Механизмы регуляции свертывания крови 03. 00. 02 биофизика
Скачать 0.97 Mb.
|
- Навигация по данной странице:
- Общая характеристика работы Актуальность темы.
- Рис. 1. Основные реакции плазменной системы свертывания крови.
- Цель работы
- Научно-практическое значение.
- Основные положения, выносимые на защиту
- Личное участие автора в получении результатов.
- Объем и структура диссертации .
- Содержание работы
- Рис. 2. Связывание факторов X, VIII, IXa с тромбоцитами, активированными увеличивающимися концентрациями тромбина: наблюдение двух субпопуляций.
- Рис. 3. Совместное связывание компонентов внутренней теназы с фосфолипидными везикулами.
- Рис. 4. Динамика полной модели свертывания.
- Рис. 5. Влияние фактора V на зависимость конечного ответа системы от уровня активации.
- Рис. 6. Выявление модулей в системе свертывания крови.
|
На правах рукописи ПАНТЕЛЕЕВ Михаил Александрович
03.00.02 - биофизика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Пущино — 2010 Работа выполнена в Г Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Фазоил Иноятович Атауллаханов Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Евгений Ильич Маевский доктор физико-математических наук, профессор Георгий Теодорович Гурия доктор технических наук Михаил Александрович Ханин Ведущее учреждение: Институт математических проблем биологии РАН Защита состоится 24 марта 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании совета Д002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН. С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН. Автореферат разослан "____" _____________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат физико-математических наук Н.Ф. Ланина Общая характеристика работы Актуальность темы. Свертывание крови представляет собой сложную сеть ферментативных реакций, основой которой служит каскад последовательно активирующих друг друга сериновых протеиназ, охваченный многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей (Рис. 1). Его задача заключается в предотвращении потери крови при повреждениях сосудистой системы. Нарушения работы системы свертывания крови являются, прямо или косвенно, лидирующей причиной смертности и инвалидности в мире. Их диагностика и коррекция затруднены сложностью этого процесса, в котором задействованы десятки белков, взаимодействующих в сотнях реакций друг с другом, с клетками крови и сосудистой стенкой. Наконец, свертывание по самой своей природе является пространственно неоднородным процессом, происходящим на фоне диффузии реагентов и переноса их кровотоком. Препятствием для создания более совершенных методов диагностики и терапии свертывания оказывается плохое понимание его регуляции. В связи с этим представляется актуальным изучение того, как устроена система свертывания крови, и каков вклад каждого из ее компонентов в общую динамику процесса.
Однако, до настоящего момента не предпринималось попыток целиком проанализировать и понять структуру каскада свертывания, систематически и с единых позиций изучить функции его частей. Кроме того, почти все перечисленные результаты предсказаны с помощью сильно упрощенных математических моделей, и предсказания разных авторов во многом противоречат друг другу в зависимости от того, какие реакции включались в такие модели. За редким исключением (Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57), они не проверены на детальных моделях или в эксперименте. Далее, арсенал современных методов системной биологии не содержит стандартных способов анализа сетей реакций, подобных свертыванию. Существуют хорошо разработанные подходы — такие, как анализ метаболического контроля или теория биохимических систем, — для линейных, стационарных, точечных систем реакций. Однако, методология исследования пространственно-неоднородных и нестационарных систем разработана значительно хуже. Таким образом, в настоящий момент существует актуальная проблема исследования регуляции свертывания крови, решение которой осложняется отсутствием подходящих системно-биологических подходов. Цель работы: Выявление и анализ механизмов регуляции свертывания крови. Задачи исследования: 1. Разработка алгоритма анализа сложных, нестационарных, неточечных биологических систем. 2. Построение детальной математической модели свертывания крови; экспериментальное исследование кинетики отдельных реакций и блоков системы свертывания для тестирования модели. 3. Выявление молекулярных механизмов, ответственных за регуляцию процесса свертывания. 4. Применение полученных результатов к практическим задачам — исследованию методов диагностики нарушений свертывания и механизмов действия лекарственных препаратов.
1) Разработан алгоритм анализа сложных сетей биохимических реакций, основанный на применении функционально-ориентированного анализа чувствительности в комбинации с анализом временной иерархии процессов в системе. 2) Построена детальная математическая модель свертывания крови, превосходящая существующие аналоги корректностью описания биохимии свертывания и успешно прошедшая тестирование сравнением с большим набором экспериментальных данных. 3) Показано, что в системе свертывания крови могут быть идентифицированы шесть функциональных модулей и соответствующих им функций. Апробация работы. Работа прошла апробации: 22 июля 2009 г. на заседании семинара Центра теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН и Гематологического научного центра РАМН, 3 августа 2009 г. на заседании семинара "Молекулярное моделирование и разработка биологически активных соединений" Научно-исследовательского вычислительного центра МГУ им М.В. Ломоносова, 16 сентября 2009 г. на заседании проблемной комиссии №6 «Биохимия, биофизика и реология крови» ГУ Гематологического научного центра РАМН, 23 октября 2009 г. на заседании семинара Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. Материалы диссертации доложены автором на следующих конференциях и съездах: конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 24-26 октября 2001 г.; VII-я национальная конференция "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза", Москва, 27-29 марта 2002 г.; I-й Всероссийский съезд гематологов. Москва, 16-18 апреля 2002 г.; Gordon Research Conference on Proteolytic Enzymes & Their Inhibitors, New London, USA, July 7-12, 2002; Vth International Congress on Mathematical Modeling, Dubna, Moscow Region, September 30-October 6, 2002; конференция "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", Пущино, 11-14 ноября 2002 г.; 1-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии", Москва, 5-6 февраля 2003 г.; 48th Annual Meeting of the Biophysical Society, Baltimore, USA, February 14-18, 2004; Workshop 'Mathematical models and methods in biology and medicine', Bedlewo, Poland, May 29 - June 3, 2005; 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference 'The Protein World', Budapest, Hungary, July 2-7, 2005; XXIst Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Geneva, Switzerland, July 6–12, 2007; Workshop on 'Modelling of Blood Diseases', Lyon, France, 5-9 Nov 2007; Gordon Research Conference on Haemostasis, Waterville Valley, USA, June 29-July 4, 2008; 3rd Workshop on Algorithms in Bioinformatics, Moscow, October 7-9, 2008; XXIInd Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis, Boston, USA, July 11-16, 2009. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 65 работ, в том числе 25 статей в реферируемых научных изданиях и 40 работ в материалах конференций и съездов. Личное участие автора в получении результатов. Автором разработана методология исследования сложных сетей биологических реакций; выполнены все представленные экспериментальные и теоретические исследования отдельных реакций свертывания; построена математическая модель и созданы программы для ее решения; осуществлено ее тестирование, исследование, и проведены все представленные расчеты; выполнены эксперименты по влиянию препаратов фактора VIII на пространственную динамику свертывания крови. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 266 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и библиографического указателя, включающего 407 источников, приложений. Содержание работы Во введении показана актуальность исследуемой темы, обозначены основные проблемы в данной области, сформулированы цели и задачи, дана общая характеристика работы. Глава 1 посвящена обзору литературы. Она содержит сведения о системе гемостаза (включая плазменный и тромбоцитарный гемостаз), об основных экспериментальных моделях и методах исследования свертывания крови, о математических моделях свертывания, о методах теоретического анализа сложных биологических систем реакций. Отмечена связь проанализированных работ с предметом исследования диссертации. В главе 2 описываются материалы и методы работы, в том числе: белки и методы их модификации, протоколы выделения плазмы крови и тромбоцитов с помощью центрифугирования и гель-фильтрации, протоколы приготовления фосфолипидных везикул, методы исследования кинетики реакций свертывания и связывания факторов свертывания с фосфолипидными везикулами или тромбоцитами, использованные в работе экспериментальные модели свертывания in vitro — кинетика генерации фибрина в точечной системе и регистрация свертывания крови в пространственно-неоднородной системе. Кроме того, в главе 2 приводится описание математической модели свертывания, разработанной для достижения цели настоящей работы. Она описывает процессы свертывания крови либо в точечной, либо в пространственной системе. В частности, вариант модели для свертывания в точечной системе представляет собой систему из 24 обыкновенных уравнений, выписанных на основании закона действующих масс. Переменными модели служат концентрации шести ферментов (факторы VIIa, IXa, Xa, IIa, XIa, активированный протеин C), шести зимогенов (факторы VII, IX, X, II, XI, протеин C), двух активных кофакторов (Va, VIIIa) и двух их предшественников (V, VIII), двух стехиометрических ингибиторов (AT–III и TFPI), трех белков других классов (TF, фибрин, фибриноген) и трех комплексов (VIIa–TF, VII–TF, Xa–TFPI). Для некоторых видов расчетов, в модель включались иные компоненты: тромбомодулин, комплексы и реакции с его участием; активация тромбоцитов. При построении модели сначала описывались отдельные реакции и простые системы из нескольких очищенных белков, вплоть до достижения согласия с экспериментом. Затем моделируемые системы постепенно усложнялись, постоянно сопоставляясь с экспериментом. Диапазон параметров модели ограничивался экспериментально измеренными значениями. Юстирования констант не проводилось, лишь в некоторых случаях производился выбор между несколькими значениями, сообщавшимися разными группами. Конечная версия модели подверглась проверке путем сравнения с большим набором экспериментальных данных. В точечном случае математическая модель интегрировалась численно с использованием солвера ode45 в MATLAB, версия R2008a (The MathWorks, Natick, MA, USA). Задача интегрирования системы уравнений в частных производных решалась вложенным методом Рунге-Кутты-Фельберга порядка 2(3). Численная схема реализована с помощью программы, написанной на Watcom C/C++ 10.0.
Основные функциональные задачи свертывания, которые использовались в нашем анализе в качестве первого приближения: 1) "Свернуться или не свернуться"; другими словами, распознать место повреждения и сформировать начальный ответ в зависимости от концентрации активатора, размера и формы. 2) Распространиться от места повреждения, т.е. сформировать полноценный трехмерный сгусток, закрывающий место повреждения, а не просто тонкую фибриновую пленку поверх тканевого фактора. 3) Предотвратить неограниченное тромбообразование и локализовать тромб.
Одно из направлений этого исследования связано с выявлением распределения связывания факторов свертывания между активированными тромбоцитами. Для решения этой задачи тромбоциты активировались увеличивающимися концентрациями тромбина (0-100 нМ), и их прокоагулянтная поверхность характеризовалась по связыванию флуоресцентно меченных факторов X, VIII, IXa или аннексина V (маркера, связывающегося с фосфатидилсерином) с помощью проточной цитометрии. В присутствии факторов свертывания наблюдались две субпопуляции активированных тромбоцитов, которые на порядки отличались друг от друга по уровню связыванию факторов свертывания (Рис. 2). Взаимодействие с высокосвязывающей субпопуляцией являлось специфическим и кальций-зависимым. Количество тромбоцитов с высоким связыванием росло с увеличением концентрации тромбина.   
Рис. 3. Совместное связывание компонентов внутренней теназы с фосфолипидными везикулами. Факторы свертывания в указанных концентрациях инкубировались с фосфолипидными везикулами (5 мкМ) при 37ºC на протяжении 15 мин. (А) Связывание фактора VIII в отсутствие других факторов (□) или в присутствии 10 нМ фактора IXa-EGR (○), 100 нМ фактора X (∆), обоих факторов IXa-EGR и X (  ), или при активации 1 нМ тромбина (■). Сплошные линии показывают аппроксимацию экспериментальных данных стандартной гиперболической функцией связывания. (Б) Связывание фактора IXa-EGR: в отсутствие других факторов (□) или в присутствии 10 нМ фактора VIII (○), 100 нМ фактора X (∆), или же обоих факторов VIII и X (). Вложенная панель показывает специфическое связывание IXa в присутствии других факторов. (В) Связывание фактора X: в отсутствие других факторов (□) или в присутствии 10 нМ фактора IXa-EGR (○), 10 нМ фактора VIII (∆), факторов IXa-EGR и VIII (), 10 нМ фактора VIIIa (▲), или факторов IXa-EGR и VIIIa (▼).
Далее, чтобы изучить взаимодействие компонентов внутренней теназы на фосфолипидной мембране, мы исследовали связывания меченных флуоресцеином факторов VIII, VIIIa, IXa-EGR и X (в различных комбинациях с немеченными факторами) с фосфолипидными везикулами, используя проточную цитометрию. Характерные кривые связывания представлены на Рис. 3. Влияние фактора VIIIa на связывание факторов IXa и X, а также данные кинетических исследований показывают, что фактор VIIIa служит "якорем" для факторов IXa и X. Затем мы продемонстрировали, что формирование комплекса VIIIa-X существенно для функционирования внутренней теназы; это было выполнено путем сравнения фактор VIIIa-зависимого связывания фактора X с фосфолипидными везикулами и активации фактора X. Наиболее вероятным механизмом такой регуляции представляется доставка фактора X к мембране. Ранее фактору VIIIa приписывались две функции в активации фактора X: увеличение каталитической константы и увеличение количества фермента на мембране. Наши данные показывают, что в дополнение к этим функциям фактор VIIIa увеличивает концентрацию фосфолипид-связанного субстрата. В качестве заключительного шага по моделированию комплекса внутренней теназы, мы разработали математические модели активации фактора X комплексом IXa-VIIIa на фосфолипидных везикулах и на тромбоцитах, основанные на детальном учете биохимических механизмов и дающие количественное описание экспериментальных данных. Мы получили уравнение для скорости активации фактора X внутренней теназой в "тромбоцитарной" модели:  , (1)
где [XM], [VIIIaM], [IXaM] даются уравнениями:  , (2)
 , (3)
 . (4)
Отдельного исследования также потребовало описание системы реакций внешнего пути свертывания. Главный регулятор внешней теназы, ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) принадлежит к семейству ингибиторов типа Куница. Свободный TFPI связывает VIIa медленно и слабо по сравнению с фактором Xa, но комплекс Xa–TFPI способен хорошо связывать VIIa–TF, формируя ингибиторный комплекс Xa–TFPI–VIIa–TF. Поэтому ранние работы предлагали двухшаговый механизм действия TFPI: TFPI сначала связывает Xa, а затем комплекс Xa–TFPI связывает VIIa–TF, полностью ингибируя его активность. Однако, позднее стало известно, что этот общепринятый двухшаговый механизм действия TFPI не может объяснить экспериментальные данные по кинетике ингибирования комплекса VIIa–TF. Для объяснения противоречия Баух и соавторы (J Biol Chem 1998; 273: 4378-4386) предположили, что основным путем ингибирования является ингибирование фермент-продуктного комплекса Xa–VIIa–TF при участии TFPI, но предложенная схема исследована не была. Поэтому мы исследовали механизм ингибирования активации фактора X при участии TFPI. Были построены и проанализированы модели различных реакционных схем, и предложены гипотезы, объясняющие экспериментальные данные.
Свертывание в плазме, активированной 5 пМ TF, моделировалось в компьютерном эксперименте. Обозначения: н.с., нет свертывания; н.п., неприменимо. Компоненты считались необходимыми, если в их отсутствие не происходило свертывания; существенными, если Δtclot для них превышал 0.10; контролирующими, если
3.3. Редукция модели с использованием временной иерархии процессов. Система была обезразмерена, и были произведены оценки малых параметров при производных. Сравнение их значений показывает, что большинство переменных в системе либо быстрые (ε<<1), либо медленные (ε>>1) в используемой временной шкале, если TF находится в пикомолярном диапазоне. Исключениями являются концентрации пула TF (x3p), фактора Va (x5) и тромбина (x2), хотя при достаточно малом TF (0.01 пМ и меньше) тромбин тоже становится быстрой переменной. Таким образом, наиболее общая версия редуцированной модели состояла из трех уравнений:  (5)
Здесь ai и bi суть параметры. Для низких концентраций TF тромбин тоже становился быстрой переменной, и система имела точное решение:  (6)
3.4. Динамика полной точечной модели свертывания. Проекция фазового пространства на плоскость x3p-x2 показана на Рис. 4. Единственной точкой пересечения изоклин является ноль, устойчивое стационарное состояние. Ответом системы на добавление активатора x3p всегда является импульс тромбина, заканчивающийся возвращением в начало координат. Амплитуда импульса является резко нелинейной функцией уровня активации, как видно из полулогарифмического графика на панели Б: при увеличении TF с 0.03 до 0.04 пМ максимальная концентрация тромбина, достигаемая на изоклине  , увеличивается более чем три порядка. Из-за исчерпания предшественников в системе не видно истинной бистабильности, но поведение тромбина в области этого скачка концентраций похоже на поведение в области седла, которое можно выявить при редукции.
 
Рис. 4. Динамика полной модели свертывания. Показана проекция фазового пространства полной модели на плоскость x3p-x2 в линейном (А) или полулогарифмическом (Б) масштабе. Изоклины и  показаны как толстые черная и серая линии, соответственно. Направления фазовых траекторий показаны короткими толстыми стрелками. Тонкие пунктирные линии показывают фазовые траектории при высокой концентрации TF, когда начинает играть роль расход неактивных факторов-предшественников.
3.5. Механизм переключения в системе свертывания. Рассмотрим конечную плотность сгустка на больших временах. В этом случае концентрация фибрина в редуцированной модели будет: Фибрин:  (7)
На Рис. 5А показаны результаты расчетов с использованием как полной, так и редуцированной моделей, дающие эту экспоненциальную зависимость.  
Рис. 5. Влияние фактора V на зависимость конечного ответа системы от уровня активации. Теоретическая (А, Б) зависимость финальной плотности сгустка (спустя 5 часов) от концентрации TF, добавленного в нормальную (А) или дефицитную по фактору V (Б) плазму. Сплошные линии представляют собой расчеты с помощью полной модели, а пунктирные — расчеты, основанные на формулах редуцированной модели. Вставка на панели Б сравнивает кривые для полного (0%) и частичного (1%) дефицита фактора V. Если мы примем во внимание, что а) концентрация фибрина лимитирована концентрацией фибриногена, б) существует пороговая концентрация фибрина, требуемая для желирования плазмы, в) прочность сгустка возрастает с увеличением концентрации фибрина, то гладкая экспонента на практике превратится в порог. При TF<0.03 пМ свертывания не видно (менее процента фибриногена перешло в фибрин, при TF >0.04 pM свертывание уже достигло максимума. Таким образом, диапазон концентраций TF, где сгусток непрочен, становится минимальным. Редуцированная модель позволяет нам заключить, что причиной такого переключения является активация фактора V тромбином (Рис. 4Б). 3.6. Роль внутренней теназы в пространственной динамике свертывания крови. Попробуем вкратце рассмотреть регуляцию двух других задач — пространственного распространения и локализации свертывания. Формирование фибринового сгустка определяется тромбином. Лимитирующим компонентом протромбиназы является фактор Xa, который, в свою очередь, производится под действием внешней либо внутренней теназы. Мы предприняли попытку различить вклады этих реакций в пространственной фазе роста сгустка, используя модель. Зависимости размера сгустка от времени и скорости роста сгустка от концентрации фактора VIII показывают хорошее согласование модели и эксперимента. С помощью модели был проанализирован механизм наблюдавшегося эффекта нарушения пространственного формирования сгустка. Мы отдельно построили зависимости от времени и координаты для фактора Xa, произведенного внешней теназой, внутренней теназой, и обеими. В то время, как активированный внешней теназой фактор Xa расположен вблизи от активатора и быстро ингибируется, активированный внутренней теназой фактор распространяется вдаль от активатора и определяет формирование сгустка. 3.7. Роль фактора XI в пространственной динамике свертывания крови. Чтобы определить относительный вклад внешней теназы и фактора XIa в формирование фактора IXa, были проведены исследования в плазме, дефицитной по фактору XI. Эксперименты и расчеты производились в соответствии с экспериментами в плазме, дефицитной по фактору VIII, с тем исключением, что для активации использовались макрофаги, несущие значительно меньше TF, чем фибробласты. Не только фаза инициации, но и фаза распространения свертывания практически не отличается в норме и в отсутствие фактора XI. Только после 25-30 мин, на расстоянии ~0.7 мм от активатора, появляется разница (в отсутствие фактора VIII она возникает после 5-10 мин и на расстоянии ~0.3 мм). 3.8. Остановка роста сгустка при участии протеина C. Влияние эндотелия на свертывание крови в математической модели имитировалось добавлением в систему тромбомодулина (от 100 до 3 нМ). Расчеты предсказали, что это ведет к остановке роста сгустка на расстоянии 0.2-1 мм от активатора, в зависимости от концентрации тромбомодулина. На основании этих расчетов были проведены эксперименты, результаты которых совпали с предсказаниями модели. При средних концентрациях (10 нМ), тромбомодулин не влиял на инициацию свертывания, но останавливал его неограниченное распространение. Добавление тромбомодулина вело к производству высоких концентраций активированного протеина С комплексом тромбин-тромбомодулин. Он быстро распространялся от активатора, уничтожая все следы активного фактора V в плазме и предотвращая дальнейшее формирование и распространение тромбина. 4. Практические приложения исследований по регуляции динамики свертывания крови. Описанные выше исследования регуляции свертывания крови позволили сформулировать ряд предположений, которые могут иметь практическую значимость: о роли различных реакций свертывания в точечных и пространственно-неоднородных системах, о механизмах распространения и остановки тромбов, об управляющих реакциях в системе. Кроме того, в процессе работы разработана детальная математическая модель, которая может быть использована для анализа и предсказания результатов экспериментов. В последнем разделе работы мы использовали созданные инструменты и полученные результаты для анализа механизмов действия лекарственных препаратов. 4.1. Пространственная динамика свертывания крови при гемофилии A: Koate DVI. Для того, чтобы исследовать влияние заместительной терапии препаратом Koate DVI при гемофилии А на пространственную динамику свертывания, были проведены две серии экспериментов. В одной из них анализировались образцы плазм от пациентов, проходивших терапию препаратом Koate DVI в Гемофилическом центре Гематологического центра РАМН. Тяжелому больному гемофилией А (активность фактора VIII<1%) вводился препарат Koate DVI (40 Ед/кг), затем на протяжении суток у больного брались пробы на активность фактора VIII (определение производилось в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН) и на исследования скорости роста сгустка. Пробы обрабатывались и исследовались, как описано в методической главе. Затем для каждого эксперимента строились профили светорассеяния и рассчитывалась скорость роста сгустка. Далее, для того, чтобы оценить эффект Koate DVI, мы добавили этот препарат в плазму больного гемофилией А (VIII:C<1%). При концентрации Koate DVI меньшей, чем 1-5 мкг/мл, улучшающего эффекта на скорость роста сгустка не наблюдалось. Скорость роста сгустка росла по мере увеличения концентрации Koate DVI; при концентрации, равной 20 мкг/мл, скорость роста нормализовалась и не менялась дальше при увеличении концентрации вплоть до 625 мкг/мл. Эти сведения хорошо согласуются с клиническими представлениями о связи концентрации фактора VIII с активностью системы свертывания. Они могут быть использованы для выявления склонности к кровотечению и назначению индивидуальной терапии и дозировки препарата.
В первой серии исследовалась фармакокинетика Агемфила А. Препарат переливался тяжелым больным гемофилией А в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН, и на протяжении 30 часов брались пробы крови и исследовалась динамика роста сгустка. Параллельно в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН те же пробы крови исследовались на активность фактора VIII. Всего было проведено 4 опыта по фармакокинетике Агемфила А на 4-х разных пациентах, давших согласующиеся результаты. Во второй серии экспериментов препарат добавлялся в разных концентрациях непосредственно в плазму перед наблюдением за скоростью роста сгустка. Для того, чтобы оценить эффект Агемфила А, мы протитровали плазму больного гемофилией А (VIII:C<1%) этим препаратом. В фармакокинетическом исследовании Агемфила А скорость роста сгустка хорошо коррелировала с активностью фактора VIII. Однако, несмотря на то, что активность фактора к концу 30-часового периода падала до ~10% от нормы, скорость роста сгустка оставалась довольно высокой (~25 мкм/мин, т.е. более 50% от нормы). В эксперименте по титровке препарата, при концентрации препарата скорость роста сгустка в зависимости от концентрации препарата росла линейно в полулогарифмической шкале. Выводы из этого исследования согласуются с полученными при работе с Коэйтом DVI. 4.3. Механизм действия активированного фактора VII. Активированный фактор VII был впервые применен в клинике в начале 1980-х годов как средство для улучшения гемостаза у больных гемофилией, имевших ингибиторные антитела. В настоящий момент разными авторами были предложены две гипотезы о его предпочтительном пути действия. Одна предполагает, что действие препарата преимущественно TF-зависимо, вторая — что оно не зависит от TF и определяется взаимодействием с фосфолипидами. Мы использовали математическую модель, чтобы проанализировать этот вопрос. Была рассчитана зависимость времени свертывания и максимума тромбина от концентрации добавленного фактора VIIa, при этом в одной из серий расчетов TF-независимый механизм был отключен. Модель предсказала два принципиально разных варианта: если эти реакции не существуют, то при увеличении VIIa выше 10 нМ никакого увеличения максимума тромбина не будет; а если существуют, то будет. Эксперименты, выполненные параллельно с расчетами, показали, что справедливо второе предположение, и TF-независимые реакции вносят значительный вклад в генерацию тромбина. Во втором теоретическом эксперименте мы моделировали генерацию тромбина, отключая каждый из механизмов (TF-зависимый или TF независимый). Эффект в сильнейшей степени определялся условиями моделируемого эксперимента. При высокой концентрации TF (100 пМ) работал TF-зависимый механизм. Если же отключался TF-независимый механизм, то эффект VIIa почти не падал. В то же время при низком TF (1 пМ) вклад TF-независимого механизма был преобладающим. Наши результаты позволяют предположить, что TF-независимый механизм вносит заметный вклад в нормализацию свертывания, особенно при малой активации или вдали от активатора. Этот вывод может иметь значение при принятии решения о применении препарата и планировании дозировки.
Целью данного исследования было систематически разобраться в механизмах, регулирующих сложную сеть реакций свертывания крови, выявить функции различных частей этой системы и понять ее устройство. В качестве основного инструмента при ответе на поставленные вопросы было выбрано математическое моделирование, используемое в комбинации с экспериментами. Необходимость детального изучения отдельных реакций и подсистем свертывания при построении модели, необходимость последующей проверки модели, попытки применения модели и выводов работы к разным практическим задачам привели к тому, что в процессе ответа на основной вопрос нами были проведены вспомогательные исследования. Это способствовало получению полезных побочных результатов, начиная с выявления молекулярных подробностей механизма сборки мембранно-зависимого комплекса внутренней теназы и заканчивая фармакокинетикой препаратов факторов крови. Главные новые результаты работы можно представить наглядно в виде Рис. 7. На нем показана система свертывания, разбитая на модули, отвечающие за отдельные задачи. Ниже приведен список таких модулей и их функций с указанием того, были ли данные модули о их функции очерчены в настоящей работе или же в работах других исследователей: 
Рис. 6. Выявление модулей в системе свертывания крови. Ключевые результаты настоящего исследования и их место в современных представлениях о регуляции свертывания можно наглядно представить с помощью этой схемы. Можно выявить шесть модулей, ответственных за шесть подзадач. 1) Основной каскад: роль скорее структурная, а не регуляторная (настоящая работа). 2) Полимеризация фибрина: порог (другие исследования и настоящая работа). 3) Петля положительной обратной связи, активация фактора V: переключение (настоящая работа). 4) Петля положительной обратной связи, активация фактора VII фактором Xa: регуляция потоком крови (другие исследования). 5) Петля положительной обратной связи, активация факторов VIII и XI: пространственное распространение (другие исследования и настоящая работа). 6) Петля отрицательной обратной связи, путь протеина C: пространственная локализация (настоящая работа). В процессе этой работы нами было создано значительное количество инструментов и методологических приемов, которые могут быть полезными для специалистов по теоретической, математической, системной биологии. Некоторые из них (модель свертывания в целом) имеют более узкую область применимости, другие (модели мембранно-зависимых реакций) могут оказаться полезными за пределами свертывания. С нашей точки зрения, самым значимым методологическим результатом этой работы является разработка и формулировка общего подхода к анализу биологических сетей произвольной сложности. Он базируется на фундаментальной гипотезе о модульной функциональной структуре этих сетей и задействует в качестве основных инструментов детальное математическое моделирование, анализ чувствительности и анализ временной иерархии процессов. С точки зрения системной биологии, свертывание крови оказывается интересным и необычным примером регуляции. Эта сложная сеть реакций содержит пять важных обратных связи, которые используются для выполнения широкого круга регуляторных функций. С точки зрения гемостазиологии, наш анализ предполагает значительный терапевтический потенциал специализированного фармакологического воздействия на отдельные модули этой системы. Современные терапевтические и диагностические стратегии в свертывания обычно основаны на предположении, что воздействия лекарств является грубо про- или антикоагулянтным, без учета сложности ответа сети; и в результате лечение тромбоза может привести к опасности кровотечения. Если бы мы смогли специфически регулировать отдельные блоки в свертывании, отдельно управляя порогом или чувствительностью к потоку, то терапия свертывания получила бы мощное средство лечения тромбозов и кровотечений. Можно надеяться, что результаты настоящего исследования позволят сделать шаг в этом направлении.
Каталог: common -> img -> uploaded -> files -> vak -> announcements -> fiz mat announcements -> Экстрапинеальный мелатонин в процессе старения 14. 00. 53 геронтология и гериатрия announcements -> Социальная культура здравоохранения в российском обществе начала ХХI века: проблемы и пути их решения announcements -> Социальные представления о здоровье и болезни: структура, динамика, механизмы. 19. 00. 05 Социальная психология announcements -> Фундаментальные аспекты создания на основе минерала бишофит магний-содержащих лекарственных средств 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология announcements -> Научное обоснование совершенствования организации, планирования и финансирования амбулаторно-поликлинической помощи в крупном городе 14. 00. 33 общественное здоровье и здравоохранение announcements -> Преимущество антиоксидантов над ингибиторами протеаз в лечении острого панкреатита и профилактике его осложнений (Экспериментально-клиническое исследование) 14. 00. 27 хирургия announcements -> Инновационная разработка комбинированных глазных капель на базе информационных технологий 15. 00. 01 Технология лекарств и организация фармацевтического дела announcements -> Роль медико-социальных факторов в формировании здоровья детей подросткового возраста и пути совершенствования профилактической помощи 14. 00. 33 «Общественное здоровье и здравоохранение» 14. 00. 09 fiz mat -> Математической моделирование гемодинамики fiz mat -> Линейный анализ распространения пульсовых волн в сердечно-сосудистой системе Скачать 0.97 Mb. Поделитесь с Вашими друзьями:
|
ематологическом научном центре РАМН и
рассчитывались для каждого параметра R. Это позволило судить о том, какие процессы регулируют формирование фибрина. Таблица 1 содержит примеры значений Δtclot и 
для концентраций компонентов системы свертывания.
превышал 0.10.