Статья биологические методы испытания

2 тани человека Нер-2с, линия клеток фибробластов мыши L-929/ вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV); клетки бычьих почек Madin-Darby MDBK, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия лимфоидных клеток человека Л, линия клеток карциномы легкого человека А, линия клеток фибробластов мыши L-929, линия клеток амниона человека WISH/ вирус везикулярного стоматита (VSV); клетки фибробластов человека вирус леса Семлики (SFV), вирус
Синдбис (virus Sindbis) или иные. Выбор комбинации клеточная культура/вирус» основывается на том,
какая из них обеспечивает наиболее чувствительный ответ для определяемого типа интерферона. В качестве СО может быть использован международный стандартный образец активности интерферона соответствующего типа или стандартный образец, откалиброванный в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту. Испытания проводят в асептических условиях.
Подготовка к испытаниям
Клетки. Требования к клеточным линиям (общие условия культивирования и пересева клеток, пассаж, на котором клетки проявляют оптимальную эффективность при проведении испытания, допустимый предел жизнеспособности клеток при пересевах и при взятии клеточной суспензии в испытание процент сформированного монослоя) указывают в нормативной документации
Испытуемые образцы препарата. Пробоподготовку испытуемых образцов проводят в соответствии с указаниями, приведенными в нормативной документации. Для некоторых лекарственных форм препаратов интерферона суппозитории, мази, гелии т.д.) при пробоподготовке необходимо экстрагирование активного вещества (интерферона) в раствор, с соблюдением сле-

3 дующих условий используемые реагенты не должны оказывать токсического действия на культуру клеток в разведениях, необходимых для исследования использование реагентов для экстрагирования должно быть обоснованным.
Индикаторный вирус. Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями в нормативной документации на лекарственное средство, содержащее интерферон. Титр вируса должен быть не менее
10 5
ТЦД/мл.
Реагенты и питательные среды.
К составу питательных сред, предназначенных для культур клеток животных и человека, предъявляют определенные требования. Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенк- са. Возможно использование стандартных коммерческих сред для ведения культур клеток Игла MEM, МЕМ, DMEM (двойная модификация среды Игла, среды 199 , среды RPMI и др. Для стимуляции роста, прикрепления и деления клеток обычно добавляют 5 – 10 % инактивированной сыворотки коров крупного рогатого скота. В среду для разведений интерферона добавляют сыворотки. Для обеспечения бактериологической стерильности в питательные среды вводят антибиотики пенициллин (натриевая соль, стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) из расчета 100—200 ЕД каждого на 1 мл среды , микостатин (нистатин) из расчета 20—25 ЕД на 1 мл или ген- тамицин (конечная концентрация 10 мкг/мл). Содержание L-глютамина в питательной среде должно быть около 292 мг/л.
В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки с добавлением антибиотиков и L-глютамина. Постоянство рН среды является одним из главных условий культивирования. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Оценить количество жизнеспособных клеток возможно при помощи

4 красителей метиленового синего, кристаллического фиолетового, тиазоли- нового синего (МТТ), Аламара голубого и других.
Раздел 1. Специфическая активность
Противовирусную активность интерферона определяют путем сравнения защитного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием стандартного образца активности интерферона (СО.
Проведение испытания
Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, полученном при температуре (37±1) Св атмосфере с (5,0±0,5) % СО в лунках луночных плоскодонных культу- ральных планшетов. Количество клеток, вносимых в каждую лунку планшета, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя при вышеуказанных условиях культивирования в течение 24-48 ч. Готовят серию разведений испытуемого препарата в среде для разведе- ний интерферона с содержанием 2 – 5 % сыворотки (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности. Параллельно готовят такие же разведения СО в среде для разведения интерферона. Рабочие разведения ИП и СО должны быть указаны в нормативной документации. Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения ИП и соответствующего СО, используя на каждое разведение не менее х лунок с культурой клеток. Возможно внесение ИП и СО в лунки планшета до внесения культуры клеток. В этом случае клеточный монослой будет формироваться с внесён- ным интерфероном. Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток – 4 лунки. В эти 20 лунок вносят поддерживающую среду.

5 луночные планшеты с культурой клеток, разведениями ИП и СО инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) Св атмосфере с
(5,0±0,5) % СО. Затем в каждую лунку с ИП и соответствующим СО вносят вирусную суспензию, содержащую рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса
 100 ТЦД
50
. В лунки контроля клеток вносят такой же объем поддерживающей среды.
Определение дозы вируса-индикатора
Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности. Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде (от 10
-1
до 10
-8
). Из лунок 96- луночного планшета с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. После этого вносят в лунки планшета, используемые для определения дозы вируса, поддерживающую среду в объеме, равном объему испытуемого образца. Затем вносят приготовленные разведения индикаторного вируса (не менее, чем по 4 лунки на каждое разведение) в объеме, равном объему внесенной до этого поддерживающей среды. луночный планшет с разведениями вируса инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) Св атмосфере с
(5,0±0,5) % СО. За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению вируса, при котором клеточный монослой в 50 % лунок оказался полностью пораженным цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах – ТЦД
50
/мл. Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле max
50
n
p
n
d
D
ED
,
где: Lg ED
50
– десятичный логарифм титра вируса
D
max
– десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла
100 % гибель клеток (+);

6 d десятичный логарифм интервала между разведениями (=1,0); n число лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (=4); р число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла гибель клеток, и последующих разведениях. После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом (100 ТЦД
50
). Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляют контроль взятой дозы вируса на 16-ти лунках с культурой клеток (по 4 лунки на каждое разведение вируса. Вносят вирус, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД
50
, и до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД
50
с коэффициентом разведения равным
10. Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными. После внесения индикаторного вируса в дозе 100 ТЦД
50 луночный планшет инкубируют в течение 24-48 ч при температуре (37±1) Св атмосфере с
(5,0±0,5) % СО до появления первых признаков цитопатических изменений в клеточном монослое с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД
50
. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД
50
индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.
Учёт активности интерферона осуществляют через 24-48 ч при выполнении следующих условий доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД
50
; в лунках с клетками и минимальными концентрациями ИП и СО, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный ци- топатический эффект (80
100 %); в лунках с контролем клеток отсутствуют признаки дегенерации.

7
Учёт активности интерферона осуществляют визуально или инструментально.
Визуальный учет активности интерферона производится микроскопически при кратном увеличении через 24-48 ч после внесения индикаторного вируса. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50 % лунок полностью защищена от ци- топатического действия вируса. Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:






 



2
max
50 2
log
n
p
n
d
D
ED
,
где: D
max
– двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла
100 % защита (
); d двоичный логарифм интервала между разведениями (=1,0); n число лунок на каждую дозу (=4); р число лунок, давших защиту () в разведении, ниже которого произошла защита, и последующих разведениях. Противовирусную активность интерферона (Ах) в исследуемом образце в МЕ вычисляют по формуле
X
CO
CO
X
a
a
A
A


, где А
со противовирусная активность СО интерферона в МЕ; ах титр ИП; а
со титр СО.
Инструментальный учет активности интерферона предполагает селективное окрашивание живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирование красителя, фотометрирование оптической плотности элюата и статистическую обработку результатов с помощью метода параллельных линий.

8 Как правило, результаты исследования снижения цитопатического эффекта соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ: зависимость значений оптической плотности элюата ИП и СО от логарифма их разведения. При расчете активности интерферона по сигмоидальным кривым ИП и СО должны быть соблюдены следующие условия Измеренные оптические плотности для ИП и СО должны находиться водном диапазоне оптических единиц, ограниченном значениями оптической плотности, измеренными в лунках контроля клеток и вируса Полученные данные должны отвечать требованиям к параллельности, линейности и величине угла наклона кривых доза- ответ для СО и ИП, указанным в нормативной документации. Используя линейный участок графика, рассчитывают титр ИП и СО, а затем рассчитывают активность интерферона по формуле
X
CO
CO
X
a
a
A
A


, где А
со противовирусная активность СО интерферона в МЕ; ах титр ИП, то есть разведение ИП, в котором наблюдается 50 е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом а
со титр СО, то есть разведение СО, в котором наблюдается 50 е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом. Описание инструментального метода приводят в нормативной документации.
Раздел 2. Подлинность Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности ИП моно- или поликлональными антителами против соответствующего типа интерферона, предусмотренными в нормативной документации на препарат. Реакцию нейтрализации противови-

9 русной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса.
Проведение испытания
Определение подлинности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток. Количество клеток, вносимых в каждую лунку луночных культу- ральных планшетов, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя в условиях культивирования при температуре (37±1) Св атмосфере с
(5,0±0,5) % СО в течение 24-48 ч. Готовят рабочие дозы ИП и СО. Для этого их разводят средой для разведения интерферона с содержанием 2 – 5 % сыворотки до одной десятой титра противовирусной активности (раздел Специфическая активность. Нейтрализующие антитела разводят средой для разведения до концентраций, указанных в нормативной документации. Для приготовления нейтрализованной смеси подготовленные разведения антител объединяют в равных объемах с рабочими дозами ИП и СО. Полученную смесь инкубируют при температуре (37±1) о Св атмосфере с
(5,0±0,5) % СО в течение 1 ч. Из лунок луночного планшета с монослоем культуры клеток удаляют ростовую среду, вносят в лунки планшета нейтрализованную смесь, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение антител. Нейтрализованную смесь допустимо вносить в лунки луночного планшета как до внесения культуры клеток, таки после него. Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции нейтрализации (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую среду на поддерживающую. Для контроля защитного действия интерферона также оставляют по 4

10 лунки на рабочие разведения СО и ИП без нейтрализующих антител. Проверяют дозу вируса-индикатора как описано в разделе 1 Специфическая активность. Индикаторный вирус в дозе 100 ТЦД
50
вносят вовсе лунки 96- луночного планшета, кроме 4 лунок, предназначенных для контроля монослоя клеток. После внесения индикаторного вируса в лунки с культурой клеток планшеты инкубируют при температуре (37±1) Св атмосфере с (5,0±0,5) % СО до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД
50
(обычно в течение 24-48 ч. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД
50
индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.
Учет и интерпретация результатов
Учёт результатов осуществляют при выполнении следующих условий доза внесённого вируса соответствует 100 ТЦД
50
; отсутствуют признаки дегенерации в контроле клеток ив лунках с рабочими разведениями СО и ИП без нейтрализующих антител. Нейтрализация активности испытуемого образца анти- интерфероновыми антителами в сравнении с СО в аналогичном разведении свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа. Подробное описание проведения реакции нейтрализации приводят в нормативной документации.

Каталог: wp-content -> uploads -> 2016
2016 -> Xx неделя здорового сердца
2016 -> Хел Херцог Радость, гадость и обед
2016 -> Правила и сроки госпитализации граждан в обуз курская городская больница
2016 -> «казұму 85 жыл: жетістіктері мен келешегі» халықаралық ғылыми-тəжірибелік конференция аясындағы «клиникалық фармация: халықаралық ТƏжірибе мен қазақстанның денсаулық сақтаудағы даму ерекшеліктері»
2016 -> Перечень видов, форм и условий медицинской помощи, оказание которой осуществляется бесплатно
2016 -> В рамках Территориальной программы бесплатно предоставляются виды помощи
2016 -> Памятка для пациента: Как предупредить появление и прогрессирование остеохондроза
2016 -> Юрий Александрович Никитин Трансчеловек Странные романы