ПРИМЕР ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

комплемента,

разведенного

1:10   

комплемента - 0,08 мл. Следует учитывать, что расчет рабочей дозы комплемента (соответственно, 1-

ой или 2-х полных единиц) необходимо проводить исходя из результатов титрования в присутствии

антигена. В том случае, если при титровании комплемента per se и в присутствии антигена получены

однозначные результаты, при последующих постановках РСК с этой серией диагностикума можно

ограничиться титрованием комплемента.

(два ряда) исследуемой сыворотки в объеме 0,1 мл, начиная с разведения 1:4. К каждому разведению

первого ряда добавляют по 0,1 мл специфического диагностикума и 0,1 мл комплемента, взятых в

рабочей дозе; к разведениям второго ряда - по 0,1 мл комплемента и 0,1 мл контрольного

диагностикума, также в рабочем разведении.
Аналогичным образом готовят разведения гомологичной иммунной сыворотки (3 и 4 ряд).
Панели тщательно встряхивают и оставляют при +4 °C на 16 - 18 часов. После чего реакцию

выдерживают 1 час при комнатной температуре, а затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл

гемолитической системы, предварительно инкубированной при +37 °C в течение 30 минут. После

тщательного встряхивания панели ставят в термостат при +37 °C до завершения гемолиза в

контролях. Затем панели вынимают из термостата и через час проводят окончательный учет реакции
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
(по системе "4+"). Реакция считается положительной при наличии задержки гемолиза не менее чем

на 3+. Основной опыт можно также ставить при +37 °C в течение 1 часа 40 минут - до добавления

гемолитической системы 1 час, после добавления - 40 минут. При этой модификации может

наблюдаться снижение чувствительности реакции.

сыворотки + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе, взятой в опыт.

взятого в опыт, + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента.

физиологического раствора + 0,1 мл комплемента.

соответствующего разведения сыворотки + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента.

комплемента, + 0,2 мл физиологического раствора.

гемолитической системы.

равнозначны опытным рядам.

должна быть задержка гемолиза на 4+, контроль 5 - 0,5 дозы - задержка гемолиза на 2+.

(специфический) диагностикум в присутствии гомологичной сыворотки должен вызывать задержку

гемолиза не менее чем на 3+.
За титр испытуемой сыворотки принимают то ее наибольшее разведение, которое в

присутствии специфического диагностикума обусловливает задержку гемолиза на менее чем на 3+.

используют в реакции в объеме 0,025 мл.

режима работы с возбудителями особо опасных инфекций. Работающий должен быть одет в

спецодежду. (Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или

подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I - II группы (Утв. МЗ

СССР 29.06.1978)).
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
2.2. Сбор и транспортировка материала.
2.2.1. Материал для выделения возбудителя орнитоза.
Для выделения хламидий берут кровь, мокроту (желательно до антибиотикотерапии), а в случае

секции - кусочки органов (печень, легкое, селезенка), плевральный экссудат.

бусами, дефибринируют и в том же флаконе пересылают в лабораторию.

назначают отхаркивающие или делают смыв из зева стерильной дистиллированной водой.

закрывают притертыми или резиновыми пробками.

пеналах (контейнерах). Если транспортировка будет продолжаться более 1 часа, необходимо

обеспечить охлаждение материала. В пеналы следует вложить углекислоту или поместить их в

термосы со льдом. Оптимальным является хранение и пересылка материала в сосудах Дюара с

жидким азотом.
2.2.2. Материал для серологического обследования.
Исследуемым материалом служит сыворотка крови. Взятие и транспортировка материала - см.

1.2.3.
2.3. Выделение хламидий.

дополнительной обработки.

антибиотиков: стрептомицина 500 ед. мл или р-ра Хенкса или фосфатном буферном растворе pH 7,0 -

7,2. Приготовленную взвесь помещают на 1 - 2 часа в холодильник при +4 °C. Образовавшуюся

надосадочную часть взвеси обрабатывают антибиотиками и вновь помещают в холодильник. Спустя

3 часа проводят заражение лабораторных моделей.
2.3.2. Заражение куриных эмбрионов (см. 1.4.1).
2.3.3. Заражение белых мышей (биопроба).
Исследуемый материал вводят белым мышам массой 6 - 7 г в мозг или внутрибрюшинно,

соответственно, по 0,03 мл и 0,2 мл. Слепые пассажи проводят через 6 - 7 дней, используя для этого

10% взвеси мозговой ткани или селезенки и печени - в зависимости от способа заражения.
2.3.4. Идентификация возбудителя орнитоза.
Первичную идентификацию возбудителя орнитоза проводят на основании обнаружения его

типичных морфологических структур (элементарные, ретикулярные тельца, цитоплазматические

включения) и определения в составе выделенного микроорганизма родоспецифического

хламидийного антигена. Для этого готовят мазки-отпечатки из желточных мешков куриных

эмбрионов и органов белых мышей, которые окрашивают традиционными способами по

Романовскому-Гимзе, Маккиавелло, акридином оранжевым, а также люминесцирующими поли- и

Обнаружение типичных элементарных телец, цитоплазматических включений и

родоспецифического хламидийного антигена является основными критериями диагностического

выделения возбудителя орнитоза.

монослойные культуры различных клеток (куриные фибробласты, Hela и др.), выращиваемых на

покровных стеклах в плоскодонных стаканчиках. При наличии микроорганизма в исследуемом

материале, через 36 - 48 - 72 часа после заражения монослоя клеток, в окрашенных вышеуказанными

способами препаратах определяются цитоплазматические включения, содержащие морфологические

структуры и антигены возбудителя орнитоза.

традиционными методами, описанными в руководствах по медицинской и ветеринарной

микробиологии и гистологии.
Мазки-отпечатки желточного мешка куриных зараженных эмбрионов лучше окрашивать

методом Маккиавелло (см. 1.4.1), позволяющим дифференцировать морфологические структуры

хламидий от желточного материала и детрита.
Мазки-отпечатки тканей биопробных животных (белых мышей), соответствующих пути

заражения, окрашивают аналогично по Маккиавелло либо по Романовскому-Гимзе (см. 1.4.1, 1.3.1).

ретикулярный - фиолетово-синие (во включении).

кислоты);

pH 3,8
в  3-х  сменах  (буферный  раствор Мак-Ильвейна - pH 3,8 - 4,0;

раствор А -
21,0  г  кристаллической лимонной кислоты растворить в 1 л

дистиллированной

в 1 л
                                                   2   4

77,1 мл
раствора Б);

краски на препарат);

покровным стеклом, которое заливают по краям смесью парафина с воском (1:1), монослой клеток на

покровном стекле монтируют на предметном стекле (клетками вниз) тем же способом;
- просматривают препараты в люминесцентном микроскопе со светофильтрами ФС-1-2 и ФС-

1-4. Цитоплазматические включения люминесцируют ярко-красным (мелкие), желто-зеленым или

зеленым (крупные) цветом. Элементарные тельца имеют ярко-зеленую окраску.
2.3.4.3. Окраска препаратов люминесцирующими хламидийными антителами.
2.3.4.3.1. Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ).
ПИФ-метод (см. 1.3.2.1) используют для обнаружения антигенов возбудителя орнитоза в

различном исследуемом материале: мазки-отпечатки, соскобы, культура клеток и др.

орнитоза при отсутствии люминесцирующих хламидийных антител и наличии сыворотки (человека,

животных), содержащей антитела к родоспецифическому антигену хламидий или моноклональных

антител к родоспецифическому антигену хламидий.

поверхность соответственно правого и левого предплечья.

инфильтрата:

эритроцитов, с гомологичными антителами, приводящем к специфической агглютинации

эритроцитов.
РНГА ставят с родоспецифическим эритроцитарным орнитозным диагностикумом (готовится к

выпуску Пермским НПО "Биомед" Минмедпрома СССР), что дает возможность использовать ее при

антропонозных и зоонозных хламидиозах. Реакция выявляет относительно кратковременно

циркулирующие в крови хламидийные антитела, что существенно облегчает оценку ее результатов

даже при однократном исследовании сывороток или при отсутствии нарастания титра антител в

процессе заболевания.

больных острыми формами хламидийной инфекции в конце первой, начале второй недели

заболевания, достигают максимума на 3 - 4 неделе, после чего уровень их снижается. Через 3 - 5

месяцев после заболевания эти антитела обычно исчезают. При "генерализованных" формах

урогенитальной хламидийной инфекции диагностическими следует считать титры 1:160 и выше, при

"локализованных" - показатели РНГА 1:40 могут служить подтверждением клинико-

эпидемиологического диагноза.
РНГА особенно целесообразно использовать при различных хламидийных антропонозах в

качестве скринингового теста для более углубленного последующего целенаправленного

обследования на хламидиоз.
Обнаружение антител у больных орнитозом в титре 1:160 служит основанием для постановки

диагноза при наличии соответствующих клинико-эпидемиологических данных. В некоторых случаях

(обследование в поздние сроки - 3 - 4 недели, проведение антибиотикотерапии) и меньшие титры

антител, выявляемые РНГА (1:40 - 1:80), могут служить подтверждением клинического диагноза

соответствующей эпидситуации.
1.1. Ингредиенты реакции
- специфический и контрольный эритроцитарный диагностикумы;
- исследуемая и гомологичная иммунные сыворотки;
- физиологический раствор pH 7,0 (8,5 г х.ч. - хлорида натрия на 1 л бидистиллированной

воды);
- физиологический формалинизированный раствор pH 7,2 - 7,4 (физ. раствор с добавлением

коммерческого формалина 3,0 мл на 1 л).
1.1.1. Диагностикумы.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Специфический и контрольный диагностикумы ресуспендируют каждый в 1 мл

физиологического раствора pH 7,0 - 7,2, тщательно встряхивают до полного растворения.

1 мл на физ. растворе.

разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,4 мл, начиная с разведения 1:40 до 1:2560 (2 ряда).

Сыворотки разводят на формалинизированном физ. растворе pH 7,2 - 7,4 (применение формалина

предотвращает "сползание" специфического агглютинина в лунках при длительном стоянии реакции).

В каждую лунку первого ряда добавляют по 0,01 мл специфического эритроцитарного диагностикума;

второго ряда - по 0,1 мл контрольного эритроцитарного диагностикума. Содержание панелей

тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 - 3 часа, после чего считывают

результаты реакции.

агглютинации: в 3 лунки, содержащие по 0,4 мл формалинизированного физ. раствора, вносят по 0,1

мл специфического эритроцитарного диагностикума.
2. Заведомо положительный контроль - постановка РНГА с орнитозной иммунной сывороткой.

Готовят последовательные разведения этой сыворотки по 0,4 мл от 1:40 до 1:2560. В каждую лунку

добавляют по 0,1 мл специфического эритроцитарного диагностикума.
3. Контроль контрольного эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной

агглютинации: в 3 лунки, содержащие по 0,4 мл формалинизированного физ. раствора, вносят по 0,1

мл контрольного эритроцитарного диагностикума.
Все условия постановки контролей должны быть равнозначны условиям постановки опыта.
Учет результатов реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов по системе "4+":
4+ - агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по

форме перевернутый купол;

неровным "фестончатым" краем, - осадок неагглютинировавших эритроцитов;

более ровным краем, - осадок неагглютинировавших эритроцитов;

с четким краем;

3+.
За титр исследуемой сыворотки принимают то ее наибольшее разведение, которое еще

вызывает агглютинацию орнитозного эритроцитарного диагностикума не менее чем на 3+.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Контроли 1, 3 должны быть отрицательны. Контроль 2 должен быть положителен. При равном

взаимодействии исследуемой сыворотки со специфическим и с контрольным диагностикумом

реакция оценивается как неспецифическая.
1.2. Микровариант РНГА.
Микровариант РНГА ставят в микротитраторах системы "Такачи" или панелях одноразового

пользования. Разведения сывороток используют в объеме 0,05 мл, а диагностикумы добавляют по

0,01 мл.
2. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ (РНИФ)
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ
Принцип метода основан на взаимодействии антигена со специфическим иммуноглобулином (в

исследуемой сыворотке) и специфической реакции последнего с антииммуноглобулином, меченным

флуорохромом. Образовавшийся комплекс выявляется при люминесцентной микроскопии.
В РНИФ используют экспериментальный хламидийный антиген, (готовится к выпуску

Пермским НПО "Биомед" Минмедпрома СССР), представляющий собой обработанную азидом

натрия и формалином 3 - 5% взвесь оболочек желточных мешков, зараженных соответственно C.

psittaci и C. trachomatis куриных эмбрионов, и антивидовую (против глобулина человека) сыворотку,

меченную флуоресцеинизотиоцианатом (выпускается предприятием НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).
РНИФ характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и является

традиционным методом серодиагностики, эпиданализа урогенитальных хламидиозов. Применение

антигенов 2-х видов хламидий по разнице в титрах антител позволяет дифференцировать

заболевания, вызываемые этими возбудителями. Диагностическим показателем для урогенитальных

хламидийных поражений при наличии соответствующих клинико-эпидемиологических данных

можно считать титры 1:32 - 1:64 и выше с учетом преобладания видоспецифических антител к C.

trachomatis.
Использование антивидовых сывороток к различным классам иммуноглобулинов дает

возможность дифференцировать "свежее" инфицирование (обнаружение ранних IgM - антител) и

выявлять поздние - IgG хламидийные антитела.
Важное диагностическое значение имеет обнаружение хламидийных IgM антител в сыворотке

крови и IgA в секретах половых желез (титры >= 1:8).

нередко выявляют в крови переболевших орнитозом более года.

trachomatis оболочек желточных мешков куриных эмбрионов. Взвесь готовят в ступке на охлажденном

(+4 °C) ФСБР, содержащим для инактивации хламидий 0,1% азида натрия и 0,05% формалина.

Взвесь выдерживают в холодильнике при +4 °C 3 суток, затем ее центрифугируют при 3000 об./мин.

20 минут. Средний слой, содержащий элементарные и ретикулярные тельца микроорганизма,

используют как антиген.

незараженных куриных эмбрионов.

разведения 1:16 на ФСБР.

родамином, разводят каждый в 0,5 мл ФСБР, тщательно встряхивая до полного растворения. Для

определения рабочего разведения люминесцирующей сыворотки приводят ее титрование с

гомологичной иммунной сывороткой.

взятых в равных объемах и удвоенных рабочих разведениях (для контрастирования фона можно

использовать также синьку Эванса в конечном разведении 1:10000).
2.1.3. Методика постановки РНМИФ.
Специфический и контрольный антигены наносят тонким писчим пером в виде "точек" на

чистые обезжиренные предметные стекла, помещенные на трафарет, на котором отмечены точки -

зоны нанесения на предметное стекло используемых антигенов.
Предметные стекла с нанесенными антигенами высушивают на воздухе 10 - 15 минут и

фиксируют в охлажденном ацетоне (+4 °C) 15 - 20 минут.

количеству сывороток и их разведений, наносят пипеткой или бактериологической петлей 10 мкл

соответствующих разведений сывороток, начиная с наибольшего разведения. Препарат помещают во

влажную камеру на 30 - 40 минут при +37 °C; промывают 2 раза по 10 минут в ФСБР. Стекла

подсушивают на воздухе и на группы антигенов, контактировавших с исследуемыми сыворотками,

наносят смесь люминесцирующих сыворотки и бычьего альбумина (по 10 мкл), меченного

родамином. Препарат помещают во влажную камеру на 30 минут при +37 °C; промывают 2 раза по

10 минут в ФСБР; с тыльной стороны стекла карандашом отмечают зоны расположения антигенов;

на группы антигенов наносят забуференный глицерин и заключают под покровное стекло. Просмотр

препаратов проводят в люминесцентном микроскопе при комбинации светофильтров (для ЛМ-2) ФС

1-5; БС 8-2; СЭС 7-2; ЖС-18 с масляной иммерсией.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
За титр исследуемой сыворотки принимают то наибольшее ее разведение, при котором

отмечается четкая зеленая флуоресценция антигенов, связанная с хорошо различимыми

элементарными и ретикулярными тельцами микроорганизма.
Специфичность показателей, получаемых РНМИФ, подтверждается контролями:
- люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека не окрашивает контрольный

антиген, обработанный иммунной к хламидиям человеческой сывороткой;

антигенами возбудителя орнитоза, не обуславливают их окрашивания после обработки

люминесцирующей антисывороткой.
Приложение III
ИНСТРУКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ЛИТЕРАТУРА
1. Инструкция по проведению противоэпидемических и профилактических мероприятий при

орнитозе (утверждена МЗ СССР 18.11.1960 и согласована с Главным управлением ветеринарии

МСХ СССР 12.12.1960).
2. Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или

подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I - II группы

(утверждена МЗ СССР 20.06.78)
3. Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий,

вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического

происхождения (утверждено МЗ СССР 18.05.1979).
4. Наставление по постановке реакции связывания комплемента и непрямой реакции

связывания комплемента с антигеном возбудителя орнитоза (утверждено МЗ СССР 17.02.1976).

23.11.1961).

Покровский. Л., 1983, "Медицина".

Всесоюзного Совещания)/Ред. кол .: А.А. Шаткин и др. М., 1990, 136 с.