Методические разработки к практическим занятиям по иммунологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов

ГБОУ ВПО «Дагестанская государственная медицинская академия» МЗ РФ

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Методические разработки к практическим занятиям по иммунологии для студентов лечебного и педиатрического факультетов

Махачкала 2013
Составители: Саидов М.С. – зав.кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, к.м.н., доцент; д.б.н., проф. Омарова С.М., к.м.н., доценты - Царуева Т.В.,Гаджиева А.Д., к.м.н., ассистенты Алиева А.И., Саидова Б.М., Исаева Р.И.

Рецензент: зав. кафедрой патологической физиологии д.м.н., профессор Саидов М.З.

Пособие рекомендовано ЦК МС ДГМА для использования в учебном процессе (протокол №_____ от «___»_________________2013г.)

1. 
   Современное понятие иммунитета.
   
2. 
   Виды иммунитета.
   
3. 
   Врожденный иммунитет(неспецифическая резистентность). Факторы.
   
4. 
   Клеточные факторы врожденногоиммунитетаНР.
   
5. 
   Фагоцитоз. Стадии фагоцитоза.
   
6. 
   Незавершенный фагоцитоз.
   
7. 
   Фагоцитарная активность, фагоцитарное число их определение.
   
8. 
   Естественные киллеры, их функция в организме.
   

1. 
   Составить таблицу – «Виды иммунитета»
   
2. 
   Определение фагоцитарной активности в готовых препаратах (подсчет фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя)
   
3. 
   Изучить незавершенный фагоцитоз по готовым препаратам.
   

Определение фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя invitro

Препараты микроскопируют, передвигая мазок в одном направлении, подсчитывают число фагоцитированных бактерий в 50 лейкоцитах. Исходя из этого определяют среднее количество фагоцитированных бактерий на один лейкоцит.

Изучение незавершенного фагоцитоза в препаратах из отделяемого уретры больного гонореей. Результаты записать в тетрадь.

Мазки фиксируют на пламени горелки и окрашивают по Грамму (или метиленовой синькой). При микроскопии мазков отмечают наличие грамотрицательных диплококков, расположенных внутри фагоцитов (лейкоцитов). Зарисовать в тетради.

1. 
   Процент фагоцитирующих нейтрофилов (% фагоцитоза) – считают процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего количества посчитанных нейтрофилов. В норме процент фагоцитоза у взрослых -60-90%, у детей – 30-65%.
   
2. 
   Фагоцитарное число – это среднее количество поглощенных бактерий или частиц на 1 клетку (полиморфно – ядерный лейкоцит).
   

3. 
   Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - оценивают переваривающую функцию нейтрофилов. Это отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов (переваренных и непереваренных), выраженное в процентах. Норма для взрослых - 64 – 72%.
   
4. 
   Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). В норме через 30 мин начинается переваривание поглощенных микроорганизмов нейтрофилами, через 2 ч. оно должно закончиться. Поэтому процент фагоцитирующих нейтрофилов и среднее число поглощенных микроорганизмов после 2-часовой экспозиции меньше, чем после 30 – минутной, а ИЗФ - больше 1,0, что указывает на завершенность фагоцитоза. ИЗФ меньше 1, 0 свидетельствует о сниженной киллерной функции нейтрофилов.
   

1. 
   Врожденный иммунитет. Внешние и внутренние барьеры неспецифической резистентности организма.
   
2. 
   Клеточные и гуморальные факторы врожденного иммунитета.
   
3. 
   Что такое лизоцим? Методика определения лизоцима в слюне
   
4. 
   Комплемент, пути активации комплемента.
   
5. 
   Интерферон, острофазные белки сыворотки крови.
   
6. 
   Воспаление, признаки воспаления.
   

1. 
   Определить титр лизоцима в слюне по демонстрационному материалу
   
2. 
   Разобрать схему классического и альтернативного путей активации комплемента. (табл.)
   
3. 
   Поставить опыт по определению бактерицидного действия кожи
   
4. 
   Изучить комплементарную активность сыворотки крови по демонстрационному материалу.
   

1. 
   Определение титра лизоцима в слюне
   

Лизоцим продуцируется моноцитами крови и тканевыми макрофагами. Он вызывает лизис бактерий, но не активен в отношении вирусов.

Для определения титра готовят ряд последовательных разведений слюны в пробирках, в каждую из которых вносят по 1 мл. суспензии суточной культуры Micrococcuslisodecticus, содержащей 1 млрд/мл микробных тел.

(табл)

Титр Ингредиенты	1:2	1:4	1:8	1:16	Кс	Кф	Кк
	1	2	3	4	5	6	7
Слюна	1,0				1,0	_	_
Физ. раствор	1,0	1,0	1,0	1,0	_	1,0	_
Взвесь суточной культуры Mlisodecticus	1,0	1,0	1,0	1,0	_	_	1,0

Примечание: Из 4- пробирки 1,0 мл вылить в банку с дезраствором.

После инкубации в термостате в течение 3 ч определяют титр лизоцима по последнему разведению, в котором наблюдается полный лизис бактерий – просветление. Более точную оценку активности лизоцима можнопроводить, измеряя спектрофотометрическим методом изменение оптической плотности микробной взвеси после инкубации ее с разведениями лизоцима. Пользуясь калибровочными кривыми или специальными таблицами, активность лизоцима можно выразить в мкг/мл. Уровень содержания лизоцима в слюне здоровых людей колеблется от 50 до 70 мкг/мл.

2. 
   Определение бактерицидного действия кожи
   

Индекс бактерицидности (ИБ) вычисляют по формуле:

К1
где K l - количество колоний сразу после нанесения на кожу, К 2 - количество колоний через 15 минут после контакта.

У здоровых людей ИБ равен 90-100%

3. 
   Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК)
   

Бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) является показателем естественной способности крови к самоочищению. В 1886 г. Высокович обнаружил, что различные бактерии, введенные в кровь кроликов и собак, не удаляются из организма выделительными органами, если эти микробы не повреждены. Исчезновение их из организма связано с наличием в сыворотке особых веществ, убивающих и растворяющих микробные клетки. Бактерицидное действие сыворотки крови распространяется как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии.

Методика:

Из 18-ти часовой культуры кишечной палочки методом серийных разведений готовят рабочую концентрацию до 40-50 тыс. м. т. в 1 мл. Рабочую взвесь тест-микробов в количестве 0,1 мл высевают на чашку Петри с МПА. Шаблоном диаметром 20 мм по поверхности агара с культурой микроорганизмов делают отверстия (в центре и по периферии отмечают контрольные отверстия, на которые не наносится испытуемая сыворотка). На каждую площадку с посевом тест-культуры наносят пипеткой 0,05 мл исследуемой сыворотки. Через 24 часа инкубации в условиях термостата проводят подсчет выросших колоний, как на опытных, так и на контрольных площадках. Бактерицидную активность сыворотки крови рассчитывают по формуле:

исходное количество бактерий

1. 
   Центральные и периферические органы иммунитета.
   
2. 
   Принцип организации иммунной системы.
   
3. 
   Генез (развитие и дифференцировка) лимфоцитов и их значение в формировании клеточного и гуморального иммунитета.
   
4. 
   Понятие о предшественниках Т- и В- лимфоцитов.
   
5. 
   Сходство и различие Т- и В- лимфоцитов.
   
6. 
   Рециркуляция лимфоцитов.
   
7. 
   Понятие об иммунном ответе, его формы.
   

1. Изучение препаратов со спонтанным розеткообразованием - определение количества Т-лимфоцитов (определить % Е - РОК)

2. Изучение бласттрансформации лимфоцитов под влиянием ФГА для определения функциональной активности Т-лимфоцитов (определить % бластов).

3. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов.

4. Оформление и защита протокола.

Методические указания к самостоятельной работе

Иммунологические методы диагностики - методы исследования иммунного статуса организма; применяются в педиатрии, акушерстве и гинекологии. Ныне принят двухэтапный метод оценки функционирования иммунной системы. На 1-м этапе выявляются обобщённые характеристики В- и T-систем иммунитета и фагоцитоза. К иммунологическим тестам 1-го уровня относят определение: 1) абсолютного и относительного числа лимфоцитов в периферической крови; 2) абсолютного и относительного числа Т- и В-лимфоцитов в крови; 3) концентрации сывороточных иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA); 4) фагоцитарной активности нейтрофилов.

Сведения об абсолютном и относительном числе лимфоцитов являются интегральным показателем функционирования иммунной системы. Для определения Т-лимфоцитов используют реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-розеткообразование), В-лимфоцитов - реакцию розеткообразования с эритроцитами барана, несущими на своей поверхности комплекс антитело-комплемент (ЕАС-розеткообразование). Возможно также определение В-лимфоцитов методом спонтанногорозеткообразования с эритроциами мыши. К-во IgM, IgG, IgA чаще всего оценивается методом радиальноиимму-нодиффузии по Манчини. При различных заболеваниях наблюдаются стереотипные колебания уровня Т- и В-лимфоцитов, иммуноглобулинов, которые во многом сходны и лишены специфичности, т. к. связаны не с непосредственным этиологическим фактором, а со стрессовой реакцией организма на болезнь. Динамика уровней иммуноглобулинов, Т- и В-клеток очень важна для выявления больных с иммунологической недостаточностью, определения влияния на иммунную систему тех или иных лекарственных средств.

О функциональной активности Т- и В-лимфоцитов судят по реакции бластной трансформации (РБТЛ) с использованием митогена - фитогемагглютинина (ФГА).

Реакция бласттрансформации характеризует способность лейкоцитов к трансформации и размножению под воздействием антигенов, аллергенов и митогенов.

Пролиферативный ответ лимфоцитов на антигены даёт представление о выраженности специфической сенсибилизации организма.

Реакция бласттрансформации применяется для комплексной оценки иммунного статуса больного.

Метод определения реакции бласттрансформации

Микроскопия.

Для РБТЛ с ФГА: 50-70%

Для РБТЛ с антигеном: отрицательный

Материал для анализа реакции бласттрансформации

Плазма крови.

Забор крови осуществляется в пробирку с гепарином. Кровь должна быть доставлена в лабораторию в течение 2 часов.

Подготовка пациента к реакции бласттрансформации

Забор крови осуществляют в утренние часы натощак. Накануне исследования и в день забора крови исключить жирную пищу.

Снижают: цитостатики, иммунодепрессанты, кортикостероиды, облучение ионизирующей радиацией.

Повышение: гиперактивность иммунной системы при аллергических и аутоаллергических заболеваниях, активация антитрансплантационного иммунитета, острый период первичной инфекции, иммунный ответ на тимусзависимые антигены.

Снижение: онкологические заболевания, вторичные иммунодефициты, первичные иммунодефициты, СПИД, тяжёлые вирусные инфекции, тяжёлые ожоги, травмы.

РБТЛ с антигеном:

Наличие пролиферативного ответа лимфоцитов на определенный антиген даёт представление о наличии и выраженности специфической сенсибилизации организма.

1. Антигены, их свойства. Полноценные и неполноценные антигены.

2. Антигенная структура микробов. Протективные антигены. Гетерогенные антигены.

3. Антигены организма человека и животных (опухолевые, аутоантигены, изоантигены, антигены главного комплекса гистосовместимости).

4. Иммунная система организма взрослого и ребенка: организация и функции.

5. Что такое антиген? Дайте определение. Какова химическая природа антигенов.

6.Дайте понятие чужеродности, антигенности, иммуногенности, специфичности антигена.

7. Что такое антигенная детерминанта? Дайте определение валентности антигена.

8. Чем обусловлены особенности химического строения антигенов?

9. Что такое гаптен? Приведите примеры.

10. Укажите виды антигенной специфичности?

11. Назовите изоантигены человека: эритроцитарные, лимфоцитарные, тромбоцитарные.

12. Что такое тимусзависимые и тимуснезависимые антигены? Приведите примеры.

13. Когда возникают аутоантигены? Что это за антигены?Понятие иммунитета. Виды и формы иммунитета.

1. Изучение препаратов

2. Микроскопия и зарисовка демонстрационных препаратов.

3. Оформление и защита протокола.

Антигены – это высокомолекулярные соединения. При попадании в организм вызывают иммунную реакцию и взаимодействуют с продуктами этой реакции: антителами и активированными лимфоцитами.

Классификация антигенов.

1. По происхождению:

1) естественные (белки, углеводы, нуклеиновые кислоты, бактериальные экзо– и эндотоксины, антигены клеток тканей и крови);

2) искусственные (динитрофенилированные белки и углеводы);

3) синтетические (синтезированные полиаминокислоты, полипептиды).

2. По химической природе:

1) белки (гормоны, ферменты и др.);

2) углеводы (декстран);

3) нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК);

4) конъюгированные антигены (динитрофенилированные белки);

5) полипептиды (полимеры a-аминокислот, кополимерыглутамина и аланина);

6) липиды (холестерин, лецитин, которые могут выступать в роли гаптена, но, соединившись с белками сыворотки крови, они приобретают антигенные свойства).

3. По генетическому отношению:

1) аутоантигены (происходят из тканей собственного организма);

2) изоантигены (происходят от генетически идентичного донора);

3) аллоантигены (происходят от неродственного донора того же вида);

4) ксеноантигены (происходят от донора другого вида).

4. По характеру иммунного ответа:

1) тимусзависимые антигены (иммунный ответ зависит от активного участия Т-лимфоцитов);

2) тимуснезависимые антигены (запускают иммунный ответ и синтез антител В-клетками без Т-лимфоцитов).

Выделяют также:

1) внешние антигены; попадают в организм извне. Это микроорганизмы, трансплантированные клетки и чужеродные частицы, которые могут попадать в организм алиментарным, ингаляционным или парентеральным путем;

2) внутренние антигены; возникают из поврежденных молекул организма, которые распознаются как чужие;

3) скрытые антигены – определенные антигены (например, нервная ткань, белки хрусталика и сперматозоиды); анатомически отделены от иммунной системы гистогематическими барьерами в процессе эмбриогенеза; толерантность к этим молекулам не возникает; их попадание в кровоток может приводить к иммунному ответу.

Иммунологическая реактивность против измененных или скрытых собственных антигенов возникает при некоторых аутоиммунных заболеваниях.

Свойства антигенов:

1) антигенность – способность вызывать образование антител;

2) иммуногенность – способность создавать иммунитет;

3) специфичность – антигенные особенности, благодаря наличию которых антигены отличаются друг от друга.

Гаптены – низкомолекулярные вещества, которые в обычных условиях не вызывают иммунной реакции, но при связывании с высокомолекулярными молекулами приобретают иммуногенность. К гаптенам относятся лекарственные препараты и большинство химических веществ. Они способны вызывать иммунный ответ после связывания с белками организма.

Антигены или гаптены, которые при повторном попадании в организм вызывают аллергическую реакцию, называются аллергенами.

2. Антигены микроорганизмов

Инфекционные антигены – это антигены бактерий, вирусов, грибов, простейших.

Существуют следующие разновидности бактериальных антигенов:

1) группоспецифические (встречаются у разных видов одного рода или семейства);

2) видоспецифические (встречаются у различных представителей одного вида);

3) типоспецифические (определяют серологические варианты – серовары, антигеновары – внутри одного вида).

В зависимости от локализации в бактериальной клетке различают:

1) О – АГ – полисахарид; входит в состав клеточной стенки бактерий. Определяет антигенную специфичность липополисахарида клеточной стенки; по нему различают сероварианты бактерий одного вида. О – АГ слабо иммуногенен. Он термостабилен (выдерживает кипячение в течение 1–2 ч), химически устойчив (выдерживает обработку формалином и этанолом);

2) липид А – гетеродимер; содержит глюкозамин и жирные кислоты. Он обладает сильной адьювантной, неспецифической иммуностимулирующей активностью и токсичностью;

3) Н – АГ; входит в состав бактериальных жгутиков, основа его – белок флагеллин. Термолабилен;

4) К – АГ – гетерогенная группа поверхностных, капсульных антигенов бактерий. Они находятся в капсуле и связаны с поверхностным слоем липополисахарида клеточной стенки;

5) токсины, нуклеопротеины, рибосомы и ферменты бактерий.

Антигены вирусов:

1) суперкапсидные антигены – поверхностные оболочечные;

2) белковые и гликопротеидные антигены;

3) капсидные – оболочечные;

4) нуклеопротеидные (сердцевинные) антигены.

Все вирусные антигены Т-зависимые.

Протективные антигены – это совокупность антигенных детерминант (эпитопов), которые вызывают наиболее сильный иммунный ответ, что предохраняет организм от повторного инфицирования данным возбудителем.

Пути проникновения инфекционных антигенов в организм:

1) через поврежденную и иногда неповрежденную кожу;

2) через слизистые оболочки носа, рта, ЖКТ, мочеполовых путей.

Гетероантигены – общие для представителей разных видов антигенные комплексы или общие антигенные детерминанты на различающихся по другим свойствам комплексах. За счет гетероантигенов могут возникать перекрестные иммунологические реакции.

У микробов различных видов и у человека встречаются общие, сходные по строению антигены. Эти явления называются антигенной мимикрией.

Суперантигены – это особая группа антигенов, которые в очень малых дозах вызывают поликлональную активацию и пролиферацию большого числа Т-лимфоцитов. Суперантигенами являются бактериальные энтеротоксины, стафилококковые, холерные токсины, некоторые вирусы (ротавирусы).