Исследования по разработке и стандартизации лекарственных растительных средств для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения 15. 00. 02 фармацевтическая химия, фармакогнозия

профессор Лиходед Виталий Алексеевич

профессор Даргаева Тамара Дарижаповна

доктор фармацевтических наук,

профессор Нестерова Ольга Владимировна

доктор химических наук,

профессор Скачилова Софья Яковлевна

университет

Защита состоится 13 октября 2008 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН по адресу: 117216, Москва, Грина, 7.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР по адресу: 117216, Москва, Грина, 7.
Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

Д 006.070.01

д.фарм.н. А.И. Громакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы

В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в практическом здравоохранении, составляет более 40%. Расширение исследований по изысканию источников для получения новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов растительного происхождения, в том числе применяемых в гастроэнтерологической практике, является актуальной задачей медицины. Одним из путей увеличения количества лекарственных растительных препаратов является широкое изучение действия уже известных фармакопейных лекарственных растений, часто используемых по ограниченному числу показаний, хотя многие из них могут найти более широкое применение. Кроме того, целесообразно составление рациональных многокомпонентных растительных композиций (сборов), содержащих биологически активные вещества с разносторонним фармакологическим действием для коррекции многих, связанных между собою систем организма.

В последние годы во многих странах отмечается неуклонный рост гастроэнтерологических заболеваний, связанный с неблагоприятной экологической обстановкой, неправильным и нерациональным питанием. В России заболеваниями данной группы страдает каждый десятый житель. К числу наиболее распространенных относится хронический панкреатит (8-35%), язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (8-10%), заболевания гепатобилиарной системы, в том числе гепатит (18-22%). Изучение структуры заболеваний органов пищеварения по Республике Башкортостан показало, что они сопоставимы с данными по России и первое место среди них также занимает хронический панкреатит (38,6%), затем язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки (23,5%), заболевания гепатобилиарной системы (15,2%), хронический гепатит (6,9%) и др. Эти заболевания осложняются развитием дисбактериоза, который выявляется более чем у 90% больных, с острыми и хроническими гастроэнтерологическими заболеваниями и практически у всех пациентов с острыми кишечными инфекциями. При этом нарушается баланс между различными видами микроорганизмов кишечника, выявляется патогенная и условно патогенная флора, развиваются общие метаболические расстройства и нейрогуморальные нарушения. Кроме того, отмечается увеличение числа больных с тяжелым течением заболеваний пищеварительной системы, развитием осложнений, увеличением процента злокачественных новообразований желудка, поджелудочной железы, что ведет к повышению летальности и потере трудоспособности населения. В связи с этим проблема восстановления функциональной активности органов пищеварения, профилактика сезонных обострений является актуальной и достаточно сложной.

В терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используются разнообразные синтетические лекарственные средства. Однако, при их выраженном терапевтическом эффекте они не лишены побочного действия, имеют противопоказания и ограничения к применению, не всегда предотвращают развитие рецидива заболевания после их отмены.

В настоящее время патология органов пищеварения имеет не только хронический, но и сочетанный характер, что определяет необходимость разработки комплексных подходов к их лечению, в том числе с применением лекарственных растительных средств, которые имеют широкий спектр лечебного и профилактического действия, обладают низкой токсичностью, мягкостью действия, способны быстро устранять симптомы обострения, предупреждать рецидивы и способствовать восстановлению нарушенных функций желудочно-кишечного тракта. Возможности профилактики и комплексного лечения с применением растительных средств таких заболеваний, как хронический панкреатит, гепатит, язвенная болезнь желудка и дисбактериоз, часто осложняющий их, еще недостаточно изучены в клинической практике. Ассортимент официнальных многокомпонентных растительных сборов, рекомендуемых в терапии заболеваний пищеварительной системы включает только 11 наименований, причем среди них нет тех, которые рекомендовались бы для лечения и профилактики хронического панкреатита, дисбактериоза, а предлагаемые для лечения гепатита, язвенной болезни желудка учитывают не все особенности патогенеза этих заболеваний. Однако, при рациональном сочетании лекарственных растений между собой и с синтетическими препаратами расширяются их терапевтические возможности, снижается частота побочных явлений медикаментозной терапии. Все это требует более глубокого изучения принципов комбинирования лекарственного растительного сырья в сборах для обеспечения необходимого фармакологического эффекта.

Перспективность развития исследований по разработке новых растительных сборов, рекомендуемых при лечении заболеваний пищеварительной системы, подтверждается и тем, что в Уральском регионе, в частности Башкортостане, имеются достаточные сырьевые растительные ресурсы, которые позволяют организовать промышленное производство лекарственных растительных средств. Это имеет большое значение в оздоровлении населения республики и обеспечении его доступными лекарственными препаратами.

Таким образом, поиск и разработка новых эффективных и безопасных лекарственных растительных средств для профилактики и комплексного лечения некоторых заболеваний пищеварительной системы представляет актуальную задачу фармацевтической науки.

Целью настоящих исследований является разработка теоретически обоснованных подходов к подбору компонентов сборов для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения, их комплексное исследование, стандартизация и разработка рациональных лекарственных форм на их основе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следую­щие задачи:

- разработать научно-методологический подход к созданию многокомпонентных растительных сборов для профилактики и комплексного лечения некоторых заболеваний органов пищеварения;

- теоретически и экспериментально обосновать оптималь­ный состав новых многокомпонентных растительных сборов;

- изучить ресурсную обеспеченность основных растительных компонентов пред­ложенных сборов в Республике Башкортостан и возможность интродукции пряно-ароматических, эфирномасличных расте­ний для расширения сырьевой базы и ассортимента профилактических средств;

- провести комплексные фармакогностические исследования многокомпонентных растительных сборов, интродуцированных растений, определить критерии подлинности сборов, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания;

- изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из сборов для разработки рациональной схемы получения сухих экстрактов на их основе и определить показатели качества;

- разработать состав соотношения и способ получения лекарственных форм на основе масляного растительного экстракта;

- провести фармакологические исследования, подтверждающие эффективность предложенных растительных средств;

- разработать нормативную документацию: фармакопейные статьи на сборы и технические условия на чайные напитки и экстракты.

Выявлены закономерности, позволяющие обосновать научно-методологический подход к созданию новых многокомпонентных растительных сборов, рекомендуемых для профилактики и комплексного лечения некоторых заболеваний пищеварительной системы с учетом многофакторного механизма их развития и принципов фармакологической регуляции функциональной деятельности системы пищеварения.

Теоретически и экспериментально, с помощью фармакологического скрининга, обоснованы составы четырех новых сборов: для профилактики и комплексного лечения в стадии обострения и ремиссии хронического панкреатита и гепатита - «Гепапанкреафит - О», «Гепапанкреафит - Р»; язвенной болезни желудка - «Ульцерофит»; дисбактериоза - «Дисбакфит».

Изучена обеспеченность в Республике Башкортостан сырьевой базы по основным компонентам растительных сборов и с целью ее расширения возможность интродукции в лесостепную зону Южного Предуралья пряно-ароматических и эфиромасличных растений. На основе проведенных исследований установлено, что перспективными для введения в культуру являются 13 видов, для которых изучен химический состав и выявлены растения, накапливающие максимальное количество биологически активных веществ и проявляющие более выраженную антиоксидантную активность.

В ходе фармакогностических исследований разработаны «Определители» морфологических групп растительных компонентов сборов, выявлены диагностически значимые признаки лекарственного растительного сырья и сборов для установления их подлинности и стандартности. С использованием современных методов анализа (УФ- и ИК-спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс- и атомно-абсорбционная спектрометрия) в сборах и интродуцированных растениях установлено содержание основных групп биологически активных веществ флавоноидной природы, фенолкарбоновых кислот, кумаринов, антраценпроизводных, сапонинов, полисахаридов, эфирных масел, органических кислот, витаминов, аминокислот, макро- и микроэлементов.

В ходе технологических исследований разработана схема получения сухих экстрактов из сборов, установлена зависимость выхода биологически активных веществ от различных режимов экстрагирования, изучен их химический состав и предложены критерии подлинности. Обоснованы состав, технология и целесообразность применения вспомогательных веществ для получения новых лекарственных форм (гель и карандаш) на основе масляного экстракта из разработанного и изученного ранее сбора «Экзофит». Разработан новый способ определения твердости карандаша.

С учетом значимости отдельных групп биологически активных веществ сборов и лекарственных форм на их основе в обеспечении лечебных эффектов, разработаны методики их количественной оценки и предложены показатели качества, необходимые для стандартизации. В сборах «Гепапанкреафит-О» и «Дисбакфит» - определение содержания суммы флавоноидов и дубильных веществ; в сборах «Гепапанкреафит–Р» и «Ульцерофит» - суммы флавоноидов и полисахаридов; в лекарственных формах на основе масляного экстракта «Экзофит» - каротиноидов.

Методами фармакологических исследований доказана рациональность составов и эффективность применения предложенных растительных средств. Разработан способ одновременного моделирования хронического панкреатита и гепатита на животных.

Приоритет и новизна проведенных исследований защищены 7 патентами РФ: № 2271041; № 2223777; № 2178304; № 2193411; № 2232591; № 2310438; № 2315279; тремя положительными решениями на выдачу патента - № 2007123053/15(025101), № 2007123054/15(025102) и № 2007123051/ 14 (025099); поданы 3 заявки на изобретение: приоритетные справки № 2007130459/14; №2007130461/14; №2007130460/14.

Практическая значимость

По результатам исследований разработаны и внедрены:

♦ проекты ФС на сборы: Species «Hepapancreаphytum – O» - для комплексного лечения хронического панкреатита и гепатита в стадии обострения; Species «Hepapancreаphytum – R» - для профилактики и комплексного лечения хронического панкреатита и гепатита в стадии ремиссии; Species «Ulcerophytum» - для профилактики и комплексного лечения язвенной болезни желудка; Species «Disbacphytum» - для профилактики и комплексного лечения дисбактериоза, которые приняты к рассмотрению Фармакопейным комитетом (вход. № 20099 - 20102 от 08.04.08г.);

♦ в работу ООО «Травы Башкирии»: технические условия «Напитки чайные «Гепапанкреафит-О», «Гепапанкреафит-Р», «Ульцерофит», «Дисбакфит»» для профилактики заболеваний пищеварительной системы (ТУ 9191-004-26795008-2002, утвержденные 25.10.02г.); технические условия «Экстракты из растительного сырья» (ТУ 9168-007-26795008-2003, утвержденные 28.12.03г.); инструктивные письма по приготовлению и использованию настоев из сборов;

♦ в работу ГУП «Башфармация» материалы ресурсного обследования флоры Башкортостана (акт внедрения от 10.11.2007г.) на основе которых разработаны и внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии Башкирского государственного медицинского университета (БГМУ) учебные пособия «Ресурсоведение лекарственных растений», «Учебная практика по фармакогнозии», которые получили гриф Учебно-методического объединения по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России (УМО-39 от 27.01.05; УМО-703 от 15.11.05) и рекомендованы для студентов фармацевтических вузов и факультетов;

♦ результаты изучения макро- и микроскопических признаков лекарственного растительного сырья использовались при разработке учебного пособия «Основы гистологии, анатомии, физиологии и морфологии растений», которое внедрено в учебный процесс кафедры фармакогнозии БГМУ, получило гриф УМО-39 от 27.01.05г. и рекомендовано для студентов фармацевтических факультетов и вузов России;

♦ результаты изучения сборов для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения использовались при разработке монографии «Лекарственные растения в гастроэнтерологии»;

♦ материалы по фитохимическому изучению и определению антиоксидантоной активности интродуцированных в лесостепную зону Южного Предуралья пряно-ароматических и эфирномасличных расте­ний, вошли в монографию «Проблемы экологии и принципы их решения на примере Южного Урала»;

♦ материалы диссертации апробированы в Республиканском центре контроля качества и сертификации лекарственных средств Республики Башкортостан и внедрены в учебный процесс кафедр БГМУ: фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, фармацевтической технологии с курсом биотехнологии, поликлинической терапии, поликлинической медицины ИПО, инфекционных болезней ИПО (акты внедрения).

Связь задач исследований с проблемным планом

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Фармакология и фармация». Номер госрегистрации 01200507996.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на региональных, российских, международных форумах, конгрессах, съездах, научно-практических конференциях: Москва – 1996, 1998, 2001, 2004, 2006, 2007; Санкт-Петербург - 2001; Чебоксары – 1996; Томск - 2002, 2006; Новосибирск – 2004, 2005; Архангельск – 2004; Красноярск – 2004; Запорожье – 2007; Пущино – 2007; Пермь – 2007; Уфа – 1996-2008.

Основное содержание работы отражено в 70 научных работах, из них в журналах рецензируемых ВАК – 16; 3 учебных пособия с грифом УМО; 1 монография; 7 патентов, 3 положительных решения на выдачу патента и 3 заявки на изобретение.

- результаты анализа современного состояния номенклатуры лекарственных средств растительного происхождения в Республике Башкортостан, применяемых при заболеваниях органов пищеварения;

- результаты теоретических, экспериментальных исследований по разработке и обоснованию составов новых сборов;

- результаты фармакогностических исследований сборов, определения характеристик подлинности, показателей качества и изучения химического состава интродуцированных в лесостепную зону Южного Предуралья пряно-ароматических и эфирномасличных расте­ний;

- результаты технологических исследований по разработке сухих экстрактов из сборов, лекарственных форм на основе масляного экстракта и определения показателей их качества;

- результаты фармакологических исследований по оценке эффективности действия разработанных сборов, лекарственных форм на их основе;

- результаты разработки нормативной документации на сборы и экстракты.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 304 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 4 глав собственных исследований, выводов и списка используемой литературы, включающего 370 источников, из которых 37 иностранных авторов, приложений. Работа иллюстрирована 39 рисунками и 98 таблицами.

В первой главе, на основании обзора литературных данных, изложено современное состояние вопроса профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения с использованием лекарственных растительных средств. Проанализированы и обобщены сведения о лекарственных препаратах растительного происхождения, биологически активных добавках к пище, применяемых при заболеваниях указанного профиля, состояние и перспективы стандартизации лекарственного растительного сырья, возможностях использования пряно-ароматических и эфирномасличных растений в профилактике заболеваний органов пищеварения.

Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, характеристике используемых при выполнении работы приборов и методов.

Третья глава посвящена изучению спроса, потребности и обоснованию необходимости создания лекарственных растительных средств, применяемых для профилактики и комплексного лечения заболеваний пищеварительной системы в Республике Башкортостан, теоретическому и экспериментальному обоснованию компонентного состава сборов для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения, обеспеченности сырьевой базы лекарственных растений, входящих в состав сборов.

В четвертой главе приведены результаты экспериментальных исследований по фармакогностическому и фитохимическому изучению сборов, интродуцированных пряно-ароматических, эфирномасличных растений, выделению и идентификации биологически активных веществ из сборов, определению характеристик подлинности, разработке методик количественного определения основных групп действующих веществ. Описаны условия получения водных извлечений из сборов с учетом соотношения сырья и экстрагента, измельченности, времени нагревания и настаивания, коэффициента водопоглощения. Предложены критерии подлинности и нормы содержания биологически активных веществ, включенные в нормативную документацию на сборы (проекты фармакопейных статей и технические условия).

Пятая глава включает технологические исследования по разработке рациональных лекарственных форм на основе сборов: сухих экстрактов и лекарственных форм (гель и карандаш) на основе масляного экстракта, а также определению показателей их качества, включенных в технические условия на экстракты.

В шестой главе описаны результаты фармакологических исследований разработанных растительных средств, включающие определение их безопасности, эксперментальное моделирование хронического панкреатита, гепатита, язвенной болезни желудка и дисбактериоза на животных и определение их профилактического и лечебного действия.

В приложении внесены основные документы, подтверждающие внедрение результатов диссертационной работы и некоторые иллюстрационные материалы.

Объектами исследования служило стандартное лекарственное растительное сырье (ЛРС) различных морфологических групп, разрешенное для применения в медицинской практике на территории РФ, из которых были составлены рациональные прописи пяти многокомпонентных растительных сборов. Партии сырья были получены с аптечного склада Государственного унитарного предприятия (ГУП) «Башфармация» и от Общества с ограниченной ответственностью (ООО) «Травы Башкирии».

На основе четырех сборов были разработаны сухие экстракты, а из пятого получен масляный экстракт для приготовления новых лекарственных форм (геля и карандаша). В качестве вспомогательных веществ при разработке лекарственных форм использовали: подсолнечное масло; сополимер стирола с малеиновым ангидридом (ССМА); масло какао; эмульгатор Т-2; эмульсионный воск; пентол; эмульгатор №1; кoллидон CL-M.

Отбор проб для анализа, изучение характеристик подлинности и показателей качества сборов осуществляли, руководствуясь общими статьями ГФ-ХI издания.

В работе использовали реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Макроскопический анализ отдельных видов сырья и сборов проводили в соответствии с указаниями статей ГФ-ХI, вып.1: «Листья» (с. 252), «Травы» (с. 256), «Цветки» (с. 257), «Плоды» (с. 258), «Кора» (с. 261), «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы» (с. 263) и «Сборы» (с. 266).

Микроскопический анализ растительных компонентов и сборов осуществляли в соответствии с указаниями статьи «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» (ГФ XI, вып. 1, с. 277). Определяли диагностически значимые признаки лекарственного растительного сырья и сборов.

Обнаружение и идентификацию биологически активных веществ (БАВ) (полисахаридов, витаминов, флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых и оксикоричных кислот, кумаринов, тритерпеновых сапонинов и др.) проводили с помощью качественных реакций и хроматографических методов исследования: одномерная и двумерная хроматография на бумаге (БХ) (Санкт-Петербургской фабрики № 2 марки «С» и «Filtrak № 11»), в тонком слое сорбента (ТСХ) («Silufol UV-254»), на колонке, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). В эксперименте использовали следующие системы растворителей: для БХ – 2% и 15% раствор уксусной кислоты; н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:2); муравьиная кислота - уксусная кислота - вода (4:1:3). Для ТСХ - гексан - диэтиловый эфир (80:20); бензол - петролейный эфир (1:1); этилацетат - уксусная кислота (80:20); н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5); этилацетат - уксусная кислота - вода (5:1:1); хлороформ – метанол - вода (62:32:7); этилацетат - бензол (1:2); хлороформ - петролейный эфир (1:2).

Электронные спектры выделенных веществ, исследуемых растворов в УФ и видимой областях регистрировали на приборах «Specord-400», «Hitachi» в кюветах с толщиной слоя 10 мм при аналитически значимых интервалах длин волн: для флавоноидов - 240-270 нм и 320-380 нм; для оксикоричных кислот - 310-340 нм. Вещества идентифицировали по спектрам их поглощения в ультрафиолетовой области и в инфракрасной области, характерным сдвигам максимумов поглощения при использовании соответствующих диагностических добавок.

Для хроматографического анализа и разработки методик количественного определения основных групп биологически активных веществ использовали хроматографически чистые вещества и стандарты.

Выокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) анализ фенольных соединений и глицирризиной кислоты проводили на хроматографе «Стайер» (Аквилон, Россия) с УФ-детектором при длине волны 360 нм (для фенольных соединений) и 254 нм (для глицирризиновой кислоты), последующей обработкой результатов исследования с помощью программы МультиХром для «Windows». В качестве неподвижной фазы использовали обращено-фазную металлическую колонку Luna C18 длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненную адсорбентом Phenomenex (США) с диаметром частиц 5 мкм. Анализ проводили методом градиентного элюирования при комнатной температуре. Градиентная подача ацетонитрила проходила с 0 до 70% в 0,2% водном растворе трифторуксусной кислоты за 30 минут с объемной скоростью 1 мл/мин (для фенольных соединений) или ацетонитрила (растворитель Б) и воды бидистиллированной (растворитель А) - для глицирризиновой кислоты. Ввод пробы осуществлялся с помощью инжектора с дозирующей петлей 20 мкл. Идентификацию проводили путем сопоставления времен удерживания компонентов смеси и растворов сравнения. Расчет количественного содержания глицирризиновой кислоты производили методом абсолютной калибровки с помощью компьютерной программы и по формуле.

Качественный состав эфирного масла анализировался хромато-масс-спектрометрическим методом. Масло растворяли в гексане и раствор с помощью микрошприца дозировали в газовый хроматограф НР 6890 с масс-селективным детектором НР 5973. Разделение компонентов осуществляли на кварцевой капиллярной колонке (30 м х 0,25 мм х 0,25 μм) на метилфенилсиликоне. Скорость газа носителя (гелия) 1 мл/мин. Температура инжектора 280⁰С, температура интерфейса 290⁰С, температура масс-селективного детектора 230⁰С. Температурная программа: начальная температура колонки 70⁰С (выдержка 4,5 мин); подъем температуры в диапазоне 70 – 170⁰С со скоростью 30⁰С в мин; в диапазоне 170-280⁰С со скоростью 10⁰С в мин. Время выдержки при конечной температуре 10 мин; объем вводимой пробы с помощью автосамплера 1 мкл. Сброс отсутствует. Давление в инжекторе программируется с 8,8 psi до 22,0 psi. Диапазон масс 39 – 350 а.е.м.

Количественное определение содержания основных групп биологически активных веществ проводили с использованием современных физико-химических методов: титриметрических, спектрофотометрических, хроматоспектрофотомет-рических, ВЭЖХ, атомно-адсорбционной спектрометрии.

Для сборов определялась микробиологическая и радиологическая чистота.

Для сухих экстрактов из сборов определяли следующие технологические показатели: влажность, растворимость, насыпную массу, угол естественного откоса, сыпучесть, объемную плотность, содержание тяжелых металлов, количественное содержание действующих веществ: флавоноидов, полисахаридов, дубильных веществ.

Для гелевых композиций с растительным масляным экстрактом определяли агрегативную и кинетическую устойчивость, намазываемость основ, структурно-механические свойства, осмотическую активность, высыхаемость. Для фитокарандашей с масляным растительным экстрактом определяли: значения биодоступности; твердости пластических масс, показатели гелеобразования. В геле и фитокарандашах определяли количественное содержание каротиноидов.

Скрининговые биологические и фармакологическите исследования включали изучение антимикробной, антиоксидантной, противовоспалительной активности, острой токсичности и других видов специфической активности промежуточных и конечных продуктов.

Статистическую обработку экспериментальных данных (Р = 95%) фитохимических и технологических исследований проводили в соответствии с требованиями ГФ-ХI (вып. 1, с. 199) «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний», с использованием критерия Стьюдента, обработку результатов медико-биологических исследований проводили, кроме того, по методу Литчфильда и Уилкоксона, критерию  по В.С. Генесу.