Рак шейки матки в карелии: эпидемиологические, клинические, иммунологические и профилактические аспекты
Скачать 428.35 Kb.
|
- Навигация по данной странице:
- К О В Ч У Р Павел Иванович
- ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.
- Основные положения диссертации, выносимые на защиту
- Внедрение результатов работы
- Конкурсная поддержка и благодарности.
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Методы иммунологического и молекулярно-генетического обследований.
- = lg 2 Ct
        На правах рукописи
К О В Ч У Р Павел Иванович РАК ШЕЙКИ МАТКИ В КАРЕЛИИ: ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ, КЛИНИЧЕСКИЕ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Специальность: 14.01.12 – Онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Петрозаводском государственном университете и ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России Научный консультант: д.м.н. Бахидзе Елена Вилльевна, ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России, ведущий научный сотрудник отделения онкогинекологии Официальные оппоненты: - Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н, профессор Винокуров Владимир Леонидович, ФГБУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства Здравоохранения Российской Федерации, руководитель отделения радиохирургической гинекологии - д.м.н. Киселева Екатерина Прохоровна, Институт экспериментальной медицины РАМН, отдел иммунологии, ведущий научный сотрудник - д.м.н., доцент Лялина Людмила Владимировна, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, руководитель лаборатории эпидемиологии Ведущее научное учреждение: Первый Санкт-Петербургский государственный университет имени академика И.П. Павлова Защита состоится _____ ______________ 2014 года в _______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России по адресу: 197758 г. Санкт–Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68. Тел.: (812) 456-78-98, Факс: (812) 596-89-47. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (197758 г. Санкт–Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, д. 68). . Автореферат разослан ______ ______________ 2014года. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор И.И.Семенов ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Согласно статистическим данным WHO/ICO (https://www.who.int/hpvcentre), рак шейки матки (РШМ) – второе по встречаемости онкологическое заболевание среди женщин и является одной из главных причин смертности женщин, страдающих онкологическими заболеваниями [Ferlay J, et al., 2013]. Пятилетняя выживаемость больных РШМ в России составляет не более 45%, при I стадии этот показатель достигает 86,7%, при II – 51,7%, а при III – 31,6% [Мерабишвили, В.М., и соавт., 2012, Чиссов В.И., и соавт., 2011, Давыдов М.И., и соавт., 2011]. Несмотря на то, что за последние годы в России отмечен незначительный рост показателей 5-летней наблюдаемой и относительной выживаемости больных РШМ с 46,1 до 49,3% наблюдаемой и с 51,5% до 54,3% относительной выживаемости за 1994-2000гг и 2001-2005 гг [Мерабишвили В.М., и соавт., 2012], около 50% больных инвазивными формами РШМ не переживают пятилетний период наблюдений после лечения В странах Европы [Berrino F. и соавт., 2003; Sant M., и соавт., 2009], и США показатель 5-летней относительной выживаемости несколько выше, но не превышает 70% [Verdecchia A., и соавт., 2007]. Таким образом, в настоящее время усовершенствование методов лечения инвазивных форм РШМ не решает проблему снижения смертности от этого заболевания, которая является ведущей причиной смерти от онкологических заболеваний у женщин 15-39 лет [Чиссов В.И., и соавт., 2009]. Поскольку РШМ – единственная злокачественная опухоль, для которой установлен доказанный этиологический фактор – вирус папилломы человека (ВПЧ) и существует надежный метод цитологического скрининга решение проблемы снижения смертности от РШМ лежит в русле снижения заболеваемости инвазивными формами. Низкая заболеваемость РШМ наблюдается в странах с высоким экономическим уровнем, где и зависящим от него уровнем применяемых в стране профилактически мер, и, прежде всего, с уровнем цитологического скрининга и охвата женского населения этим скринингом [Бахидзе Е.В. и соавт., 2012]. Результаты многочисленных исследований показывают, что отсутствие в большинстве регионов РФ организованного цитологического скрининга (ЦС), как основного механизма вторичной профилактики РШМ, не позволяет выстраивать эффективную систему противораковых мероприятий в данной области [Давыдов М.И., и соавт., 2011, Леонов М.Г., 2011, Лялина Л.В., 2011, Мерабишвили В.М. и соавт., 2012, Хасанов Р.Ш. и соавт., 2011]. В связи с этим представляется целесообразным провести анализ клинико-эпидемиологической обстановки в отдельном регионе (Республике Карелия. РК) за 15 летний период (1998—2012 гг), который позволит оценить имеющийся уровень ранней диагностики РШМ и сопоставить ее с показателями охвата ЦС в районах. С другой стороны, значительный рост РШМ, высокий процент запущенных форм, малоудовлетворительные результаты лечения определяют необходимость поиска новых методов углубленной диагностики и оценки степени распространения РШМ [Ашрафян Л.А., и соавт., 2009, Бахидзе Е.В., и соавт., 2012, Козаченко В.П., и соавт., 2009, Коломиец Л.А., и соавт., 2012, Максимов Я.В., и соавт., 2012, Новик В.И., 2012, Новикова Е.Г., и соавт., 2010, Прилепская В.Н., и соавт., 2013, Anttila A., 2010, Arbyn M, et al., 2012, Yang, H.P., 2012]. Развитие и прогрессия РШМ этиологически обусловлено двумя неразрывно связанными, взаимно определяющими аспектами – молекулярно-генетическим профилем опухоли и иммунным статусом пациентки [Patel S, et al., 2009, Hwang S.J., et al., 2012, Имянитов Е.Н., 2012]. При этом иммунный статус служит основой, формирующей условия для персистенции ВПЧ и индукции развития РШМ [Moody C.A. и соавт., 2010, Кадагидзе З.Г, и соавт., 2013, Орнер И.Ю., и соавт., 2010]. , Одним из важных процессов, связанных с подавлением противоопухолевого и противовирусного иммунного ответа под влиянием вирусов, является апоптоз иммунных клеток [Jäger R, и соавт., 2010]. Главными эффекторами данного процесса являются каспазы, индукция которых может происходить под воздействием опухолевых и вирусных факторов [Ibrahim R, и соавт., 2006, Das H, и соавт., 2007, Mahata, S., 2011]. В настоящее время имеются только экспериментальные данные, оценивающие уровень мРНК и активность каспаз в клетках эпителия шейки матки и в лейкоцитах периферической крови при развитии РШМ [Ekonomopoulou M.T, и соавт., 2011; Jäger R, 2010, Tungteakkhun S. S, и соавт., 2010, Wang W, и соавт., 2011, Würstle M.L, и соавт., 2010]. Между тем, некоторые транскрипционные факторы, в частности c-Myc, c-Fos и c-Jun, активирующиеся при стимуляции покоящихся клеток ростовыми факторами, и участвующие в регуляции процессов клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и РШМ могут быть перспективными маркерами и мишенями для терапевтического воздействия [Eilers M., и соавт., 2008, Shaulian E., и соавт., 2010]. Однако большинство вопросов, касающихся установления связи между активностью этих генов и клинико-патологическими характеристиками РШМ, остаются открытыми [Mahata, S., 2011, Mason J.M., 2009, Gustafson W.C., и соавт., 2010]. Все вышеизложенное позволяет считать чрезвычайно актуальным, исследование сложных вопросов молекулярно-генетических изменений, вызываемых ВПЧ и их корреляций с иммунологическими и клиническими параметрами в процессе развития опухолевого процесса, и на фоне анализа эпидемилогических данных в регионе Республика Карелия оценить возможности применения полученных данных с целью решения проблемы ранней диагностики и новых методов лечения преинвазивного и микроинвазивного РШМ.
1. Исследовать динамику заболеваемости и смертности РШМ и рака in situ шейки матки у женщин Республики Карелия с 1998 по 2012 гг. 2. Изучить вирусологические параметры при предраке и РШМ у женщин разных возрастных групп. 3. Оценить состояние состояние клеточного и гуморального иммунитета по результатам количественного анализа субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови (Т-хелперов, цитотоксических, регуляторных Т-клеток, В-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток) и предрасположенность данных клеток к апоптозу при развитии и прогрессии РШМ. 4. Изучить экспрессию генов каспаз -3,-6,-8,-9 на уровне мРНК и протеазной активности в клетках цервикального эпителия и лейкоцитах крови у больных с ЦИН 3 и РШМ. 5. Изучить экспрессию генов раннего пролиферативного ответа (c-myc, c-fos, c-jun) на уровне мРНК и количества белка в клетках цервикального эпителия пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями 3 степени (ЦИН 3) и РШМ I-IV стадий. 6. Разработать программу комплексного обследования пациенток с целью раннего выявления предрака и ранних форм рака шейки матки. 7. Исследовать влияние комплексной терапии на показатели клеточного иммунитета и апоптоза пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ. 8. Разработать рекомендации по оптимизации системы профилактики РШМ.
1. Уровень ранней диагностики РШМ определяется частотой выявления дисплазии и карциномы in situ по отношению к инвазивным формам РШМ, что отражает полную картину диагностики и представление о проводимом цитологическом скрининге в Республике Карелия. 2. Развитие и прогрессия РШМ сопровождается нарушением клеточного и гуморального иммунитета по результатам количественного анализа субпопуляций иммунокомпетентных клеток крови (Т-хелперов, цитотоксических, регуляторных Т-клеток, В-лимфоцитов, натуральных киллерных клеток) и предрасположенностью данных клеток к апоптозу. 3. Развитие и прогрессия РШМ сопровождаются усилением активности Fas-регулируемой инициаторной каспазы-8 и эффекторных каспаз -3 и -6 вследствие активации CD95-зависимого пути апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови. 4. Развитие РШМ связано со становлением агрессивного апопто-резистентного фенотипа в опухолевых клетках за счет подавления протеолитической активности инициаторной каспазы-9 и эффекторных каспаз -3 и -6. 5. Развитие РШМ характеризуются специфичным паттерном активности генов c-myc, c-fos, c-jun. 6. Применение комплексного лечения (хирургическое + иммунотерапия) у пациенток с ЦИН 3 и микроинвазивным РШМ значительно чаще приводит к элиминации ВПЧ по сравнению с одним только хирургическим лечением, что доказывается достоверным снижением ВПЧ-позитивных пациенток и отсутствием онкобелка Е7. 7. Изменения апоптотической программы в лимфоцитах периферической крови и иммунологических показателей у больных преинвазивным и микроинвазивным РШМ носят системный, но обратимый характер и не наблюдаются через 3 месяца после комплексного лечения. 8. Предложенная двухэтапная модель вторичной профилактики РШМ будет способствовать снижению заболеваемости и смертности от инвазивных форм РШМ.
Впервые дана оценка уровня диагностики РШМ с учетом рака in situ, I и II стадии, проведено сопоставление с показателями охвата ЦС в районах РК за 1998 – 2012 гг. Доказано, что ранняя диагностика РШМ связана с охватом ЦС в Карелии. Это позволило выделить 3 группы районов с различным ее уровнем. При этом широта охвата ЦС женщин в районах с уровнем выше 80% составила от 50 до 72,7%; в районах с относительно низким уровнем этого показателя (70% и менее) – соответственно от 29 до 40,2%. Проведено комплексное динамическое исследование вирусологического, кольпоскопического, молекулярно-генетического параметров на этапах скрининга, диагностики, лечения и последующего мониторинга ЦИН 3 и РШМ, при котором получены новые данные о частоте выявления ВПЧ среди пациенток с патологией шейки матки в РК и о частоте встречаемости среди них различных генотипов ВПЧ. В результате этого исследования обнаружен комплекс фенотипических изменений в лимфоцитах крови при РШМ, их количественного состава и функционального состояния, которые усиливаются при прогрессии опухоли. При этом впервые обнаружено, что изменение функциональной активности лимфоцитов крови у больных с РШМ обусловлены активацией Treg супрессорных клеток, экспрессирующих маркер CD25, функциональное состояние которых у больных с ЦИН 3 и РШМ впервые оценено по уровню экспрессии гена трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1) и уровню экспрессии гена транскрипционного фактора (FOXP3) в лимфоцитах периферической крови (ЛПК). Выявлено, что роль иммунной системы при развитии РШМ трансформируется. Это проявляется в последовательной смене противоопухолевого иммунного ответа толерантностью, анергией, а затем наступает этап, когда иммунная система способствует развитию РШМ и становится фактором опухолевой прогрессии. Одним из таких механизмов в развитии РШМ является сдвиг в дифференцировке Treg-клеток (Th1, Th3) и активация супрессорных субпопуляций с фенотипом CD4+CD25+ (Tr1) с соответствующими изменением спектра секретируемых цитокинов (усиление синтеза TGF-β и др). В рамках диссертационной работы впервые показано, что изменения апоптотической программы в лимфоцитах периферической крови и иммунологических показателей у больных преинвазивным и микроинвазивным РШМ носят системный, но обратимый характер и не наблюдаются через 3 месяца после комплексного лечения. Практическая значимость На основании полученных эпидемиологических данных в РК доказано, что уровень диагностики РШМ с учетом рака in situ, I и II стадии отражает полную ее картину и дает полное представление о проводимом цитологическом скрининге. Выделены группы районов с различным уровнем РДД: районы уровнем диагностики выше 80% и уровнем ЦС от 50 до 72,7%; районы с относительно низким уровнем диагностики от 70% и менее, где уровень ЦС от 29 до 40,2%. Показано, что уровень диагностики РШМ объективно отражает скрининг, проводимый в Карелии. При этом отмечено, что за последние годы ее уровень повысился, и продолжаются дальнейшие организационные мероприятия по повышению эффективности ЦС в районах Карелии. На основании полученных данных обоснована целесообразность применения иммунологических исследований в комплексной диагностике, оценке результатов лечения, а также для мониторинга больных с РШМ. Выявленные прогностические иммунологические факторы дают возможность гинекологам и онкогинекологам оценивать радикальность выполненной операции и прогноза заболевания. Динамика и мониторинг экспрессии транскрипционных факторов c-Myc, c-Fos и c-Jun у больных с ЦИН 3 и инвазивном РШМ также может рассматриваться в качестве дополнительного диагностического маркера, так прогноза заболевания. Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, могут являться основой для последующей разработки диагностических тест-систем, направленных на повышение специфичности, объективности и точности критериев диагностики интраэпителиальных неоплазий и ранних стадий рака шейки матки. Гены раннего ответа (c-myc, c-fos, c-jun) и каспазы могут быть использованы в качестве биомаркеров, характеризующих степень смещения баланса между процессами пролиферации и апоптоза вместе с маркерами ангиогенеза, инвазии и другими. Изученные параметры иммунного статуса могут быть использованы для долгосрочного наблюдения пациенток после курса лечения в комплексе со стандартным клиническим обследованием, тестом на ВПЧ и цитологическим исследованием. Результаты диссертационного исследования позволили на этапе преинвазивного и инвазивного РШМ предложить модель вторичной профилактики РШМ. Полученные результаты в рамках работы позволяют рекомендовать тест на ВПЧ параллельно с цитологическим скринингом на основе комплексного подхода к диагностике заболеваний шейки матки. При этом поиск ранних диагностических маркеров ВПЧ-индуцированного злокачественного роста, таких как транскрипционные факторы c-Myc, c-Fos и c-Jun позволит повысить раннюю диагностику предрака и ранних форм РШМ и дифференцированно и индивидуально подходить к выбору эффективного лечения.
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность ГУЗ «Республиканский онкологический диспансер» МЗ Республики Карелия (Петрозаводск, Лососинское шоссе, 11). Результаты исследования внедрены также в практическую деятельность акушеров-гинекологов женских консультаций г. Петрозаводска и районов Республики Карелия, а также в в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова в рамках НИР 5.3. Материалы диссертации используются в учебном процессе преподавания кафедр лучевой диагностики, лучевой терапии, онкологии, фтизиатрии и урологии, госпитальной хирургии, акушерства и гинекологии медицинского факультета Петрозаводского государственного университета (Петрозаводск, пр. Ленина, 33). Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, ГК № 2012-1.2.1-12-000-1014-027.
Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном научном семинаре кафедры лучевой диагностики, лучевой терапии, онкологии, фтизиатрии и урологии, Лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета Петрозаводского государственного университета (ПетрГУ) и кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ 15 ноября 2013 года. Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (отделение онкогинекологии) 17 декабря 2013 г. Основные положения и выводы диссертационной работы представлены на VIII Всероссийском съезде онкологов (Санкт-Петербург, 2013); на Международном онкологическом научно-образовательном форуме ОНКОХИРУРГИЯ-2012 (С-Петербург, 2012), ОНКОХИРУРГИЯ-2010 (Москва, 2010); на IX, X, XI, XII, XIII, XIY Всероссийских научных форумах «Мать и дитя» (Москва, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013). В материалах 4, 5 съездов акушеров-гинекологов России (Москва, 2008, 2013). На Всероссийских конгрессах «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» (Москва, 2010, 2012, 2013). На Международном симпозиуме «Папилломавирусная инфекция и злокачественные новообразования» (Санкт-Петербург, 2009, 2011). На XIY, XY, XYI, XYII Всероссийских Конгрессах «Экология и здоровье человека» (Самара, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013). На IX, X Международных конференциях «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2008, 2009); на III и IV Всероссийских научно-практических конференциях «Цитоморфометрия в медицине и биологии» (Москва, 2010, 2011); на VI Всемирном конгрессе по иммунопатологии и респираторной аллергии (Москва, 2011); на VII Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры геномов и системной биологии (Bioinformatics of Genome Regulation and Structure\Systems Biology — BGRS\SB-2010) (Новосибирск, 2010); на XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2010); на V Всероссийской Симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); на Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); на III Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Ялта, 2011); на I Всероссийской конференции «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (Санкт-Петербург, 2011); на XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011); на I Международной научной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы» (Казань, 2012); на научно-практической конференции с международным участием «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2009); на Международном конгрессе по патологии шейки матки (Москва, 2003), на Российской научно-практической конференции «Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике» (Москва, 2007); на Международной конференции «Профилактика рака шейки матки – взгляд в будущее» (Москва, 2008); «Ранняя диагностика, профилактика и современные методы лечения заболеваний шейки матки» (Москва, 2009); «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии» (Москва, 2010); Симпозиум в помощь практическому врачу: «Современные научные направления и актуальные клинические вопросы в акушерстве и гинекологии» (Москва, 2011). Центр лазерной медицины С-Петербурского государственного медицинского университета «Диагностика, профилактика и лечение заболеваний шейки матки, влагалища и наружных половых органов» (Санкт-Петербург, 2011), на II Российском симпозиуме с международным участием «световой режим, старение и рак» (Петрозаводск, 2013). Материалы научно-практической конференции акушеров-гинекологов и онкогинекологов Республики Карелия (2003, 2004, 2005, 2007, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013). На Международном конгрессе «The 14th Biennial Meeting of the International Gynecologic Cancer Society» (Vancouver, Canada, 2012); на Международном конгрессе «The 28th Congress of the new European Society for Comparative Physiology and Biochemistry ESCPB» (Bilbao, Spain, 2012); на Международном конгрессе по иммунологии «15th International Congress of Immunology» (Milan, Italy, 2013). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 89 научных работ, из них 25 в центральных изданиях, 1 монография и 2 пособия для врачей. На основании результатов исследования подана заявка в Роспатент на изобретение «Способ дифференциальной диагностики цервикальных дисплазий и рака шейки матки» (№ 2012157453 от 26.12.2012 г). Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 2 глава – изложение материала и методов обследования и лечения больных, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 326 страницах машинописного текста, иллюстрирована 69 рисунками и 112 таблицами. Библиографический указатель содержит 76 работы отечественных и 307 зарубежных авторов. Конкурсная поддержка и благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность доц., д.м.н Бахлаеву И.Е., проф., д.б.н. Волковой Т.О., д.б.н. Олейник Е.К. за всестороннюю помощь в подготовке диссертационной работы, заведующей кафедрой молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ, д.б.н., проф., чл.-корр. РАН Немовой Н.Н. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В основу диссертационной работы на 1 этапе легли результаты клинико-эпидемиологический анализа 552 случаев рака in situ и 1248 случаев инвазивного РШМ за период 1998 по 2012 гг (за 15-летний период). Для решения поставленных задач были применены клинические, кольпоскопические, цитологические, вирусологические, морфологические, иммунологические и молекулярно-генетические методы обследования В оценке стадии РШМ и степени распространенности первичной опухоли пользовались Международной клинической классификацией TNM (6-ое издание, 2002) и FIGO (1994). Рак in situ шейки матки установлен у 552 (30,7%) больных, I стадия РШМ – у 602 (33,4%), II – у 311 (17,3%), III – у 271 (15,1%) и IY – у 64 (3,6%) больных. Морфологическую структуру опухоли определяли в соответствии с Международной гистологической классификацией новообразований шейки матки (ВОЗ, 2002 г). (Табл. 1) Таблица 1 Характеристика больных РШМ в зависимости от гистологической структуры и стадии заболевания (Абс., %)
Изучение стадийности заболевания в различных возрастных группах в РК показало, что наибольшее число больных раком in situ было в возрасте 18 – 35 лет, I стадией РШМ в 31–40 лет, II, III и IV стадиями в 41–60 лет (Табл. 2). Таблица 2 Распределение больных раком in situ и РШМ по возрастным группам в РК (1998–2012 гг.)
Корреляция стадийности заболевания РШМ с возрастом пациенток прослеживается только при раке in situ и I стадии РШМ. Из общего числа заболевших, женщины в возрасте до 50 лет составляют 73,8% (1329). Отмечено увеличение заболеваемости в возрасте до 30 лет с 9 (12%) в 2003г. до 53 (28,04%) случаев в 2012г. Причем у 171 (9,5%) из 1800 больных, рак диагностирован в возрасте от 18 до 25 лет. Следует отметить, что рaк in situ в 93,1% (514) диагностируется в возрасте от 18 до 50 лет от всех поставленных на учет женщин с раком in situ шейки матки, а после 50 лет рак in situ диагностируется всего в 6,9% случаев (Табл. 1). В 73,9% случаях с раком in situ (n= 552), в 61,3% с РШМ I (n= 602) стадии и 16,7% с РШМ II стадии больные жалоб не предъявляли, но при III и IY стадиях РШМ жалобы предъявляли практически все. При этом пятнадцатилетняя выживаемость при преинвазивном РШМ равна 100%, при I стадии – 94,9%, при II стадии – 72,0%, при III стадии – 33,9%, при IY стадии – 14,1%, что показывает достоверную линейную зависимость смертности больных с РШМ от возраста и стадии заболевания (Р<0,05), что согласуется с данными литературы [Бахидзе Е.В., и соавт., 2011, Козаченко В.П., и соавт., 2009, Мерабишвили В.М., и соавт., 2012, Новикова Е.Г., и соавт., 2010]. Таблица 3 Смертность больных с РШМ по возрастным группам в Карелии (%) (1998 – 2012 гг.)
Проведенный анализ результатов работы центральной цитологической лаборатории (ЦЦЛ) в РК (1998-2012 гг.) показал, что процентное содержание РШМ, выявленных при ЦС от всех взятых на учет с данным заболеванием составил 47,1 % (847 случаев рака in situ и рака из 1800 были выявлены при ЦС). Среднероссийский показатель составляет 28,9% [Чиссов В.И. и др., 2012]. В остальных случаях (52,9%) показанием для углубленного обследования были наличие клинически выраженного РШМ у пациентки и/или выявление ВПЧ-инфекции с дальнейшим углубленным обследованием шейки матки. На 2 этапе комплексно обследовано 231 пациентка с РШМ и 535 пациенток с предопухолевыми заболеваниями шейки матки. Контрольную группу составили 45 практически здоровых доноров без патологии шейки матки и ВПЧ (контрольная группа №1) и 30 больных с преинвазивным и микроинвазивным раком шейки матки (контрольная группа №2) (рис. 3). Образцы ткани и периферической крови были получены от 186 пациенток, оперированных в ГБУЗ «Республиканский онкологический диспансер» Республики Карелия в 2010-2012 гг. Обследовано 75 больных с ЦИН 3 степени тяжести (средний возраст 32,9±7,4), в том числе 32 – с дисплазией 3 степени, 43 – с преинвазивным раком (Cr in situ); и 81 − с плоскоклеточным РШМ, в том числе 45 – со стадией IА (средний возраст 31,3±6,0), 21 – стадией II (средний возраст 43,6±13,2), 15 – стадией III-IV (средний возраст 46,9±11,1). Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержденный диагноз ЦИН 3 и РШМ. Стадирование эпителиальных дисплазий проводилось в соответствии с «Международной статической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем. 10 пересмотр (МКБ-X)» (ВОЗ, Женева, 1995г.), Гистологической классификацией опухолей женского полового тракта (ВОЗ, 1995), РШМ – в соответствии с Международной классификацией по системе TNM, 6-е издание [TNM, 2003], и системой Международной федерации акушеров и гинекологов (FIGO, 1994 г.). Все пациентки были проинформированы об участии в исследовании и дали добровольное письменное согласие. Используемые в диссертации методы исследования были одобрены Комитетом по медицинской этике ПетрГУ и Минздравсоцразвития РК. Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержденный диагноз ЦИН 3 и РШМ. Стадирование эпителиальных дисплазий проводилось в соответствии с «Международной статической классификацией болезней и проблем, связанных со здоровьем. 10 пересмотр (МКБ-X)» (ВОЗ, Женева, 1995г.), Гистологической классификацией опухолей женского полового тракта (ВОЗ, 1995), РШМ – в соответствии с Международной классификацией по системе TNM, 6-е издание [TNM, 2003], и системой Международной федерации акушеров и гинекологов (FIGO, 1994 г.). Все пациентки были проинформированы об участии в исследовании и дали добровольное письменное согласие. Используемые в диссертации методы исследования были одобрены Комитетом по медицинской этике ПетрГУ и Минздравсоцразвития РК.
Всем вошедшим в исследование больным перед операцией проводилась расширенная кольпоскопия (кольпоскоп Leisengang, Германия). Оценка кольпоскопической картины основывалась на классификации International Federation for Cervical Pathology and Colposcopy (IFCPC, 2002 г.). Материал забирали в день проведения операции диатермоконизации шейки матки (аппарат «Сургитрон») или гистерэктомии. От каждой пациентки были получены 2 фрагмента ткани из патологической зоны, которая определялась визуально и кольпоскопически, и 1 фрагмент морфологически здоровой ткани шейки матки (контроль), находящейся за пределами патологической зоны (контрлатеральное расположение от участка РШМ). Образцы ткани сразу помещались в микропробирки с раствором для стабилизации РНК в биоматериале EverFresh RNA («Клоноген», Санкт-Петербург), замораживались и далее хранились при -80°С. Непосредственно перед операцией у пациенток производился забор венозной крови в пробирки VacuTube (5 или 10 мл), содержащие 3,8%-ный раствор цитрата, после чего пробирки помещались в лед. Фракцию мононуклеарных клеток (МНПК) выделяли сразу после забора крови стандартным методом на градиенте фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см3 (НПП «Панэко», Россия), полученную суспензию клеток использовали непосредственно или замораживали в среде RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург) с добавлением 20% фетальной сыворотки быка и 10% диметилсульфоксида и хранили при -80°С. Также кровь была взята у 45 здоровых небеременных женщин, сопоставимых по возрасту, данным анамнеза, не имеющих патологии шейки матки и ВПЧ (контрольная группа). Контрольная группа №1, возрастные характеристики: 23,4±0,9 (n=15); контрольная группа №2 (33,3±1,7 лет) (n=15); контрольная группа №3 (46,7±11,1 лет) (n=15). У пациенток с ЦИН 3 и РШМ IA стадии осуществлялся повторный забор крови и исследование иммунологических показателей через 1 и 3 мес. после операции диатермоконизации и лечения препаратом Аллокин-альфа. Препарат вводился подкожно в дозе 1 мг 6 раз в течение двух недель. Контрольную группу №2 составили пациентки с ЦИН 3 (n=15) и РШМ (n=15) стадии IA, получившие только хирургическое лечение. По анамнезу, данным вирусологического и гистологического исследований рассматриваемые группы не различались. Методы иммунологического и молекулярно-генетического обследований. Исследования проводились в республиканском онкологическом диспансере г. Петрозаводска, на кафедре молекулярной биологии, биологической и органической химии эколого-биологического факультета, в лаборатории молекулярной генетики врожденного иммунитета ФГБОУ ВПО ПетрГУ (зав. кафедрой – д.б.н. проф., чл.-корр. РАН Немова Н.Н.). В лаборатории иммунологии (зав. – докт. биол. наук Е.К. Олейник) Карельского научного центра РАН. Иммунофенотипирование МНПК осуществляли с помощью моноклональных антител, специфичных к дифференцировочным антигенам (CD3, CD4, CD8, CD16, CD20, CD25, CD95) («Sigma», США). Полученные препараты анализировали методом флуоресцентной микроскопии (Nikon ECLIPSE TS100, Япония). Для иммунофенотипирования лимфоцитов цельной крови методом проточной цитометрии использовали моноклональные антитела CD4-FITC, CD3-ECD, CD8-PC5, CD19-PE, CD45RO-FITC, CD45RA-ECD, CD25-PC5, CD4-PC7 («Beckman Coulter», США) и соответствующие изотипические контроли. Лизис эритроцитов и фиксацию лимфоцитов в пробе проводили на автоматической станции пробоподготовки TQ-Prep с использованием системы реагентов Immunoprep. Сбор данных производили на проточном цитометре FC500 с применением программного обеспечения CXP 2.0 («Beckman Coulter», США). Выделение тотальной РНК лимфоцитов проводили из 100 мкл цельной крови с использованием набора реагентов «YellowSolve» (АОЗТ «Клоноген», Санкт-Петербург) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Очистку тотальной РНК от примесей геномной ДНК осуществляли с помощью ДНазы (ООО «Силекс», Москва). Чистоту препарата РНК оценивали на спектрофотометре «SmartSpec Plus» («Bio-Rad», США). Нативность РНК определяли методом электрофореза в агарозном геле. Синтез комплементарной ДНК проводили из 1 мкг тотальной РНК с использованием случайных гексапраймеров и MMLV-обратной транскриптазы (ООО «Силекс», Москва) в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Москва). Синтезированную комплементарную ДНК хранили при температуре – 20 ºС. Праймеры к нуклеотидным последовательностям исследуемых генов (TGF-β1, TGF-βRII, FOXP3) и референсного гена GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени подбирали с использованием программы Beacon Designer 5.01 («Premier Biosoft», США). Амплификацию кДНК, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени проводили с использованием реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I (НПК «Синтол», Москва) на приборе «iCycler Thermal Cycler» («Bio-Rad», США) с программным обеспечением «iQ5 Optical System Software» версия 2.0 («Bio-Rad», США). Все реакции проводили в триплетах. Уровнь экспрессии исследуемых генов определяли относительно количества мРНК гена GAPDH методом 2–∆∆Ct (Livak, 2001). Уровень экспрессии генов TGF-β1 и FOXP3 определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, совмещенной с обратной транскрипцией (Real-Time RT-PCR) [Bustin S.A. 2002]. Пробы крови в объеме 3 мл забирали в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт K3EDTA в концентрации 2 мг/мл. Суммарную РНК лимфоцитов выделяли из цельной крови с использованием набора реагентов YellowSolve (Клоноген) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Очистку препарата РНК от примесей геномной ДНК осуществляли с помощью ДНКазы (Силекс). Процедуру обратной транскрипции проводили с использованием случайных гексапраймеров и MMLV–обратной транскриптазы (Силекс) в амплификаторе «Терцик» (ДНК–технология). Амплификацию кДНК исследуемых генов, а также анализ продуктов амплификации в режиме реального времени проводили на приборе «iCycler Thermal Cycler» с использованием реакционной смеси с интеркалирующим красителем SYBR Green I (Синтол) и программного обеспечения «iQ5 Optical System Software» версия 2.0 (Bio-Rad). Праймеры к нуклеотидным последовательностям исследуемых генов подобраны с использованием программы Beacon Designer 5.01 (Premier Biosoft). Относительный уровень экспрессии генов TGF-β1 и FOXP3 определяли по уровню мРНК референсного гена GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). Определение активности каспаз проводили спектрофлуориметрическим методом с использованием специфических субстратов, меченных 7-амино-4-трифторметилкумарином («BioRad», США). Субстрат для каспазы-3 – DEVD (Asp-Glu-Val-Asp), для каспазы-6 – VEID (Val-Glu-Ile-Asp), для каспазы-8 – LETD (Leu-Glu-Thr-Asp), для каспазы-9 – LEНD (Leu-Glu-His-Asp). Относительную активность каспаз вычисляли как ∆S/∆t, где ∆S – изменение интенсивности флуоресценции (оптической плотности) (отн. ед.) за промежуток времени ∆t (мин). Полученную величину умножали на 104. Уровень экспрессии мРНК генов раннего ответа и генов каспаз в ткани
Уровень экспрессии белков c-Myc, c-Fos и c-Jun анализировали методом Western-блоттинга с хемилюминесцентной детекцией. В работе были использованы препараты моноклональных антител: c-Jun (G-4):sc-74543, c-Fos (D-1):sc-8047, c-Myc (9E10):sc-40 («SantaCruz», США). Анализ повреждений ДНК (одно- и двунитевых разрывов) в опухолевых клетках проводили по изменению параметров флуоресценции двух ДНК-тропных красителей: бромистого этидия (БЭ) («Sigma», США) и 4, 6-диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ) («Serva», США), в соответствии с методикой, описанной в [Анисимов, А.Г., 1999, Cook, P.R., 1978]. Каталог: sites -> default -> files -> files files -> Галины Чулуевны Махаковой. Приветственное слово директора фгу нии урологии, профессора Олега Ивановича Аполихина. 10. 20 12. 00 Пленарное заседание files -> Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук files -> Выявление и лечение минимальных форм рака молочной железы 14. 01. 12-онкология files -> Осторожно, грипп! Кому показана вакцинация против гриппа? files -> Уропронорм производитель: ООО «Оптисалт», Россия Форма выпуска files -> Планы семинарских занятий для студентов исторических специальностей Челябинск 2015 ббк т3(2)41. я7 В676 files -> Планы семинарских занятий для студентов очного обучения неисторических специальностей Челябинск 2014 ббк т3(2). я7 В676 Скачать 428.35 Kb. Поделитесь с Вашими друзьями:
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||