Практикум по медицинской микробиологии и вирусологии учебное пособие

(Часть II)

УДК - 579

ББК 52.64

П. 69

Практикум составлен в соответствии с действующей типовой программой по медицинской микробиологии и вирусологии. В учебном пособии приведены краткие сведения о возбудителе, основные методы диагностики инфекционных заболеваний. Он предназначен для самостоятельной подготовки студентов к лабораторным занятиям и освоения практических навыков. В приложении даны типовые ситуационные задачи, тестовые задания для контроля усвоения студентами материала.

Рекомендовано к печати и использованию в учебном процессе ЦКМС ДГМА.
Содержание
Частная микробиология-------------------------------------------------------

Список сокращений---------------------------------------------------------------

Занятие №1. Общая характеристика семейства Enterobacteriaceae.

Микробиологическая диагностика эшерихиозов.--------------------------

Занятие №2. Микробиологическая диагностика брюшного тифа

и паратифов--------------------------------------------------------------------------

Занятие №3. Микробиологическая диагностика брюшного тифа (продолжение). Серологическая диагностика брюшного тифа---------------

Занятие №4. Микробиологическая диагностика сальмонеллезов

пищевых токсикоинфекций----------------------------------------------

Занятие №5. Микробиологическая диагностика дизентерии-------------

Занятие №6. Микробиологическая диагностика холеры------------------

Занятие №7. Итоговое занятие по разделу: Микробиологическая диагностика кишечных инфекций----------------------------------------------------

Занятие №8. Микробиологическая диагностика стафилококковых инфекций. Бактериологическое исследование гноя (1день исследования)---

Занятие №9. Микробиологическая диагностика стрептококковых инфекций. Бактериологическое исследование гноя (2день исследования)---

Занятие № 10. Нейссерии. Микробиологическая диагностика менингококковых и гонококковых инфекций. Бактериологическое исследование гноя (3 день исследования)-------------------------------------------------------

Занятие № 11. Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций. Бактериологическое исследование гноя (заключение)---------------

Занятие № 12. Микробиологическая диагностика дифтерии и коклюша-

Занятие №13. Микробиологическая диагностика туберкулеза-----------

Занятие №14. Микробиологическая диагностика бруцеллеза и сибирской язвы----------------------------------------------------------------------------

Занятие №15. Микробиологическая диагностика чумы и туляремии-----

Занятие №16. Итоговое занятие по темам №№:8-15.----------------------

Занятие №17. Спирохетозы. Микробиологическая диагностика сифилиса-----------------------------------------------------------------------

Занятие №18. Микробиологическая диагностика риккетсиозов, хламидиозов-------------------------------------------------------------------------------

Частная вирусология

Занятие №19. Методы микробиологической диагностики вирусных

инфекций-------------------------------------------------------------------------

Занятие №20. Микробиологическая диагностика острых респираторных вирусных инфекций грипп -----------------------------------------------------

Занятие №21. Микробиологическая диагностика энтеровирусных инфекций. Микробиологическая диагностика полиомиелита--------------

Занятие №22. Микробиологическая диагностика вирусных гепатитов, микробиологическая диагностика, ВИЧ-инфекции-------------------------

Занятие №23. Микробиологическая диагностика герпесвирусных инфекций. Онкогенные вирусы-------------------------------------------------------

Занятие №24. Итоговое занятие по медицинской вирусологии----

Список рекомендуемой литературы---------------------------------------------

Приложение---------------------------------------------------------------------------

АГ – антиген

АТ – антитело

ВГА – вирус гепатита А

ВГВ – вирус гепатита В

ВГС – вирус гепатита С

ВИЧ – вирус иммунодефицита человека

ВПЧ – вирус папилломы человека

ВПГ – вирус простого герпеса

ВУИ – внутриутробные инфекции

ИФА, ИФМ – иммуноферментный анализ, метод

КОЕ – колониеобразующая единица

МПА – мясопептонный агар

МПБ – мясопептонный бульон

ОМЧ – общее микробное число

ОП – оптическая плотность

РА – реакция агглютинации

РН – реакция нейтрализации

РИМ – радиоиммунный метод

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

РНИФ- реакция непрямой иммунофлюоресценции

РПГА (РНГА) – реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации

РТГА – реакция торможения гемагглютинации

РСК – реакция связывания комплемента

ПЦР – полимеразно – цепная реакция

СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита

ЦМВ (CMV) – цитомегаловирус


ЧАСТНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Занятие 1
ТЕМА: ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗОВ.

Цель: изучить биологические свойства кишечной палочки. Методы микробиологической диагностики эшерихиозов.
К кишечной группе инфекций относятся заболевания, заражение при которых происходит через ротовую полость. К ним относятся эшерихиозы, вызванные кишечной палочкой, брюшной тиф, паратифы А и В, дизентерия, пищевые токсикоинфекции, холера.

Возбудители кишечных инфекций в основном относятся к семейству Enterobacteriaceae, включающее более 20 родов. Поражение у человека вызывают бактерии родов Escherichia, Shigella, Salmonella, Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Serratia, Iersinia и другие.

Это грамотрицательные палочки средней величины с закругленными концами, подвижные или неподвижные, спор не образуют, аэробы или факультативные анаэробы, хемоорганотрофы, каталаза-положительные, оксидаза-отрицательные. Кроме родов, включающих классические патогены, возрастает роль условно-патогенных бактерий, часто вызывающих оппортунистические инфекции.

Типовым представителем рода Esherichia является E coli. На средах Гисса или МТС-5У она разлагает все углеводы, кроме сахарозы, до кислоты и газа. Брюшнотифозная и дизентерийные палочки на этих средах разлагают глюкозу, мальтозу и маннит до кислоты без газа, а лактозу и сахарозу не разлагают. На среде Эндо колонии кишечной палочки красные, т.к. они разлагают лактозу, фуксин восстанавливается и окрашивает колонии в красный цвет, а колонии брюшного тифа и дизентерии бесцветные, так как они лактозу не разлагают.

Кишечная палочка Escherichia coli открыта Т. Эшерихом в 1885 году из испражнений грудного младенца. Род представлен грамотрицательными подвижными (перитрихи) палочками средней величины. У большинства представителей есть микрокапсула. Оптимум температуры 37°, ферментируют углеводы с образованием кислоты и газа.

Esherchia входят в состав микрофлоры толстого кишечника (в 1 г испражнений в норме содержится 4 млн.клеток кишечной палочки). Кишечные палочки рассматривают как санитарно-показательные микробы (СПМ) при бактериологическом исследовании воды и пищевых продуктов.

Кишечная палочка – основной возбудитель эшерихиозов у человека, она вызывает кишечные инфекции, поражения мочевыводящих путей, бактериемии, менингиты, сепсис.

Она имеет антигены: липополисахаридные (О-), жгутиковые белковые (Н-), капсульные полисахаридные (К-). Капсульные антигены делятся на группы: А-термостабильный, В и L-термолабильные. Поскольку морфологических различий между патогенными и непатогенными кишечными палочками нет, их дифференцировка основана на различиях в структуре антигена. В настоящее время различают 173 разновидности О-антигена, и 57 Н-антигена.

Кишечные палочки по антигенной структуре разделяют на следующие патогенные серовары:

1. 
   энтеропатогенные
   
2. 
   энтеротоксигенные
   
3. 
   энтероинвазивные
   
4. 
   энтерогеморрагические (табл.1)
   

Для лечения эшерихиозов применяют антибактериальные средства (ампициллин, ко-тримоксазол, норфлоксацин и др.). Специфическую профилактику не проводят. Профилактика коли-инфекций направлена на соблюдение санитарно-гигиенических правил, предупреждение инфицирования продуктов питания, воды и т.д.

При длительном лечении антибиотиками подавляется нормальная микрофлора, рост кишечной палочки и развивается дисбактериоз, для лечения которого применяют: колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол.

Положительная роль кишечной палочки в организме человека:

1. 
   входит в состав нормальной микрофлоры кишечника;
   
2. 
   вырабатывает витамины группы В, К и Е;
   
3. 
   является антагонистом других возбудителей кишечной группы микробов.
   
4. 
   постоянно иммунизирует организм.
   

1. 
   Изучить схему бактериологического исследования испражнений при колиэнтеритах.
   
2. 
   Произвести посев испражнений больного колиэнтеритом ребенка на среду Эндо.
   
3. 
   Изучить на демонстрационном материале выросшие колонии:
   

б) отобрать 10 красных колоний, поставить реакцию агглютинации на стекле со смесью ОВ-коли сывороток и при положительном результате – реакцию агглютинации с типовыми сыворотками,

в) пересеять агглютинабильные колонии на скошенный МПА или среду Ресселя для накопления чистой культуры.

4. Из чистой культуры кишечной палочки:

а) поставить реакцию агглютинации на стекле со смесью ОВ-сывороток,

б) поставить реакцию агглютинации с типовыми сыворотками (О₂₆, О₅₅, О₁₁₁),

в) поставить развернутую реакцию агглютинации с живой и гретой культурой с соответствующей О-сывороткой,

г) определить чувствительность к антибиотикам методом бумажных дисков.

5. На демонстрационном материале произвести учет пестрого ряда или МТС-5У. Учет антибиотикограммы.

6. Составить протокол и дать заключение.

Испражнения

Посев на среду Эндо

I этап

Характер и цвет колоний

Мазок, окраска по Граму

Пересев агглютинабельных колоний на скошенный МПА или среду Расселя

для выделения

чистой культуры

Реакция агглютинации на стекле 10 колоний со смесью

О-коли

III этап

Реакция агглютинации на стекле со смесью

ОK- сывороток

Развернутая реакция агглютинации

Реакция агглютинации с типоспецифическими сыворотками

Посев на пестрый ряд и МПБ

Окончательный ответ

Указания к самостоятельной работе

1. 
   При изучении кишечной группы бактерий необходимо отметить какие роды входят в состав семейства Enterobacteriacеae, представители которого вызывают кишечные заболевания.
   
2. 
   Охарактеризовать сходство и отличие кишечной палочки от возбудителей брюшного тифа, паратифов А,В, дизентерии.
   
3. 
   При посеве испражнений на среду Эндо через сутки на ней вырастают красные колонии с металлическим блеском. В состав среды Эндо входят: МПА, лактоза и обесцвеченный фуксин. При росте кишечной палочки, разлагается лактоза, фуксин восстанавливается и окрашивает колонии в красный цвет. Красные колонии кишечной палочки внешне одинаковы. Для дальнейшего исследования берут выборочно 10 колоний, ставят реакцию агглютинации со смесью О-В сывороток. Колонию, давшую положительную агглютинацию, пересевают на среду Ресселя для выделения чистой культуры. Среда Ресселя представляет короткий пестрый ряд – МПА, лактозу и глюкозу. Кишечная палочка, разлагает и лактозу и глюкозу, и вся среда окрашивается в синий цвет. Для определения чистоты культуры мазки красим по Граму, микроскопируем. С чистой культурой необходимо поставить реакцию агглютинации со смесью ОК-сывороток, отдельно с каждой сывороткой и с сывороткой, давшей положительную реакцию, поставить 2 развернутые реакции с гретой и негретой культурами. Чистую культуру посеять на среды Гисса или МТС-5У для изучения биохимических свойств и на МПБ – для изучения протеолитических свойств.
   

Посевы на средах Гисса и штативы с развернутыми реакциями агглютинации помещают в термостат на сутки при t 37°С.

На средах Гисса или МТС-5У разлагаются глюкоза, мальтоза, маннит, лактоза, а сахароза не разлагается. На МПБ выделяются: сероводород – бумажка, пропитанная уксуснокислым свинцом чернеет; индол – бумажка, пропитанная щавелевой кислотой розовеет; аммиак – красная лакмусовая бумажка синеет.

Идентификацию выделенной чистой культуры проводят на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств.

1. 
   Назовите основные роды семейства кишечных бактерий.
   
2. 
   Какова физиологическая роль кишечной палочки в организме человека?
   
3. 
   Назовите антигены кишечной палочки и укажите их локализацию в бактериальной клетке.
   
4. 
   Укажите морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства кишечной палочки.
   
5. 
   Какие вы знаете патогенные серовары кишечной палочки?
   
6. 
   Какие заболевания вызывают патогенные серовары кишечной палочки?
   
7. 
   В чем особенность бактериологической диагностики коли-энтеритов?
   
8. 
   Назовите препараты, применяемые для лечения колиэнтеритов.
   
9. 
   Почему кишечная палочка является санитарным показателем загрязнения окружающей среды?
   

Это мелкие палочки с закругленными концами, перитрихи, спор и капсул не образуют, грамотрицательны.

Сальмонеллы брюшного тифа и паратифов – факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста для них 37ºС. На МПА образуют круглые, куполообразные, влажные, гладкие S-формы колонии. S.paratyphi B (палочка Шоттмюллера) могут вырастать в виде крупных колоний со слизистым валиком по периферии. На дифференциально-диагностических средах Эндо и Левина колонии сальмонелл бесцветны, с голубоватым оттенком, на среде Вильсон-Блера (висмут-сульфит агар) в результате восстановления сульфита натрия до сернистого натрия – черные или коричнево-зеленые; вызывают равномерное помутнение МПБ. В коротком ряду Гисса сальмонеллы брюшного тифа разлагают глюкозу, мальтозу, маннит до кислоты без газа, а паратифозные палочки – до кислоты и газа.

Сальмонеллы брюшного тифа и паратифа А подкисляют, а паратифа В щелочат лакмусовое молоко. Желатину не разжижают, индола не образуют, продуцируют Н₂S.

Сальмонеллы содержат соматический термостабильный О-антиген, жгутиковый, термолабильный Н-антиген. Общность антигенной структуры приводит к тому, что сальмонеллы брюшного тифа и паратифов агглютинируются не только в гомологичной, но и в родственных антисыворотках. Для того, чтобы исключить перекрестную групповую агглютинацию, готовят монорецепторные сыворотки, содержащие антитела против специфических фракций сальмонелл. Возбудители брюшного тифа и партифов А и В находят по антигенным свойствам по схеме Кауфмана-Уайта.

Источник заболевания – больные люди и носители.

Механизм передачи инфекции: фекально-оральный. Преобладает водный путь передачи, реже встречается пищевой и контактно-бытовой пути.
Таблица 3

Схема патогенеза брюшного тифа

Возможный исход при брюшном тифе:

1. 
   Полное выздоровление;
   
2. 
   Осложнения, связанные с развитием язв-прободения, кишечные кровотечения.
   
3. 
   Переход в бактерионосительство.
   

Исследуемый материал в зависимости от стадии патогенеза (указан в таблице 3).

Питательные среды: желчный бульон, среда Рапопорта (желчный бульон, глюкоза или маннит, индикатор Андреде). Желчь является для сальмонелл благоприятной средой. Дифференциально-диагностические среды Плоскирева, Эндо, Левина.

В зависимости от фазы развития заболевания, методы диагностики различны. На первой неделе заболевания для исследования берут кровь и выделяют гемокультуру. На второй неделе заболевания, когда в крови появляются антитела, ставят реакцию Видаля – развернутую реакцию агглютинации по определению антител в сыворотке крови больного. На третьей неделе заболевания - для подтверждения диагноза на исследование берут испражнения или мочу и выделяют копрокультуру или уринокультуру.

1. 
   Изучить схему бактериологического исследования крови больного брюшным тифом (схема №2).
   
2. 
   Произвести посев крови больного брюшным тифом на желчный бульон или на среду Рапопорта.
   
3. 
   Пересеять культуру со среды Рапопорта на среду Эндо.
   
4. 
   Из бесцветных колоний на среде Эндо приготовить мазок, окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать. Пересеять бесцветные колонии на среду Ресселя или скошенный МПА.
   
5. 
   Изучить чистоту культуры на среде Ресселя или на скошенном МПА. Произвести посевы на МПА для определения чувствительности культуры к антибиотикам методом бумажных дисков, на среды Гисса или МТС-12Е, на МПБ для определения биохимических и протеолитических свойств.
   
6. 
   Произвести реакцию агглютинации на стекле чистой культуры с поливалентными и монорецепторными сыворотками.
   
7. 
   Произвести учет «пестрого ряда» или МТС-5 – 12Е (на демонстрационном материале). Учет антибиотикограммы.
   
8. 
   Составить протокол бактериологического исследования крови больного с подозрением на брюшной тиф и дать заключение.
   
9. 
   Составить схему бактериологического исследования испражнений больного с подозрением на брюшной тиф.
   

Бактериологические исследования брюшного тифа на первой неделе заболевания проходят в несколько этапов.

Среда Рапопорта состоит из мясо-пептонного бульона, 10% желчи, 2% глюкозы или 1% маннита и 1% индикатора Андреде. При росте S. typhi на среде Рапопорта отмечается помутнение, покраснение, газа нет. При росте . S.paratyphi А и В, среда покраснеет, в результате образования газа всплывает поплавок.

С чистой культурой ставят ориентировочную реакцию агглютинации с диагностическими агглютинирующими сыворотками брюшного тифа, паратифов А и В. С сывороткой, давшей положительную реакцию агглютинации, ставят развернутую. Чистую культуру высевают на среды Гисса или МТС-5У для определения биохимических свойств, на мясопептонный бульон – протеолитических свойств, на МПА – для определения чувствительности к антибиотикам и определения отношения к брюшнотифозному бактериофагу.

1. 
   Назовите возбудителей брюшного тифа и паратифов.
   
2. 
   Чем отличаются сальмонеллы брюшного тифа от сальмонелл паратифов А и В по биохимическим свойствам?
   
3. 
   Какова антигенная структура возбудителя брюшного тифа?
   
4. 
   Особенности патогенеза брюшного тифа (стадии заболевания).
   
5. 
   Какой материал берется у больного для ранней диагностики брюшного тифа и как этот материал исследуется?
   
6. 
   Каков состав среды Рапопорта?
   
7. 
   Какой материал берется для бактериологического исследования у больного с подозрением на брюшной тиф на 3-4 неделях заболевания?