Медицинская биохимия
Скачать 2.34 Mb.
|
- Навигация по данной странице:
- Медицинская
- УДК 577.15 ББК 28.902 © БГУ, 2014 ПРЕДИСЛОВИЕ
- ТЕМА 1. ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ АЛЛОКСАН-ИНДУЦИРОВАННОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС
- Биохимические нарушения у больных СД.
- ИНДУКЦИЯ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС
- аллоксана
- Техника внутрибрюшинного введения веществ лабораторным крысам.
- ИЗМЕРЕНИЕ ВАЖНЕЙШИХ КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ САХАРНОГО ДИАБЕТА В КРОВИ КРЫС Получение сыворотки крови
|
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра биохимии 
МЕДИЦИНСКАЯ БИОХИМИЯ Практикум 
МИНСК 2014 У ББК 28.902
П 69Рекомендовано Ученым советом биологического факультета 2014 г., протокол № Составитель : О. И. Губич Рецензенты: кандидат биологических наук, доцент Р. А. Желдакова; кандидат биологических наук, доцент Н. А. Белясова
Приводятся методические приемы создания экспериментальных моделей патологических процессов in vitro и in vivo, а также биохимического анализа основных диагностических маркеров, используемых в клинико-лабораторной практике. Для студентов биологического факультета БГУ специальности 1-31 01 02 «Биохимия». УДК 577.15 ББК 28.902 © БГУ, 2014 ПРЕДИСЛОВИЕ Подготовка современного специалиста-биохимика подразумевает получение им информации как о структурных и функциональных свойствах основных классов биологических молекул, ключевых процессах, лежащих в основе обмена веществ, так и о механизмах регуляции и взаимосвязи биохимических реакций, протекающих в организме в норме и при патологии. За последние 10-15 лет, благодаря широкому применению новейших высокочувствительных методов исследования, достигнуты значительные успехи в понимании молекулярно-биохимических механизмов развития целого ряда патологических процессов. Это привело к формированию одного из важнейших разделов биологической химии – медицинской биохимии, изучающей характер и причины изменения химического состава организма и обмена веществ в органах и тканях при различных патологических состояниях. Современная методология биохимических исследований в данной предметной области исключительно важна для решения практических задач фармакологии и медицины. Материал настоящего методического пособия был составлен, исходя из конкретных задач, стоящих перед биохимиком в практической работе. В процессе выполнения предлагаемых лабораторных работ студенты имеют возможность приобрести навыки экспериментальной работы, в том числе моделирования патологических процессов на различных уровнях организации живых систем (клеточном, организменном) и биохимического анализа основных используемых в клинической практике маркеров заболеваний. Весь предлагаемый материал изложен так, что после краткого рассмотрения теоретических основ раздела дается описание и техника проведения конкретных методов. Пособие состоит из 9 разделов: 1. Постановка экспериментальной модели аллоксан-индуцированного сахарного диабета у лабораторных крыс. 2. Постановка экспериментальной модели острого поражения печени галогензамещенными углеводородами у лабораторных крыс in vivo. 3. Выделение гепатоцитов из печени крыс. Оценка цитотоксического действия галогензамещенных углеводородов in vitro. 4. Создание моделей окислительного стресса in vitro. 5. Создание модели индуцированной гиперфагии у лабораторных крыс. 6. Создание модели экспериментальной хронической обструктивной болезни легких, индуцированной сигаретным дымом. 7. Постановка модели желчекаменной болезни у лабораторных крыс. 8. Постановка экспериментальной модели ангины у лабораторных крыс. 9. Постановка экспериментальной модели хронического простатита у лабораторных крыс. Выбор данных разделов определяется не только широким распространением рассматриваемых в них патологий, но и стремительным ростом новых данных и подходов к изучению обсуждаемых проблем. В первом разделе рассматриваются основные положения и методика постановки модели экспериментального сахарного диабета in vivo; обсуждаются биохимические и физиологические механизмы действия аллоксана. Раздел включает широко используемые в современной клинико-лабораторной практике методы анализа биохимических маркеров углеводного и белкового обмена, подтверждающих развитие сахарного диабета и его метаболических осложнений. Вторый раздел предназначен для освоения студентами современных методов измерения важнейших клинико-биохимических маркеров заболеваний печени, а также параметров перекисного окисления липидов, сопровождающего развитие острого поражения печени в присутствии галогензамещенных углеводородов. В третьем разделе студенты знакомятся с методами выделения гепатоцитов из интактной печени лабораторных животных, основными критериями качества полученной клеточной суспензии, а также с приемами работы с эукариотическими клетками при постановке острых экспериментов in vitro. В четвертом разделе студенты знакомятся с основными теоретическими аспектами окислительных и радикальных процессов в организме, методами создания моделей окислительного стресса in vivo. Основу пятого раздела составляют работы, посвященные определению некоторых биохимических показателей ожирения и методике постановки модели экспериментальной гиперфагии, лежащей в основе данной патологии. В шестом разделе студенты знакомятся с современным методом создания и подтверждения модели экспериментальной хронической обструктивной болезни легких, индуцированной сигаретным дымом. Седьмой раздел знакомит студентов с методикой постановки модели желчекаменной болезни у лабораторных крыс и оценки эффективности модели путем определения соответствующих показателей липидного обмена в крови животных. Восьмой раздел посвящен описанию простой и эффективной модели экспериментальной ангины у лабораторных крыс. Наконец, в девятом разделе рассматривается модель экспериментального хронического простатита у лабораторных крыс, а также методы определения биохимических маркеров крови и мочи, подтверждающие развитие данного заболевания. Приведенные в пособии методики позволяют максимально использовать доступное лабораторное оборудование и реактивы. Описание методов исследования сопровождается иллюстрациями, изображающими используемые методики и способствующие более быстрому их пониманию. Уровень приводимых в пособии методических приемов соответствует требованиям современной науки, регламентируется учебными программами и учитывает технические возможности проведения учебного процесса на современном уровне. Данное пособие способствует, углубляет и стимулирует самостоятельную подготовку студентов по различным общим и специальным курсам, развивает их творческую активность, повышает уровень и качество подготовки современных специалистов-биохимиков. Настоящее методическое пособие может быть рекомендовано магистрантам, аспирантам, специализирующимся в области биохимии, а также научным сотрудникам. Все замечания и пожелания, касающиеся улучшения представленного в пособии материала, будут приняты автором с благодарностью.
а знающие вспомнят еще раз. Сенека Сахарный диабет (СД) – заболевание эндокринной системы, сопровождающееся хроническим повышением уровня глюкозы в крови, обусловленным абсолютной (СД I типа) или относительной недостаточностью инсулина (инсулинорезистентностью организма) (СД II типа). Термин «диабет» (лат. «diabetes» – «проникать сквозь») впервые был использован во II в. до н. э. греческим врачом Деметриосом из Апамании для обозначения заболевания, характеризующегося полиурией и полидипсией. В 1975 г. Т. Уиллис показал, что в некоторых случаях у пациентов при полиурии моча имеет высокую концентрацию глюкозы. С появлением технических средств измерения глюкозы в крови выяснилось, что обнаружению данного моносахарида в моче предшествует повышение его концентрации в крови (лишь при достижении его концентрации порядка 9 ммоль/л в сыворотке крови (пороговое значение) глюкоза фиксируется в моче). К появлению новой парадигмы СД как заболевания, связанного с инсулиновой недостаточностью, привели несколько открытий. В 1889 г. Дж. фон Меринг и О. Минковски показали, что после удаления поджелудочной железы у собак развиваются симптомы сахарного диабета. В 1910 г. Э. А. Шарпей-Шефер предположил, что сахарный диабет вызван недостаточным синтезом химического вещества, выделяемого островками Лангерганса в поджелудочной железе. Это вещество было названо инсулином (лат. «insula» – «остров»). Эндокринная функция поджелудочной железы и роль инсулина в предотвращении развития сахарного диабета были подтверждены Ф. Г. Бантингом и Ч. Г. Бестом в 1921 г. (Нобелевская премия по медицине 1923 г.). Однако спустя 10 лет было установлено, что у некоторых пациентов, страдающих данным заболеванием, концентрация инсулина не только не снижена, но и значительно повышена. На основании этого факта, начиная с 1936 г., сахарный диабет I и II типа начал рассматриваться как отдельные заболевания единого синдрома, что не изменило, тем не менее, основной принцип его диагностики – исключительно по показателям устойчивой гипергликемии.
Д. Дж. Р. Маклеод Ф. Г. Бантинг Существует несколько возможных генетических и биохимических причин развития сахарного диабета. Этиологию СД I связывают с вирусными инфекциями, поражающими β-клетки островков Лангерганса в поджелудочной железе. Особое внимание уделяется вирусам краснухи, эпидемического паротита, ветряной оспы, Коксаки В4, энцефаломиокардита, инфекционного мононуклеоза, инфекционного гепатита и цитомегаловирусу. Диабет может наблюдаться у беременных женщин в результате гиперпродукции гормонов-антагонистов инсулина, что обусловлено особенностью гормональных взаимоотношений между плодом и матерью, а также влиянием плацентарных гормонов. В настоящее время идентифицировано несколько генов, вовлеченных в развитие СД I: локус МНС, VNTR, CTLA 4, гены тирозиновых фосфатаз Т-лимфоцитов (PTPN 22 и PTPN 2), гены интерлейкина 2 и α-цепи его рецептора, гены IFIH 1, KIAA 0350. Анализ функций белковых продуктов этих генов подтверждает гипотезу о том, что причиной развития СД I являются нарушения в механизмах иммунологической толерантности, с одной стороны, и формированием искаженного иммунного ответа против собственных белков организма после вирусной инфекции, с другой. Выявление инсулита (лимфатическая инфильтрация островков Лангерганса) у пациентов, умерших от СД, а также выявление у больных данным заболеванием специфических антител к клеткам поджелудочной железы является прямым доказательством принадлежности СД I к аутоиммунным заболеваниям. Имеются сведения о возможном участии в патогенезе СД нарушений пуринового обмена, особенно затрагивающих его заключительные этапы – образование при участии ксантиноксидазы мочевой кислоты. Для обоих типов СД характерен избыточный пуриновый катаболизм, который обусловлен увеличением окисления, снижением синтеза пуриновых оснований. К другим причинам развития СД относятся: заболевания поджелудочной железы (панкреатит, опухоли, резекция); заболевания эндокринной системы (синдром Иценко – Кушинга, акромегалия, диффузный токсический зоб, феохромоцитома); воздействие некоторых лекарств или химических веществ (глюкокортикоидные синтетические гормоны, тиазидные диуретики, некоторые гипотензивные препараты, противоопухолевые лекарственные средства); ожирение (абдоминальный тип), при этом снижается чувствительность тканей организма к инсулину; несбалансированное высокоуглеводное питание; хронический стресс (у детей – однократный сильный испуг); аутоиммунные заболевания (аутоиммунный тироидит, хроническая недостаточность коры надпочечников). Установлено также, что изменения в морфологии β-клеток поджелудочной железы могут быть связаны с накоплением в них амилоида, состоящего из белка амилина. Амилин откладывается в клетках островков Лангерганса, подавляя секрецию инсулина. Биохимические нарушения у больных СД. Возникающее в начале заболевания нарушение углеводного обмена приводит затем к тотальному нарушению всех видов обмена (рис. 1.1). Независимо от механизмов развития, общей чертой всех типов СД является устойчивое повышение концентрации глюкозы в крови и нарушение метаболизма тканей организма, неспособных захватывать глюкозу из кровяного русла. Так, при отсутствии глюкозы в клетке нарушается пентозофосфатный цикл, важнейший продукт которого, рибозо-5-фосфат, необходим для синтеза нуклеозидов, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и гистидина. При отсутствии в клетке глюкозы как основного источника энергии происходит также усиленное окисление липидов пищи и окисление свободных жирных кислот до ацетил-КоА. Избыток данного метаболита превращается в кетоновые тела, вызывая кетоацидоз. 
Рис. 1.1 Биохимические изменения при СД СД сопровождается повышением интенсивности перекисного окисления липидов, о чем свидетельствует повышение уровня ацилгидроперекисей и межмолекулярных сшивок. Еще одно из проявлений СД – катаболический синдром, проявляющийся снижением массы тела, обусловлен распадом гликогена, интенсивным липолизом, катаболизмом белков с последующим глюконеогенезом высвобождающихся аминокислот. Повышение концентрации глюкозы в крови приводит к повышению осмотического давления крови, что обусловливает значительную потерю воды и электролитов с мочой, одновременно с этим происходит активация инсулиннезависимых путей утилизации глюкозы крови, являющихся причиной развития ряда осложнений СД:
Ввиду высокой распространенности СД в популяции человека (1 – 3 %), а также высокого риска развития осложнений (диабетический кетоацидоз, гиперосмолярная некетоацидотическая кома, молочнокислая диабетическая кома, диабетическая ретинопатия, макроангиопатия, нефропатия, артропатия, энцефалопатия и др.), данное заболевание представляет серьезную медико-социальную проблему и привлекает внимание как медицинских работников, так и ученых-биохимиков, поскольку понимание тонких механизмов развития сахарного диабета будет способствовать созданию противодиабетических препаратов нового поколения, способных повысить качество жизни пациентов с сахарным диабетом обоих типов.
Наиболее простой и воспроизводимой экспериментальной моделью сахарного диабета I типа является модель с использованием аллоксана (рис. 1.2). 
Рис. 1.2. Структура аллоксана Внутрибрюшинное однократное введение аллоксана лабораторным животным вызывает трехфазную реакцию со стороны системы крови с последующим развитием симптомов сахарного диабета. Эта реакция заключается в первоначальном повышении уровня глюкозы крови, достигающего максимума через 2–4 ч. Затем наступает гипогликемия, длящаяся 15–20 ч. Далее развивается вторичная, или перманентная, гипергликемия, свидетельствующая о сахарном диабете. По мнению большинства исследователей, гипогликемия представляет собой результат разрушения аллоксаном β-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы с последующим освобождением больших количеств инсулина. Вторичная или перманентная гипергликемия – следствие недостаточности инсулина. Симптомы сахарного диабета (гипергликемия, глюкозурия, полифагия, полидипсия и полиурия) развиваются уже через 24 – 36 ч после введения аллоксана. Поскольку развитие сахарного диабета сопровождается не только нарушением углеводного обмена, но и изменениями со стороны других параметров метаболизма, в эксперименте целесообразно проводить измерения как классических биохимических маркеров данного заболевания (концентрация глюкозы, гликозилированного гемоглобина, фруктозамина, активность α-амилазы), так и дополнительных показателей нарушения обмена веществ (содержание пировиноградной кислоты, мочевины, общего белка). Все манипуляции с лабораторными крысами проводят в полном соответствии с этическими нормами обращения с животными, а также правилами проведения работ с использованием лабораторных животных в научных исследованиях, составленными на основании рекомендаций и требований «Всемирного общества защиты животных» и «Европейской конвенции по защите экспериментальных животных» (Страсбург, 1986). Развитие сахарного диабета индуцируют у беспородных белых крыс, находящихся на стандартном рационе вивария БГУ путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 100 мг/кг. Техника внутрибрюшинного введения веществ лабораторным крысам. Фиксированную крысу опускают вниз головой. Кожу живота каудальнее пупка берут в складку и у его основания прокалывают брюшную стенку, держа иглу инсулинового шприца перпендикулярно. В дальнейшем проводят иглу по ходу складки и производят инъекцию (рис. 1.3). Взятие брюшной стенки живота в складку и введение иглы по направлению складки предохраняют от повреждения иглой внутренние органы. Внутрибрюшинно крысам массой 200 – 250 г можно вводить до 5 мл жидкости. 
Рис. 1.3. Техника внутрибрюшинного введения веществ крысам Спустя 7 дней пребывания животных в стандартных условиях вивария, их умерщвляют декапитацией, кровь собирают и используют для приготовления сыворотки, как описано в п. 1.2.1. Далее проводят измерения всех биохимических маркеров, описанных в разделе 1.2. Полученные результаты вносят в табл. Таблица. Изменение основных биохимических маркеров углеводного и белкового обмена у крыс с экспериментальным сахарным диабетом
Кровь крысы (2 – 3мл) собирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 30 мин при 37 °С. По истечении указанного времени тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, кровь центрифугируют (10 мин, 3000 об/мин). Полученную сыворотку сливают в чистую пробирку и используют в дальнейшей работе.
|
ДК 577.15
