Если Нф ответственны за самый ранний этап защиты, осуществляемый с помощью фагоцитоза (проходит интенсивно, но кратковременно), то Мн/Мф, помимо фагоцитоза (реализуется менее интенсивно и более продолжительно), выполняют многочисленные другие функции, в том числе, опосредованные секретируемыми ими различными биологически активными веществами. При активации Мн/Мф секретируют все провоспалительные цитокины и хемокины, интерфероны (в наибольшей степени IFNα, в наименьшей – IFNγ), компоненты комплемента и другие продукты [153, 174]. С помощью репертуара мембранных рецепторов, белков плазмы и секреторных молекул Мн/Мф регулируют как врожденный, так и адаптивный иммунитет.

В настоящее время различными исследователями определено, что многие вирусы способны инфицировать Мн/Мф. При использовании различных популяций Мн/Мф человека и животных еще в 80-е годы было доказано, что эти клетки являются мишенями для инфицирования флавивирусами [146, 295, 334]. Однако не все вирусы в одинаковой степени чувствительны к действию ферментных систем Мн/Мф. Одни легко инактивируются фагоцитами, а другие резистентны к действию Мф и способны к активной и нередко длительной персистенции в них. РНК-содержащие вирусы, в том числе и флавивирусы, преимущественно резистентны к действию Мф и способны к внутриклеточной репродукции в их цитоплазме [113]. Если размножающийся в Мф вирус обладает цитопатической активностью, то обычно развивается острая инфекция, которая может привести к летальному исходу. В тех случаях, когда вирус не вызывает деструкции Мф и других клеток хозяина, формируется персистентный тип инфекции. Однако персистенция вируса в Мф снижает функциональную активность клеток, что отмечалось у пациентов с хроническими формами КЭ [102].

Таким образом, Мн/Мф могут осуществлять защитную противовирусную функцию путем поглощения, обезвреживания и элиминации вирусов и инфицированных ими клеток. В то же время Мн/Мф могут выступать в роли своеобразного «троянского коня», так как при репродукции в них фагоцитированных вирусов происходит диссеминация вируса в различные органы [231, 386, 453]. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования для получения целостной картины, характеризующей изменения функциональной активности Мн/Мф в течении и исходе флавивирусных инфекций, в том числе и при КЭ.

- Естественные киллеры (NK-клетки)

Основными эффекторами в системе врожденного иммунитета являются миелоидные клетки, однако в реализации ее функций участвуют также и лимфоидные клетки – естественные киллеры или NK – клетки (natural killer), имеющие морфологию больших гранулярных лимфоцитов. Характерной особенностью NK-клеток, связанной с их цитолитической функцией, является наличие цитоплазматических азурофильных гранул, содержащих перфорины, гранзимы, протеогликаны и другие вещества. Другой характерной чертой NK-клеток является экспрессия на их поверхностной мембране молекул CD56 и CD16, с помощью которых в лабораторных условиях осуществляется идентификация NK-клеток. Кроме того, на NK-клетках также имеются молекулы адгезии (CD11a и CD11b) и целый ряд других рецепторов [157].

Наиболее важные функции NK-клеток – цитотоксическая активность в отношении трансформированных или инфицированных вирусами клеток организма, секреция цитокинов (в первую очередь IFNγ, а также TNFα и β, IL-10 и других). Кроме того, NK-клетки являются основными медиаторами антителозависимой клеточной цитотоксичности [7, 111].

Для осуществления цитотоксической функции NK-клеткам необходим контакт с инфицированными клетками, приводящий их к быстрой активации и мобилизации цитолитического потенциала. Решающую роль на начальном этапе взаимодействия NK-клеток с клетками-мишенями со стороны естественных киллеров играют β₂-интегрины, со стороны клетки-мишени - CD54 (ICAM-1), а также костимуляторные молекулы CD80/86 [187, 358]. В месте контакта формируется прочный иммунный синапс, который ведет к активации различных сигнальных путей NK-клеток. Результат такой активации – секреция NK-клетками предназначенных для цитолиза молекул или экспрессия мембранных индукторов клеточной гибели [354, 368].

Механизмы активации цитотоксической функции NK-клеток при вирусных инфекциях были изучены на примере цитомегаловирусной инфекции у мышей [258, 447]. Авторами было установлено, что в активации NK-клеток важная роль принадлежит цитокинам. В очаге инфекции содержащие вирус клетки, активированные Мф и дендритные клетки (DCs) синтезируют цитокины: IFNα/β, TNFα, IL-12, IL-15, активирующие NK-клетки. Главная роль в этом процессе принадлежит IFNα/β, который активирует STAT1-сигнальный путь, следствием чего является повышение цитотоксической активности естественных киллеров в отношении клеток, инфицированных различными вирусами. Кроме того, активация синтеза IL-15, являющегося ростовым фактором для NK-клеток, приводила к их быстрой пролиферации на ранней стадии инфекции [447].

Важность естественных киллеров в контроле над вирусной инфекцией лучше всего иллюстрирует огромное количество механизмов ингибирования вирусами активности NK-клеток. Эти механизмы включают: модулирование апоптоза, вмешательство в антителозависимую клеточную цитотоксичность, модуляцию продукции цитокинов и хемокинов и функций антигенпрезентирующих клеток; изменение экспрессии NK-клеточных рецепторов [315, 362, 483]. При флавивирусных инфекциях было показано [481], что на ранней стадии (2-4 сутки) после заражения мышей вирусами Лангат, WNV, ВКЭ наблюдалась стимуляция NK-клеточной цитотоксичности, а затем следовало подавление активности этих клеток. У пациентов с флавивирусными инфекциями, в том числе и при КЭ, было зарегистрировано раннее вовлечение в патологический процесс этого звена иммунной защиты [89, 265, 325]. Однако результаты, свидетельствующие об изменении активности естественных киллеров как в остром периоде КЭ, так и в условиях длительной вирусной антигенемии значительно варьируют у разных авторов [41, 149], что предполагает продолжение исследований в этом направлении.

NKT-клетки – субпопуляция Т-лимфоцитов, которой присущи фенотипические особенности как Т-клеток, так и NK-клеток. На своей поверхности NKT несут Т-клеточный рецептор (TCR-CD3) и маркеры NK-клеток (CD16, CD56, CD161) [139]. Особенностью NKT является экспрессия инвариантного TCR (Vα24JαQ, Vβ11), который распознает гликолипидный антиген в комплексе с неклассической молекулой MHC I класса - CD1d [381]. Следствием активации NKT-клеток является синтез про- и противовоспалительных цитокинов (в первую очередь IFNγ) и осуществление цитотоксической функции, которая реализуется через перфорин/гранзимовый или FasL-опосредованный механизмы [211, 479]. Благодаря своей способности быстро продуцировать достаточные количества различных цитокинов, эти клетки обеспечивают связь между врожденными и адаптивными звеньями иммунитета и играют важнейшую, возможно, уникальную роль в регуляции иммунного ответа при различных патологических состояниях [139].

Распределение в тканях человека NKT-клеток еще неясно, известно только, что эти клетки созревают в тимусе, в печени эти клетки составляют до 4% от лимфоцитов, небольшое их количество встречается в периферической крови - <1% [283]. Фенотипический анализ NKT в крови затрудняется их малой представленностью на периферии, что увеличивает вероятность ошибки. В этой связи в клинико-лабораторной диагностике предлагается оценивать популяцию клеток, наиболее близкую по своему фенотипу к NKT - (CD3⁺CD16⁺CD56⁺), которая содержит NKT-клетки и Т-клетки, экспрессирующие CD56 [157, 158]. У здорового человека эта популяция составляет до 10% от общего количества лимфоцитов.

В настоящее время накоплено мало данных о роли NKT-клеток при различных патологиях, в том числе и при флавивирусных инфекциях. Было показано, что при ХГС отмечается снижение NKT-клеток [189, 246], а повышение уровня CD3⁺CD16⁺56⁺ Т-киллеров в периферической крови у больных ХГС расценивается как неблагоприятный признак, отражающий прогрессирование патологического процесса с переходом в компенсированный цирроз печени [96]. У мышей, инфицированных DENV, было показано, что увеличение в селезенке количества NK- и NKT-клеток, как главных продуцентов IFNγ на ранней стадии инфекции, повышает устойчивость животных к инфекции [314]. В то же время другие авторы выявили, что мыши, дефицитные по NKT- клеткам (Jα18^-/-) и инфицированные DENV, были более устойчивы к летальной инфекции, чем животные дикого типа. Отсутствие NKT-клеток у Jα18^-/-инфицированных мышей приводило к снижению системного воспаления, меньшему повреждению печени, а также к снижению активации NK-клеток и Нф [177].

Таким образом, учитывая большой спектр возможностей NKT-клеток, можно полагать, что эти клетки выполняют как защитные, так и патологические функции в патогенезе флавивирусных инфекций. Противоречивые данные, полученные авторами, указывают на необходимость дальнейших исследований.

Кроме вышеуказанных клеток-мишеней для флавивирусов, в настоящее время активно изучаются и другие клетки врожденного иммунитета – DCs, эндотелиальные клетки [196, 319, 472]. Поскольку важной особенностью функционирования системы врожденного иммунитета является способность вовлекать в развитие реакций различные виды клеток, то, вероятно, репертуар предполагаемых клеток-мишеней для флавивирусов будет расширяться.

Первым этапом, определяющим возможность вирусной инфекции на уровне как клетки, так и ткани и организма в целом, является прикрепление (адсорбция) вирусных частиц к поверхности клеток-мишеней. Взаимодействие между молекулами, расположенными на поверхности вирионов и клеток, значительно различается по специфичности. Неспецифическая адсорбция обусловлена силами электростатического взаимодействия, возникающими между разнозаряженными группами молекул на поверхности клеток и вируса. Специфическая фаза адсорбции определяется комплементарным взаимодействием поверхностных структур вириона со специфическими молекулами (рецепторами) на поверхности клетки-мишени. Большинство рецепторов представлены молекулами, мигрирующими в плазматической мембране, что позволяет им формировать группы (кластеры) после связывания с вирусными частицами. После прикрепления к рецепторам для реализации последующих этапов инфекции вирусы используют сигнальную систему клетки хозяина, а кластеризация рецепторов способствует более эффективному проведению сигналов через плазматическую мембрану [140, 201, 285].

Промежуточную роль между неспецифической и специфической адсорбцией играет связывание вирусных частиц с факторами прикрепления (attachment factors), которые представляют собой, в основном, полисахаридные цепи мембранных гликопротеинов и гликолипидов. Факторы прикрепления способствуют концентрированию на поверхности клетки вирусных частиц, адсорбирующихся за счет взаимодействия положительно заряженных поверхностных вирионных белков и отрицательно заряженных полисахаридов [380].

Прикрепление к клетке-мишени многих вирусов происходит в несколько стадий с участием нескольких типов молекул, при этом молекулы, участвующие во второй и последующих стадиях специфического связывания называются корецепторами. Эти молекулы связывают вирионы, поверхность которых конформационно изменена в результате начального связывания с первичным рецептором [372].

Установлено, что вирусы, обладающие лимитированным тканевым тропизмом и ограниченным числом организмов-хозяев (вирусы Эпштейн-Барра, кори, полиовирус), используют узкий спектр молекул клеточной мембраны в качестве рецепторов. Вирусы с широким спектром патогенности, включающим разные виды животных (орто- и парамиксовирусы, вирус везикулярного стоматита, а также флавивирусы), могут прикрепляться к клеткам-мишеням, используя разнообразные молекулы [372, 494].

Поскольку представители рода Flavivirus, в основном, имеют нескольких хозяев - млекопитающих, птиц, членистоногих - то для прикрепления к клеткам-мишеням они должны использовать широко представленные и достаточно консервативные молекулы клеточной поверхности. К настоящему времени для этих вирусов были выявлены различные предполагаемые факторы прикрепления и/или рецепторы [274, 347].

Гликозаминогликаны (ГАГ) - линейные полисахаридные молекулы, которые экспрессируются на поверхности почти всех клеток млекопитающих, а также у организмов различных типов, таких как хордовые и членистоногие. Эти молекулы играют важную роль во взаимодействии клетки с внеклеточным матриксом, межклеточном проведении сигнала как рецепторы и корецепторы. Рядом авторов было показано, что высоко сульфатированные, отрицательно заряженные ГАГ, такие как гепаран сульфат, используются флавивирусами, в том числе и вирусом КЭ, как низкоаффинные факторы прикрепления [63, 188, 280, 418]. Взаимодействия флавивирусов с ГАГ опосредуются через все три домена белка Е вирусов и служат для концентрации вируса на клеточной поверхности. Кроме того, предполагается, что молекулы ГАГ в качестве корецепторов, возможно, отвечают и за проникновение вируса [280].

Интегрины – это одно из наиболее важных и полифункциональных семейств молекул межклеточной адгезии. Эти молекулы являются высоко консервативными трансмембранными протеинами, экспрессирующимися практически на всех видах клеток [312]. Интегрины соединяют внутреннюю и внешнюю среду клетки, проводя сигналы как изнутри клетки на ее поверхность, так и извне внутрь клетки [210]. Семейство интегринов делят на три основные подсемейства по типу β-субъединицы (β₁, β₂ и β₃). β₂-Интегрины (CD18, CD11a, CD11b, CD11c) участвуют в адгезии лейкоцитов к клеткам эндотелия. Интегрины могут быть рецепторами для целого ряда вирусов [212, 261], включая реовирусы (β₁-интегрины), эховирусы (α₂β₁), вирусы ящура (α_vβ₁, α_vβ₃ и α_vβ₆), хантавирусы (β₃), вирусы герпеса (α₃β₁), ротавирусы (α₂β₁, α_vβ₃), цитомегаловирусы (α₂β₁, α₆β₁, α_vβ₃). Рецепторной молекулой для вируса КЭ в человеческих клетках RH может являться α₃β₁-интегрин [128]. Другими авторами установлено участие интегрина α_vβ₃ для входа вирусов WNV, JEV, DNV в клетки позвоночных [159, 234]. Однако другая исследовательская группа показала, что связывание некоторых флавивирусов (JEV, Мюррей, WNV) с интегрином α_vβ₃ не играет важной роли для входа вируса в клетку [311, 427]. Из всего вышесказанного можно сделать вывод, что, вероятнее всего, интегрины являются одной из рецепторных молекул для флавивирусов на клетках млекопитающих.

Ламининсвязывающий белок (ЛСБ) относится к неинтегриновым клеточным рецепторам для ламинина, одного из основных белков базальной мембраны. Этот рецептор найден в культурах клеток насекомых, птиц, млекопитающих, что хорошо согласуется с тем, что флавивирусы, в том числе и ВКЭ, способны реплицироваться в различных клетках. Была показана эффективность блокирования репликации ряда вирусов (DENV, WNV, ВКЭ, ВВЭЛ, Синдбис) антителами к этому рецептору [64, 128, 464]. Высокая специфичность взаимодействия вирусов и ЛСБ открывает новые возможности для создания антивирусных препаратов, направленно блокирующих это рецепторное взаимодействие.

Основной маркер Мн/Мф – молекула CD14 служит рецептором для бактериального липополисахарида (ЛПС). Участие CD14 в инфекции, вызванной реcпираторным синцитиальным вирусом [401], дало возможность предположить, что эта молекула может быть более широко вовлечена в ответную реакцию организма, чем ранее считалось. Возможная роль CD14 была показана при инфицировании DENV человеческих Мн/Мф [232]. Добавление ЛПС перед заражением Мн/Мф ингибировало инфекцию, а введение человеческой сыворотки или анти-CD14 антител снимало супрессорный эффект ЛПС и инициировало вирусную инфекцию. Вероятно, CD14 сам по себе не управляет DENV инфекцией, но может быть вовлечен в ЛПС-опосредованное ингибирование проникновения вируса в эти клетки. Однако это утверждение достаточно спорно и требует дальнейших исследований.

- Fc- и С3-рецепторы

Было установлено, что ряд флавивирусов, в том числе и ВКЭ, способны использовать субнейтрализующие уровни вирусспецифических антител для прикрепления и входа в клетки, несущие рецепторы FcR и/или CR, с помощью процесса, известного как антитело-зависимое усиление (ADE) инфекции [169, 221, 296]. На сегодняшний день, как оказалось, DENV единственный из флавивирусов, для которого существуют убедительные доказательства ADE инфекции, как основного фактора этого тяжелого заболевания [289]. Было показано, что DENV проникает в Мн/Мф периферической крови в составе иммунного комплекса с существовавшими ранее не-нейтрализующими антителами (IgG), взаимодействуя с рецепторами Fcγ I, II и III типа, экспрессированными на этих клетках [327]. Установлено, что первичное инфицирование DENV повышает риск развития геморрагических симптомов при повторном заражении, по крайней мере, 15-кратно [415]. Также было показано, что презентированные на Мф рецепторы комплемента (CR3) отвечают за опосредованное IgM усиление репликации WNV [221].

Кроме того, были определены несколько других клеточных молекул, которые флавивирусы могут использовать в качестве рецепторов или факторов прикрепления [206, 274, 347]. К ним относятся белки теплового шока (HSP70 и HSP90), лектиновые рецепторы C-типа, такие как DC-SIGN (dendritic cell specific ICAM-3 grabbing nonintegrin, CD209) и маннозный рецептор (CD206), а также другие молекулы.

Таким образом, чувствительность клеток-мишеней к инфицированию флавивирусами характеризуется наличием на их поверхности, как специфических рецепторов, так и корецепторов и/или факторов прикрепления, что в конечном итоге, в значительной мере, определяет течение, многообразие клинических проявлений и исход заболевания.

Система комплемента – это семейство более чем 30 сывороточных белков и рецепторов клеточной поверхности, которые участвуют в распознавании патогенов и их клиренсе [76, 420]. Комплемент способствует защите организма через прямую опсонизацию и/или лизис клеток-мишеней, хемотаксис, клиренс иммунных комплексов и модуляцию В- и Т-клеточных функций [222]. Существуют три пути активации данной системы: альтернативный, классический и лектиновый, которые кардинально различаются особенностями начального этапа. Активация классического пути запускается связыванием C1q-компонента комплемента с комплексом антиген-антитело на поверхности патогенов. Лектиновый путь инициируется распознаванием маннан-связывающим лектином (MBL), принадлежащим к C-лектинам, углеводных структур на поверхности микробов или апоптотических клеток. Альтернативный путь является постоянно активным на низком уровне вследствие спонтанного гидролиза C3, и служит для усиления активации классического и лектинового путей. Общими признаками всех трех путей являются: а) активация С3 – самого важного и присутствующего в большом количестве компонента комплемента; б) каскадный тип протеолитической реакции, при котором активированные белки комплемента приобретают свойства ферментов и расщепляют другие компоненты, сообщая им ферментативные свойства и т.д. Этот комплекс последовательных и упорядоченных реакций определяет нарастающий и поддерживаемый эффект каскадной активации системы комплемента. На заключительном этапе все пути активации конвергируют в общий терминальный или мембраноатакующий путь, который приводит к лизису клеток-мишеней [76, 420].

Различные семейства вирусов выработали несколько стратегий, позволяющих им свести к минимуму распознавание и/или уничтожение системой комплемента: а) использование рецепторов комплемента для усиления проникновения вируса или подавления адаптивного иммунного ответа; б) экспрессию вирусных белков, которые непосредственно ингибируют комплемент; в) модуляцию экспрессии регуляторов комплемента на клетках хозяина, чтобы предотвратить комплемент-зависимый лизис; г) экспрессию ложных вирусных белков, которые структурно и функционально имитируют регуляторные белки комплемента и другие [353, 417, 484, 485]. Вирус может использовать несколько независимых стратегий, позволяющих ему противодействовать системе комплемента и модулировать иммунный ответ, что может привести к персистенции возбудителя.

Хотя многие вирусы подавляют активацию комплемента, при флавивирусной инфекции отмечается как защитная, так и патологическая роль комплемента в зависимости от конкретного вируса, фазы инфекции и иммунного статуса организма. Так, большинство исследований по изучению взаимодействия системы комплемента с флавивирусами было сосредоточено на роли комплемента в контексте патогенеза флавивирусных инфекций. Наблюдалось снижение активности системы комплемента в целом и отдельных ее компонентов (С3, С4, С5) в клинических исследованиях. При заболеваниях, вызванных разными флавивирусами, в том числе и ВКЭ [149, 461], чрезмерное накопление компонентов комплемента и анафилатоксинов (С3а, С5а) в крови пациентов коррелировало с тяжестью заболевания [370]. Высказано предположение, что инфицированные клетки на своей поверхности экспрессируют вирусные антигены (E или NS1 белки), которые способствуют образованию иммунных комплексов, вызывающих патологическую активацию комплемента [213]. Последующее изучение выявило, что неструктурный белок NS1 DENV может активировать комплемент, и уровни NS1 и некоторых белков комплемента коррелирует с тяжестью заболевания [482].

Тем не менее, в последние годы исследователи начали рассматривать роль системы комплемента при флавивирусных инфекциях в контексте протективного иммунитета. Так, было установлено, что мыши, дефицитные по С3-компоненту комплемента, более восприимчивы к летальной инфекции WNV и демонстрируют большую вирусную нагрузку и снижение титров противовирусных антител по сравнению с иммунокомпетентными животными [239]. Показано, что в активации комплемента при WNV инфекции участвуют все три пути, поскольку мыши, лишенные C1q- компонента комплемента (классический путь), или фактора B (альтернативный путь), или MBL (лектиновый путь), становятся высокочувствительными к этой инфекции [240, 459]. Кроме того, известно, что комплемент усиливает опосредованную антителами нейтрализацию многих вирусов, в том числе и флавивирусов [204]. В исследованиях in vitro было показано, что некоторые белки комплемента сводит к минимуму ADE при WNV и DENV инфекциях. Это позволяет предположить, что комплемент может играть определенную роль в ограничении ADE-опосредованного заболевания [240, 491]. Однако механизмы взаимодействия флавивирусов с организмом хозяина, которые приводят либо к активации комплемента, либо к уклонению от его действия, до сих пор не выяснены.

- Провоспалительные цитокины и интерфероны

Цитокины являются самой многочисленной, наиболее универсальной группой гуморальных факторов иммунной системы, важной для реализации как врожденного, так и адаптивного иммунитета. Они представляют собой полипептидные молекулы, продуцируемые преимущественно активированными клетками кроветворной и иммунной систем, и участвующие в межклеточной передаче сигнала в ходе иммунного ответа. Цитокины имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, отличающих их от других классов регуляторных молекул. Среди этих характеристик важнейшими считаются: плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, отсутствие антигенной специфичности, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети [67].

Ключевыми гуморальными факторами воспаления, необходимыми для реализации защитных функций врожденного иммунитета, являются три группы цитокинов: хемокины, провоспалительные цитокины и интерфероны [174].

IL-8–один из самых важных провоспалительных цитокинов, относящийся к семейству CXC-хемокинов. Он обнаруживается в секрете клеток через 2-3 часа после активации. Основными клетками-продуцентами IL-8 являются Мн/Мф и эндотелиальные клетки, а мишенью для этого цитокина служат Нф. Главная функция IL-8 состоит в обеспечении экстравазации Нф и их направленной миграции в очаг воспаления [388, 497].

Основными представителями группы провоспалительных цитокинов являются IL-1, TNFα и IL-6. Эти цитокины продуцируются, в основном, активированными Мн/Мф, но могут вырабатываться также Нф, дендритными клетками, активированными NK-клетками и Т-лимфоцитами. Провоспалительные цитокины синтезируются и секретируются достаточно быстро, и их можно выявить во внеклеточной среде через 3-4 часа после активации. Основные функции этих цитокинов – усиление экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках и лейкоцитах, индукция кислородного метаболизма клеток, стимуляция выработки цитокинов и белков острой фазы. Попадание избыточно секретируемых провоспалительных цитокинов в циркуляцию способствует проявлению системных эффектов воспаления, а в высоких дозах они приводят к развитию патологических эффектов, вплоть до шока [29, 344, 365]. Известно, что гиперпродукция провоспалительных цитокинов, включая TNFα и IL-6, повышает разрушение нейронов и увеличивает проницаемость ГЭБ [184, 457]. Необходимо отметить, что провоспалительная активность IL-6 слабее, чем у IL-1 и TNFα, кроме того, этот цитокин подавляет выработку IL-1, TNFα и хемокинов. Таким образом, IL-6 сочетает свойства про- и противовоспалительных цитокинов и участвует не только в развитии, но и в ограничении воспалительного процесса [173].

Интерфероны I-го типа - IFNα/β–продуцируются многими типами клеток: дендритными клетками, Мн/Мф, эпителиальными клетками, фибробластами, а при вирусной инфекции – всеми инфицированными ядросодержащими клетками. Основными индукторами IFNα/β являются двуспиральная и односпиральная РНК вирусов, действующие через TLR3 и TLR7/8, а также бактериальная ДНК, действующая через TLR9. К настоящему времени во многом расшифрованы сигнальные пути, обеспечивающие передачу сигналов с рецепторов IFN в клеточное ядро и активацию семейства генов, необходимых для синтеза и секреции IFN [216, 363, 409]. Продукция IFNα/β регистрируется через 6-12 часов после индукции. Важнейшее свойство интерферонов – способность оказывать прямое противовирусное действие, наиболее выражено у IFN I-го типа. Ключевые механизмы противовирусного действия IFNα/β заключаются в индукции синтеза следующих ферментов:

- протеинкиназы R (PKR), которая при взаимодействии с двуспиральной РНК вирусов активируется и фосфорилирует фактор инициации белкового синтеза eIF-2α, что приводит к блокаде трансляции вирусной m-РНК [321];

- 2′,5′-олигоаденилат синтетазы (OAS), которая активирует рибонуклеазу L (RNase L), что приводит к деструкции односпиральной вирусной РНК [236];

- Mx-белков, подавляющих транскрипцию целого ряда РНК-вирусов [294].

Интерферон II-го типа - IFNγ – синтезируется активированными антигеном Т-лимфоцитами, NK- и NKT-клетками. Среди Т-лимфоцитов синтез и секреция IFN-γ осуществляется цитотоксическими CD8⁺Т-клетками и преимущественно Th1-клетками [313]. Максимальная продукция IFNγ регистрируется через 48-72 часа после стимуляции клеток. Биологические свойства IFNγ могут быть сведены к следующим основным функциям: а) активация Мф, б) активация NK-клеток, в) стимуляция экспрессии MHC класса II, г) стимуляция синтеза изотипов Ig В-лимфоцитами, д) прямая противовирусная активность, которая ниже, чем у IFN I-го типа [67]. Таким образом, IFNγ является иммунорегуляторным цитокином, и его функции проявляются в большей степени в контексте адаптивного, чем врожденного иммунитета.

В настоящее время известно несколько стратегий, используемых вирусами для реализации контроля или уклонения от опосредованного провоспалительными цитокинами и IFN клеточного ответа, что необходимо для их успешной репликации и распространения: вирусное ингибирование PRRs сигналов; инактивация транскрипционных факторов; нарушение JAK-STAT передачи сигнала; ингибирование вирусами экспрессии генов клетки хозяина [26, 294]. Для флавивирусов было выявлено три независимых механизма, благодаря которым снижают продукцию IFN: задерживают их распознавание клеточными PRRs [277, 466, 468]; подавляют транскрипцию гена IFNβ [330]; блокируют JAK-STAT передачу сигнала [329]. Установлено, что все флавивирусы, включая WNV [288], JEV [214], DENV [251] и ВКЭ [331], могут подавлять IFN-опосредованную JAK-STAT передачу сигнала путем ингибирования JAK-фосфорилирования. Показано, что не только белок NS5 флавивирусов, будучи антагонистом STAT-фосфорилирования [331, 488], является решающим в противодействии этих вирусов IFN, но и другие неструктурные белки флавивирусов также могут вносить свой вклад в противодействие IFN-ответу [329, 330].

К настоящему времени не вызывает сомнения тот факт, что флавивирусные инфекции характеризуются нарушением продукции провоспалительных цитокинов и интерферонов. Ранее было установлено, что избыточная продукция провоспалительных цитокинов приводит к развитию системного воспалительного ответа (SIRS - systemic inflammatory response syndrome) [215] и раннему летальному исходу при генерализованных инфекциях [162, 414]. Подобный феномен системной активации системы цитокинов встречается при ряде вирусных инфекций. В первую очередь это относится к вирусным геморрагическим лихорадкам, в том числе и к лихорадке, вызванной DENV [244, 373]. В отличие от лихорадки DENV, для КЭ нехарактерно развитие геморрагического синдрома и циркуляторной недостаточности, но генерализация инфекции сопровождается системной гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (TNFα, ИЛ-1β и ИЛ-6), что подтверждено экспериментальными [46, 53] и клиническими наблюдениями [50, 203, 471].

В то же время при персистентных флавивирусных инфекциях (хронический вирусный гепатит В, С, хроническая антигенемия ВКЭ) механизмы нарушения межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток были обусловлены выраженным дисбалансом продукции провоспалительных (TNFα, IFNγ, IL-12) и противовоспалительных (IL-4, IL-10) цитокинов [43, 94]. Авторы предполагают, что снижение продукции TNFα при одновременном повышении растворимых форм его рецептора, является одним из звеньев иммунопатогенеза при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae.

Предполагается, что именно баланс между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами определяет исход заболевания или, по крайней мере, влияет на его продолжительность [162, 272, 414]. Однако неполноценный противовирусный иммунный ответ может быть генетически детерминирован, поскольку, с одной стороны, особенности формирования и течения инфекции обусловлены генетической гетерогенностью самого патогена, а с другой, – определяются иммуногенетическими особенностями организма. В последние годы установлено, что гены цитокинов и их рецепторов в популяции человека характеризуются аллельным полиморфизмом и наличием изоформ, что определяет их способность модулировать направление иммунного ответа и, соответственно, различные особенности течения и варианты исхода болезни [43, 71, 138, 176, 202].

Таким образом, к настоящему времени показано, что недостаточная или избыточная продукция цитокинов способствует неблагоприятному течению флавивирусных инфекций, и только оптимальная продукция цитокинов может привести к завершению инфекционного процесса [26]. Однако до сих пор не оценена роль изменений продукции цитокинов на ранних стадиях инфицирования вирусом КЭ – на 2-3 день после присасывания клеща. Это позволит, на наш взгляд, расширить представления о защитной и патологической роли цитокинов при различных клинических проявлениях КЭ, создав тем самым основу для решения практической задачи прогнозирования течения и исхода этой инфекции с целью усовершенствования профилактической и терапевтической стратегий.