Методика определения биосовместимости полимерных материалов и изделий для эндопротезирования по их влиянию на лимфоидную ткань

значение приобретает разработка экспресс-методов на биологических тест-объектах и тест-системах.

Эти методы можно применять в следующих случаях: а) при отборе оптимальных лабораторных

образцов материалов и изделий на первом этапе их разработки; б) при оценке различных технологий

переработки материалов в изделие; в) при выборе оптимального способа стерилизации изделия; г)

при незначительном изменении рецептуры материала; д) при изменении сферы применения хорошо

изученного материала.
1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
При непосредственном введении материалов во внутреннюю среду организма способность их

вызывать состояние сенсибилизации иммунокомпетентных систем во многом определяет степень

совместимости материала с организмом (биосовместимость).
Современная неинфекционная иммунология располагает методами, позволяющими оценить

степень биосовместимости вживляемых материалов по характеру их влияния на органы иммунитета,

представляемые в организме лимфоидной тканью.
Настоящая Методика предполагает комплекс методов оценки состояния лимфоидной ткани при

имплантации синтетических материалов. Эти методы апробированы и адаптированы к задачам

токсикологической оценки полимеров медицинского назначения.
Комплекс предлагаемых методов предназначается для использования в качестве экспресс-

метода оценки биосовместимости при отборе перспективных для медицины полимерных

материалов, а также в качестве этапа токсикологического изучения при гигиенической оценке

материалов и изделий, длительно контактирующих с внутренними средами организма.

форма в виде бруска, имеющего размеры 6 x 4 x 2 мм (грани бруска и углы не должны быть острыми).

виде порций по 0,5 куб. см (0,5 мл).

стерилизации должен соответствовать ОСТ 42-21-2-85 "Стерилизация и дезинфекция изделий

медицинского назначения", отобранному для данного вида изделий.
4. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
4.1. Вид животных: белые крысы - самцы линии Вистор или беспородные.
4.2. Количество групп животных в эксперименте должно быть не менее четырех: а) подопытная;

б) контроль интактный; в) контроль ложнооперированный; г) контрольная имплантация

традиционного биосовместимого материала.
4.2.1. В качестве традиционного биосовместимого материала при оценке нерассасывающихся

имплантатов следует применять тефлон, для рассасывающихся - кетгут, для кровезаменителей -

поливинилпирролидон мол. массы 12600, для порошкообразных - порошок тефлона или кетгута, для

сплавов - сплав КХС.

верхней трети бедра крысы делается разрез кожи длиной около 1 см. Анатомическим глазным

пинцетом расчленяется бедренная мышца (вдоль волокон), в которой при помощи того же пинцета

формируется карман. Изучаемый материал помещается в этот карман. На мышцу накладывается один

шов, на кожу два шва. Применяется хирургический шелк высоких номеров.
Одной из контрольных групп животных имплантируется биосовместимый материал, другой -

производится ложная операция (те же манипуляции без имплантации материала).

инъекционным способом.

к месту имплантации) и левый (отдаленный) лимфоузлы, освобождаются от жировой ткани и острым

лезвием перерезаются поперек. При помощи пинцета половинка узла прикладывается несколько раз к

обезжиренному предметному стеклу поверхностью среза.

метанолом в течение двух минут (или спиртом-ректификатом в течение 15 мин.) и промываются

проточной водой. Окраска отпечатков производится стандартными растворами красителей Май-

Грюнвальд (в течение 4 мин.) и азур-эозиновой смесью (10 мл красителя на 100 мл

дистиллированной воды); окрашивать в течение 45 - 60 мин.
5.1.2. Проведение анализа отпечатков и техника оформления получаемых результатов.
Отпечатки изучаются под микроскопом с применением иммерсии. В отпечатках производится

подсчет иммунокомпетентных клеток: малых лимфоцитов, бластов, зрелых плазматических клеток и

ретикулярных клеток, а также количество делящихся клеток (митозов).
Подсчет клеток производится в 10 полях зрения, и в дальнейшем принимаются во внимание

средние (М) из 10 полей зрения показатели для каждого из видов клеток. Поля зрения берутся в

разных частях отпечатков, преимущественно в парокортикальных зонах и у основания мозговых

тяжей.
Запись протокола подсчета клеток производится по нижеприведенному образцу (табл. 1).

1  2  3  4  5  6  7  8  9  10

Малые лимфоциты      25  20  36  21  30  20  18  26  27  22  24,5 

Бласты               8   7   10  4   5   3   6   7   12  4   6,6  

Плазматические клетки -   -   1   2   -   -   1   -   -   1   0,5  

Ретикулярные клетки  -   1   -   1   -   2   -   1   -   -   0,5  

Митозы               -   -   -   -   -   -   1   -   -   1   0,2  
5.2.1. Взятие материала и приготовление мазков.
Взятие материала. Забой животных и взятие материала производится так же, как в п. 5.1.1.

Можно использовать лимфоузлы, из которых готовились отпечатки.

лимфоузел. Затем при помощи двух инъекционных игл ткань органа размельчается в этой капле до

получения гомогенной взвеси. Из капли обычным образом готовится мазок, который высушивается

на воздухе при комнатной температуре.

40 мл дистиллированной воды), куда добавляется трилон (250 мг на 100 мл 60% раствора ацетона);

pH раствора 4,8 - 5,0 (доводить pH 0,1 раствором HCl).
Высушенные мазки фиксируются в ацетоновом фиксаторе в течение 30 с, затем промываются в

проточной воде и высушиваются на воздухе.

растворяют в 100 мл воды);

воды);
в) оба раствора слить для получения pH = 7,0 - 7,4 (30 мл раствора калия однозамещенного и 70

мл раствора калия двузамещенного).
Буфер хранить в холодильнике.
Приготовление инкубационной среды для выявления сукцинатдегидрогеназы (СДГ):
а) 10 мг трилона Б; б) 540 мг сукцината натрия; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г) 40

мл фосфатного буфера.

ГДГ):
а) 10 мг трилона Б; б) 650 мг бета-глицерофосфата; в) 10 мг паранитротетразолия фиолетового; г)

10 мг фосфатного буфера.
Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.
Примечание: п-нитротетразолий лучше добавить после того, как pH среды будет доведен до

рабочего.

дистиллированной воды, довести ледяной кислотой до pH 4,8 - 5,0 (1,5 мл) 500 мг метилового

зеленого растворить в 100 мл шуфера из уксуснокислого натрия. Смесь очищают при помощи

делительной воронки хлороформом до тех пор, пока хлороформ не станет чистым.

инкубационных сред (в зависимости от того, какая дегидрогеназа выявляется) и нагревают до 38 - 39

°C, после чего помещают в термостат (37 °C) на 60 минут. После инкубации мазки промывают в

проточной воде и окрашивают метиловым зеленым в течение 60 минут. Затем следует отмывка

препаратов.
5.2.3. Проведение анализа мазков и техника оформления полученных результатов.
Подсчет гранул ферментов в клетках производится под микроскопом с применением иммерсии.

В окрашенном препарате лимфоциты и прочие клетки лимфоидного ряда имеют бледно-зеленую

окраску. Гранулы фермента располагаются в ядре и цитоплазме, имеют округлую сферическую форму

и темно-фиолетовый (почти черный) цвет. Техника анализа мазка предполагает подсчет количества

гранул в 50 клетках, последние считают в разных полях зрения, в разных участках мазка.
Активность фермента в клетке выражается средним количеством гранул в одной клетке (общее

количество гранул в 50 клетках, деленное на 50). Запись протокола подсчета гранул фермента

производится по нижеприведенному образцу ("0" обозначает отсутствие фермента в клетке).
Таблица 2
ОБРАЗЕЦ ЗАПИСИ ПРОТОКОЛА ПОДСЧЕТА ГРАНУЛ ФЕРМЕНТА
---------------------------------------------------------------------

----------¬

1       4   ¦

----------+

6       0   ¦

----------+

6       0   ¦

10      11  ¦

----------+

10      0   ¦

-----------

цитоморфологического анализа лимфоузлов. Эти данные должны получить подтверждение в

результате гистохимического исследования селезенки и анализа весовых коэффициентов

лимфоидных органов.

проводится факультативно, но обязательно в совокупности с гистохимическим определением

щелочной фосфатазы в лимфоузлах.
Материал следует считать биологически несовместимым, если через 1 месяц после

имплантации материалов не наблюдается нормализации показателей или выраженной тенденции к

таковой и отличия их от контроля существенны (статистически достоверны).
В случае если показатели состояния лимфоидной ткани подопытных животных отличаются от

контроля менее существенно (носят характер тенденции к изменению Р, равном или меньше 0,1),

вопрос о биологической совместимости исследуемого материала должен решаться с учетом всей

совокупности данных токсикологического эксперимента.

статистическая обработка обязательна. Она проводится с использованием критерия "t" по Стьюденту.

Для результатов цитохимических исследований (п. 5.2.3) предпочтительнее метод Уилкоксона -

Манна - Уитна.

вживлялся "инертный материал". Если этот контроль не имеет достоверных отличий от

ложнооперированного контроля, опытная группа может быть сравнена непосредственно с

интактным контролем.