Имени а. Л. Мясникова фгбу «российский кардиологический научно-производственный комплекс» мз РФ

В двойном слепом рандомизированном исследовании Wang ZN и соавторов показано значительное снижение экспрессии гена Лп-ФЛА2 у 40 больных ИБС через 12 недель приёма аторвастатина в дозах 20 и 80 мг/сут [79]. В проспективном рандомизированном исследовании RADAR (Rosuvastatin and Atorvastatin in different Dosages And Reverse cholesterol transport) изучалось действие розувастатина и аторвастатина в субпопуляции из 80 больных с установленным сердечно-сосудистым заболеванием. Это были пациенты в возрасте от 40 до 80 лет с низким уровнем холестерина ЛВП (< 1.0 ммоль/л), которые после 6 недель соблюдения гиполипидемической диеты были рандомизированы для приёма аторвастатина 20 мг/сут (n=41) либо розувастатина 10 мг/сут (n=39). Дозы препаратов титровались с 6-ти недельным интервалом в течение 12 недель до 80 мг/сут аторвастатина и 40 мг/сут розувастатина. За время периода наблюдения, составлявшего 18 месяцев, показано значительное снижение уровня Лп-ФЛА2 (массы и активности) на фоне приёма обоих статинов, p < 0.001. Более выраженное снижение активности Лп-ФЛА2 наблюдалось при приёме розувастатина (p = 0.04) [80].

Терапия статинами достоверно снижает уровень Лп-ФЛА2 как в плазме крови, так и в АСБ, сдерживая локальный воспалительный ответ и повышая стабильность АСБ путём подавления воспаления и снижения апоптоза макрофагов [81]. В экспериментальной работе Qiao Z с соавторами изучалось влияние симвастатина на экспрессию Лп-ФЛА2 в АСБ и активность Лп-ФЛА2 в плазме и тканях аорты с атеросклеротическим поражением. Показано подавление Лп-ФЛА2 симвастатином во всех случаях [82].

STABILITY - The STabilisation of Atherosclerotic plaque By Initiation of darapLadIb TherapY – это рандомизированное, плацебо контролируемое двойное слепое с параллельными группами исследование, которое проводится в нескольких центрах. В нём изучается влияние препарата Дарапладиб на уровень Лп-ФЛА2 у больных с ИБС (мужчины и женщины старше 18 лет), получающих стандартную антиангинальную терапию. Дарапладиб снижает активность Лп-ФЛА2, причём авторы рассчитывают доказать доз-зависимый эффект: чем выше доза, тем сильнее ингибирование. Дарапладиб оказывает влияние как на активность Лп-ФЛА2 в плазме, так и в атеросклеротической бляшке. Ожидается, что подобная терапия позволит стабилизировать АСБ. Исследование STABILITY включает 15500 пациентов, которые рандомизированы на 2 группы. Половина участников получает 160 мг Дарапладиба в сутки, половина – плацебо. Первичными точками является любое сердечно-сосудистое событие: смерть, нефатальный инфаркт миокарда, нефатальный инсульт. Вторичными конечными точками являются композитные исходы: сердечно-сосудистая смерть, нефатальный инфаркт миокарда или экстренная реваскуляризация, госпитализация в связи с возникновением нестабильной стенокардии [83].

Исследование SOLID-TIMI 52 (The Stabilisation of pLaque Using darapladib -Thrombolysis In Myocardial Infarction 52) включает 11,500 пациентов из 40 стран. Это рандомизированное, плацебо-контролируемое, двойное-слепое исследование, включающее мужчин и женщин с ОКС. Цель исследования – оценить клиническую эффективность Дарапладиба по сравнению с плацебо. Пациенты как основной группы, так и группы сравнения кроме это получают аспирин, статины и гипотензивные препараты. Лечение дарапладибом в дозе 160 мг/сут начинают на 30-ые сутки ОКС. Исследование SOLID-TIMI 52 является исследованием III фазы. Его планируется прекратить, когда будут зарегистрированы 1500 случаев возникновения больших коронарных событий – сердечно-сосудистую смерть, нефатальный инфаркт или инсульт [84].

Таким образом, можно считать доказанной связь уровня Лп-ФЛА2 с развитием атеросклероза и влияние данного энзима на состояние АСБ. Ведутся исследования по лекарственному воздействию на её уровень. Однако для того, чтобы рассматривать Лп-ФЛА2 в качестве мишени для медикаментозной терапии требуются дальнейшие исследования.

Заключение по обзору литературы

Несмотря на повышенный научный интерес к поиску диагностических методов, позволяющих выявлять нестабильные АСБ, в настоящее время ни один из них не может быть рекомендован для использования в клинической практике. Нет уверенности, что Лп-ФЛА2 будет использоваться в качестве маркёра нестабильности АСБ. Свойства этого воспалительного белка, его связь с выраженностью атеросклероза, влияние на его уровень различных методов лечения до конца не изучены. В частности мало работ, в которых описывается изменение уровня Лп-ФЛА2 в зависимости от степени стенозирования артерий, от количества АСБ, сопутствующих заболеваний и от категории сердечно-сосудистого риска. Не ясно также, какой уровень Лп-ФЛА2 – измеренный по массе или по активности – следует использовать, какие преимущества и недостатки у этих двух показателей. С целью изучения данных вопросов была спланирована настоящая работа.

В работу включено 519 пациентов, которые в период с 2009 по 2012 год прошли обследование в ФГБУ РКНПК в ИКК им А.Л. Мясникова в рамках I этапа проспективного, рандомизированного наблюдательного исследования с элементами направленного медикаментозного вмешательства Научно-исследовательской работы «Апробация и внедрение в практику амбулаторно-поликлинических учреждений новых алгоритмов предупреждения, диагностики и лечения атеросклероза на примере ЗАО г. Москвы» Научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения атеросклероза и его осложнений».

Из 2400 человек были выбраны 519, которым проведено определение уровня Лп-ФЛА2 и дуплексное сканирование сонных артерий. Этим больным были выполнены следующие обследования – сбор жалоб, анамнеза, физикальное обследование, лабораторные анализы, электрокардиограмма, эхокардиограмма (ЭХО КГ).
2.1. Клиническая характеристика больных

В исследование включено 519 пациентов, 162 мужчин, 357 женщин, средний возраст 57.0 (51.0-64.0) лет, относящихся к очень высокому, высокому, умеренному или низкому риску. Набор пациентов проводился в 2009-2010 гг в 12 Городских поликлиниках Западного административного округа г. Москвы. Критерием включения служило согласие пациента принять участие в исследовании.

Критериями исключения служили: сердечная недостаточность III-IV по NYHA, воспалительные заболевания, гипотиреоз, гипертиреоз, цирроз печени, нарушение функции почек, острый коронарный синдром.

Все больные были разделены на 4 группы в зависимости от категории риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Деление на группы проводилось по следующим критериям, опубликованным в 2012 г. в рекомендациях по Диагностики и коррекции нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза (Российские рекомендации, V пересмотр, Москва. 2012 год):

а) больных с ИБС и/или ишемическим инсультом.

б) пациентов, страдающих сахарным диабетом 2 или 1 типа с повреждением органов-мишеней и с микроальбуминурией.

в) пациентов с умеренными или тяжелыми хроническими заболеваниями почек - скорость клубочковой фильтрации (СКФ) < 60 мл/мин/1,73м2).

г) пациентов с 10-летним риском сердечно-сосудистой смерти по шкале SCORE ≥ 10%.

К категории высокого риска относятся пациентов:

а) со значительным повышением одного из факторов риска.

б) с сердечно-сосудистым риском по шкале SCORE - ≥5% и < 10%.

К категории умеренного риска относили пациентов с риском по шкале SCORE ≥ 1% и < 5%.

К категории низкого риска относили пациентов с риском по шкале SCORE < 1%.

227 больных было отнесено к категории очень высокого риска, 103 - к категории высокого риска, 129 - к категории умеренного риска, 60 - к категории низкого риска.

В таблице 2 представлена клиническая характеристика пациентов, включённых в исследование.

Таблица 2. Клиническая характеристика пациентов.

В таблице 3 представлена терапия, которую получали пациенты.

2.2. Методы.

Все исследования были проведены в ФГБУ РКНПК МЗ РФ однократно.

2.2.1. Лабораторные методы:

Лабораторная часть исследования выполнена в лаборатории клеточной инженерии института экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК МЗ РФ, в отделе нейрогуморальных и иммунологических исследований (руководитель - проф. В.П. Масенко) и в лаборатории клинической биохимии обмена липидов (руководитель – проф., д.м.н. В.Н. Титов) Института клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова ФБГУ РКНПК МЗ РФ.

В клиническом анализе крови определяли уровень эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов, гематокрита, тромбоцитов, СОЭ.

В биохимическом анализе крови определяли уровень аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ), глюкозы, креатинфосфокиназы, креатинина, билирубина, АПО В100, АПО А1. Уровень вчСРБ определяли нефелометрическим методом. Концентрацию Лп(а) определяли иммунотурбидиметрическим методом.

Уровень ОХС, ТГ, ХСЛНП и ХСЛВП сыворотки крови определяли ферментативным способом на биохимическом анализаторе «ARCHITECT» фирмы «Abbott» (США). Результаты выражали в ммоль/л.
Определение уровня Лп-ФЛА2.

Основным этапом работы было определение уровня Лп-ФЛА2 по массе и по активности. До забора крови не разрешался приём короткодействующих нитратов и исключалась физическая активность. Исключалось курение перед забором крови. Следует отметить, что имеется работа, показывающая, что курение, характер питания и физическая нагрузка на активность Лп-ФЛА 2 влияния не оказывают [85]. Тем не менее, поскольку нет работ о влиянии вышеуказанных факторов на массу Лп-ФЛА2, забор крови проводился по стандартизованному для всех протоколу. Время забора крови не имеет принципиального значения, так как показано, что суточное колебание уровня Лп-ФЛА2 отсутствует [86]. Также не имеет значение двигательная активность непосредственно перед забором крови [87].

Из локтевой вены проводили забор 20 мл крови в две пустые пробирки, кровь центрифугировали и полученную сыворотку раскапывали в микропробирки, которые немедленно замораживали и хранили при температуре -70 градусов по Цельсию. В последующем в полученной сыворотке определяли уровень Лп-ФЛА2.

Измерение уровня Лп-ФЛА2 по массе.

Количественное определение Лп-ФЛА2 в плазме крови проводилось иммуноферментным методом (ELISA). Единицы измерения нг/мл. При этом повышенным считали уровень Лп-ФЛА2 более 210 нг/мл, как это обозначено в Европейских и Российских рекомендациях по диагностике, профилактике и лечению атеросклероза.

PLAC® Test (PLAC® Test for Лп-ФЛА2 Activity) является диагностическим набором для количественного определения активности Лп-ФЛА2 в плазме и сыворотке крови человека с помощью автоматизированного клиническо-биохимического тестирования.

Разработчики предполагают, что результаты этого тест-анализа можно будет использовать совместно с данными клинического обследования и оценкой сердечно-сосудистого риска у пациента в качестве индикатора атеросклеротических сердечно-сосудистых заболеваний.

Принцип проведения тест-анализа: PLAC® Test является диагностическим набором для определения активности Лп-ФЛА2. Лп-ФЛА2 сыворотки или плазмы крови гидролизует область Sn-2 субстрата 1-миристоил-2-(4-нитрофенил сукцинил) фосфатидилхолина, в результате чего образуется окрашенный продукт реакции: 4-нитрофенол, скорость образования 4-нитрофенола определяется спектрофотометрически, активность Лп-ФЛА2 рассчитывается исходя из скорости изменения оптической плотности. Для получения стандартной калибровочной кривой изменения поглощения по сравнению с уровнем активности Лп-ФЛА2 (в нмоль/мин/мл) пробы, взятой для анализа, используется набор из пяти калибраторов Лп-ФЛА2.

Процедура анализа:

Калибровка теста производилась посредством 5-точечной калибровочной кривой. Стандартную кривую строили при использовании соответствующей модели построения кривой по точкам, приведенной в инструкции по эксплуатации к данному прибору. В соответствии с лабораторными требованиями, калибровку проверяли, используя для этого контроли, по меньшей мере, двух уровней. При каждой смене набора, а также 1 раз в 4 недели производилась перекалибровка и прогон анализатора с контрольными образцами. Если получаемые при этом показатели выходили за пределы приемлемого для лаборатории диапазона, то выполняли перекалибровку.

Для контроля качества тестировали два уровня контрольного материала не реже одного раза в день в течение каждых суток использования. Кроме того, проверяли конрольные образцы после каждой очередной калибровки. В каждом прогоне анализатора использовали «низкий» и «высокий» контроли. Если полученные значения показателей контролей выходили за допустимые пределы, анализ повторяли.

Рабочие параметры были установлены, исходя из использования биохимического анализатора Beckman Coulter (Olympus) AU400®.

Клиническая чувствительность (минимальный предел достоверного определения) теста составляет ≤ 10 нмоль/мин/ мл.

Воспроизводимость.

Определение межтестовой и внутритестовой вариабельности осуществлялось путем измерения пяти образцов сыворотки крови и двух контролей со значениями активности ЛП-ФЛА2 в пределах 54 – 328 нмоль/мин/мл. Образцы анализировались с помощью реагентов из трех лотов в двух повторах, дважды в сутки и в течение 20 дней. Полученные данные подытожены ниже и служат репрезентативными характеристиками теста. Коэффициенты вариабельности: внутритестовый ≤ 2,9, межтестовый ≤ 3,0, общий ≤ 3,8.

Единицы измерения - нмоль/мин/мл. При этом повышенным считали уровень Лп-ФЛА2 более 202.4 нмоль/мин/мл, поскольку это значение медианы для Лп-ФЛА2, измеренной по активности для нашей выборки пациентов. Более подробно данный вопрос освещён в главе Результаты.

Всем больным проводили дуплексное сканирование сонных артерий на аппаратах Philips IE33 и Philips iU22 линейным датчиком 9-11МГц с определением наличия АСБ в сонных артериях в соответствии с Рекомендациями Американского общества специалистов по эхокардиографии и Общества по сосудистой медицине и биологии (American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force. J Am Soc Echocardiography 2008).

Дуплексное сканирование включает в себя визуализацию просвета и стенок сосуда, окружающих сосуд тканей в В-режиме с одновременным анализом состояния гемодинамики посредством допплеровских технологий. По результатам исследования в В-режиме были получены данные о наличии, характере и распространённости изменений структуры и толщины сосудистой стенки, наличии внутрипросветных образований, их локализации, протяжённости, эхогенности, степени стенозирования просвета сосуда.

При этом в обработку включалась информация о количестве АСБ, максимальном и суммарном проценте стеноза. При подсчёте количества АСБ учитывалось наличие АСБ в 6 сегментах: дистальная 1/3 общей сонной артерии, бифуркация общей сонной артерии, устье внутренней сонной артерии, справа и слева. Соответственно количество АСБ варьировало от 0 до 6. Максимальным процентом стеноза считался стеноз наибольшей степени выраженности. Например, при наличии 3 АСБ, суживающих просвет сонной артерии на 20%, на 40% и на 35%, максимальным процентом стеноза считался стеноз 40%.

Суммарный процент стеноза рассчитывался как сумма всех стенозов сонных артерий (метод Спенсера, 1997, модификация. Апробирован в РКНПК в 2012 г.). Например, при наличии 3 АСБ, суживающих просвет сонной артерии на 20%, на 40% и на 35%, суммарным процентом стеноза считался стеноз 20% + 40% + 35% = 95%.

ЭХО КГ.

По данным трансторокальной ЭХО КГ с помощью различных режимов определяли показатели центральной гемодинамики и диастолической функции сердца в покое. Одномерные показатели, такие как размер левого предсердия (ЛП), конечно-диастолический размер (КДР) и конечно-систолический размер левого желудочка (КСР ЛЖ), правый желудочек (ПЖ), толщина межжелудочковой перегородки (ТМЖП) и толщина задней стенки левого желудочка (ТЗСЛЖ) оценивались в М-режиме по парастернальной длинной оси левого желудочка (ЛЖ) согласно стандартной общепринятой методике. ФВ ЛЖ и его объемы конечно-диастолический размер (КДО), конечно-систолический размер (КСО) и ударный объем (УО) рассчитывались по методике Симпсона (Simpson) при анализе видеозаписи изображения сердца из верхушечной 4-камерной позиции. ФВ ЛЖ рассчитывали по формуле ФВ%=[(КДО-КСО)/КДО]х100%. КДО и КСО рассчитывали по формуле Teischholz и Gorlin (1972г.): КДО(мл)=[7/(2,4+КДР)]хКДР³; КСО(мл)=[7/(2,4+КСР)]хКСР³. УО(мл)=КДО-КСО. Структура диастолического наполнения ЛЖ исследовалась путем регистрации доплеровского трансмитрального диастолического потока (ТМДП) в покое. Измерялись: максимальная скорость трансмитрального кровотока в период раннего диастолического наполнения ЛЖ (Vе); максимальная скорость трансмитрального кровотока в период позднего диастолического наполнения ЛЖ (Va); их соотношения (Ve/Va).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась при помощи статистического пакета Statistica 8.0. Данные представлены в виде Медиана (межквартильный размах).

Распределение в группах оценивалось методом Колмогорова-Смирнова, при этом параметрическим считалось распределение при p>0,05. Достоверность различий величин, распределённых ненормально определялась по методу Kruskal-Wallis, χ² и Mann-Whitney. Сравнение количественных показателей в нескольких группах проводилось методом Kruskal-Wallis. Если различия были достоверны, то далее проводили сравнение двух групп парным тестом Mann-Whitney. Различия считались статистически достоверными при p<0.05.

Для оценки взаимосвязи количественных признаков использовался метод ранговой корреляции по Spearman. Считалось, что корреляция имеется при p<0.05. При r от 0.1 до 0.3 корреляция считалась слабой, при r от 0.31 до 0.5 умеренной, свыше 0.5 сильной.

Все пациенты были обследованы по стандартной методике. Физикальное обследование включало перкуссию, аускультацию, пальпацию, измерение АД. Из инструментальных методов выполнено – регистрация ЭКГ в 12 отведениях, трансторокальное ЭХО КГ (по стандартному протоколу). Ключевыми моментами работы были определение уровня Лп-ФЛА2 по массе и активности и дуплексное сканирование сонных артерий.

В таблицах 4 и 5 представлена клиническая характеристика и проводимая терапия в зависимости от категории риска (здесь и далее данные представлены в виде Медиана (межквартильный размах)).
Таблица 4. Клиническая характеристика пациентов в зависимости от категории риска.

	Очень высокий риск N=227	Высокий риск N=103	Умеренный риск N=129	Низкий риск N=60	P
Мужчин/женщин	94/133 (41%/59%)	24/79 (23%/77%)	43/86 (33%/7%)	1/59 (2/98%)	0.00001*
Средний возраст, лет	62.0 (56.0-68.0)	61.0 (55.0-67.0)	53.0 (50.0-57.0)	46.0(42.0-49.0)	0.001**
Курение в настоящее время	40 (18%)	15 (15%)	31 (24%)	12 (20%)	0.03*
Курение в анамнезе	38 (17%)	9 (9%)	11 (9%)	3 (5%)
АГ	207 (91%)	91 (88%)	97 (75%)	26 (43%)	0.00001*
Отягощенный семейный анамнез	153 (67%)	66 (64%)	85 (66%)	30 (50%)	0.09*
Ожирение	100 (44%)	39 (38%)	55 (43%)	21 (35%)	0.0001*
Гиперлипидемия	212 (93%)	90 (87)	99 (77%)	22 (37%)	0.0001*
Наличие АСБ в сонных артериях	218 (96%)	92 (89%)	98 (76%)	28 (47%)	0.0001*
ТИМ > 0,9 мм	89 (39%)	30 (29%)	19 (15%)	1 (2%)	0.00001*
ИБС	184 (81%)	0	0	0
ИМ в анамнезе	65 (29%)	0	0	0
ОНМК	15 (6%)	0	0	0
ТБКА	25 (11%)	0	0	0
КШ	13 (6%)	0	0	0
СД	55 (24%)	0	0	0

*- тест χ², ** - тест Kruskal-Wallis

Сравнение количества ИМ в анамнезе, ОНМК, проведённых ТБКА, КШ и СД не проводилось, так как эти данные учитывались при формировании групп.

Таблица 6. Данные физикального и инструментальных методов обследования у всех пациентов, включённых в исследование.

Как видно из таблицы имелись различия между группами. Так окружность талии была достоверно выше у пациентов группы очень высокого риска, при этом индекс массы тела значимо не различался. Это доказывает целесообразность использования именно окружности талии, а не индекса массы тела в качестве фактора риска, что нашло отображение, как в Европейских, так и в Российских рекомендациях по лечению дислипидемий. Вес был достоверно ниже у пациентов низкого риска. Это соответствует представлениям о факторах риска сердечно-сосудистых заболеваний. Следует отметить, что более высокое диастолическое АД отмечено у пациентов высокого риска, что, вероятно связано с отсутствием гипотензивной терапии. У пациентов низкого и умеренного риска как правило нет значимого повышения АД, а больные очень высокого риска получают гипотензивную терапию. Систолическое АД было выше у пациентов группы очень высокого и высокого риска по сравнению с пациентами группы низкого и умеренного риска.

Размеры камер сердца были выше у больных очень высокого и высокого риска, что соответствовало ожидаемым результатам, так как в эти категории риска попали пациенты с перенесённым инфарктом миокарда и с АГ. ТМЖП и ТЗСЛЖ были ниже у пациентов низкого риска по сравнению с пациентами умеренного, высокого и очень высокого риска. Напротив, ФВ ЛЖ у больных очень высокого риска была ниже.

Результаты лабораторных методов в целом по группе представлены в таблице 8, для каждой категории риска – в таблице 9.

Как видно из таблицы уровень общего холестерина и холестерина ЛНП был несколько повышен и соответствовал уровню данных показателей в Российской популяции.

Как и следовало ожидать, у пациентов высокого риска уровень общего холестерина и холестерина ЛНП был выше, чем у пациентов очень высокого риска, умеренного и низкого риска, а также выше, чем в целом по группе. Более низкий уровень общего холестерина и холестерина ЛНП в группе очень высокого риска связан с тем, что 44% данных пациентов получали статины. Таким образом, прослеживается характерная тенденция – медикаментозную терапию чаще получают пациенты с диагнозом ИБС, у пациентов высокого риска врачи не проводят медикаментозную коррекцию факторов риска. Мочевая кислота, сахар были выше у больных высокого и очень высокого риска. Уровень Лп(а) был выше у пациентов очень высокого риска, чем у пациентов других групп, в данном случае терапия статинами, как и следовало ожидать, не оказала влияние на этот показатель. Концентрация вчСРБ у пациентов разных групп значимо не различалась. Уровень АПО В100 был ниже у пациентов низкого риска по сравнению с другими группами, у пациентов высокого риска он был повышен в большей степени. Уровень АПО А1 значимо не различался.