Дипломная работа «Определение аминокислот в пищевых продуктах»
Скачать 0.83 Mb.
|
- Навигация по данной странице:
- 2.3. Выделение и очистка белков
- 2.4. Структура и уровни организации белковой макромолекулы
- 2.4.1. Первичная структура белковой макромолекулы
- 2.4.2. Вторичная структура белковой макромолекулы
- Рис. 2.
- Супервторичные структуры.
- Рис.5.
- Рис. 6.
3. Защитную функцию. В ответ на поступление в организм веществ, несущих на себе отпечаток генетической чужеродности, синтезируются специфические защитные белки-антитела. Защитная функция белков проявляется также в способности их к свертыванию (фибриногенезу), что защищает организм от потери крови при ранениях. 4. Сократительную функцию. Специфические белки мышечной ткани (актин, миозин) играют главную роль в акте мышечного сокращения и расслабления. Сократительной способностью обладают также белки клеточного центра, обеспечивающие расхождение хромосом в процессе митоза. 5. Структурную функцию. Первое место по количеству среди белков тела человека занимают структурные белки (коллаген, кератин, эластин). Белки участвуют в образовании клеточных мембран, межуточного вещества соединительной ткани, в комплексе с углеводами входят в состав ряда секретов (муцин, мукоиды). 6. Гормональную функцию. Гормональная регуляция занимает важное место в регуляции обмена веществ, а ряд гормонов представлен белками, полипептидами или производными аминокислот. 7. Питательную (резервную) функцию. Существуют специальные резервные белки, осуществляющие питание плода (овальбумины) и ребенка (альбумины, казеин). Кроме того, белки участвуют в экспрессии генетической информации, передаче нервных импульсов, поддерживают онкотическое давление крови и клеток, обеспечивают гомеостаз рН внутренней среды организма. 8. Рецепторную функцию. Играют важную роль при передаче нервного импульса в клетку или ее некоторые компартменты. Рецепторы локализованы в мембранах, и механизмы передачи информации связаны в основном с изменениями конформации белка, поглощением или выделением энергии. 9.Токсическую функцию. Такие белки представлены токсинами яда змей, скорпионов, пчел. Они характеризуются низкой молекулярной массой. Токсины растений и микроорганизмов более разнообразны по форме и молекулярной массе. Наиболее распространенными из них – дифтерийный белок, холерный токсин, рицин, абрин. В органах и тканях животных содержится большое количество белков. На долю белков в человеческом теле приходится 45% от сухой массы. Наиболее богаты белком поперечно-полосатые мышцы, легкие, селезенка и почки (72-84%). К органам с умеренным содержанием белка относится кожа, мозг и нервная ткань, сердце, органы пищеварительной системы (47-63%). В твердых тканях костей, зубов и в жировой ткани белки содержатся в небольшом количестве (14-20%). 2.3. Выделение и очистка белков Белки обладают особой чувствительностью к действию большинства химических реагентов (кислот, щелочей, органических растворителей) и разрушаются при нагревании, перегонке, возгонке, экстракции. При этом белок очень легко теряет свои природные (нативные) свойства и переходит в денатурированное состояние. Поэтому, чтобы избежать денатурации белка все операции с ним проводят в мягких условиях (5ºС), нейтральной среде, нормальном атмосферном давлении и избегают действия резких химических реактивов. Существуют следующие этапы выделения белков из биологического материала: измельчение → выделение → очистка → оценка гомогенности Для успешного выделения белков из биологического материала необходимо предварительное измельчение тканей. Измельчение проводят на валовых, шаровых мельницах, в гомогенизаторах, а также с помощью попеременного замораживания и оттаивания тканей. Хорошие результаты дает метод «азотной бомбы». После того, как достигнуто хорошая гомогенизация тканей переходят к этапу выделения белков. Для этой цели белки сначала высаливают. Механизм высаливания связан со способностью солей разрушать гидратную оболочку растворенных белковых молекул, что приводит к их дальнейшей агрегации и осаждению. Далее используют ряд методов концентрирования, причем наиболее эффективными являются хроматографические процедуры. К преимуществам хроматографических методов можно отнести технологическую гибкость, динамичность, а также отсутствие химического взаимодействия в системе сорбат-сорбент. Наибольшее распространение нашли следующие виды хроматографии:
После стадии концентрирования получают продукт, содержащий 50-80% целевого вещества, поэтому на данном этапе необходима стадия тонкой очистки. В данном случае применяют различные методы, например:
После того, как достигнуто выделение целевого продукта, то переходят к этапу очистки белка от низкомолекулярных примесей. На данном этапе используют следующие методы:
После этапа очистки белка необходимо провести оценку гомогенности белка, т.е. оценить его однородность. Существуют различные методы оценки гомогенности, однако наиболее надежным является графический. Он основан на построении и изучении графика зависимости навески белка, взятой для растворения и количеством белка в растворе. Если график имеет один перегиб, то белок признают гомогенным, а если несколько, то неоднородным. 2.4. Структура и уровни организации белковой макромолекулы По вопросу структуры белка было высказано большое количество гипотез. Из них лишь одна выдержала испытания по времени и в свете нового фактического материала, который был получен в последнее время. Это полипептидная теория строения белковой молекулы. Она была предложена в 1902 году Э. Фишером на базе идей, выдвинутых А. Данилевским, о роли пептидных связей в строении белка. Согласно полипептидной теории белковые молекулы представляют собой гигантские полипептидные цепи, которые состоят из сотен тысяч аминокислотных остатков, которые соединены друг с другом с помощью пептидных связей. О том, что белковые молекулы построены именно таким образом свидетельствуют следующие факты: 1) в нативных белках удается обнаружить очень небольшое количество свободных аминных и карбоксильных групп, так как концевые аминокислоты, имеющие такие группы, составляют ничтожную долю огромной полипептидной цепи белка; 2) при гидролизе белка идет постепенное высвобождение аминных и карбоксильных групп в строгом соотношении 1:1, т.е. протекает гидролиз пептидных связей. Одновременно в гидролизате появляется некоторое количество свободных аминокислот. 3) все белки дают положительную биуретовую реакцию, что подтверждает наличие пептидных связей в белках; 4)полипептидная природа простейшего белка – инсулина доказана лабораторным синтезом этого белка; 5) при рентгеноструктурном анализе белка удается рассмотреть непрерывную цепь аминокислотных остатков. Ввиду исключительного значения, которое придается полипептидам, как структурной основе белка, ее строение детально изучено методом рентгеноструктурного анализа. Характерными особенностями полипептидной цепи являются следующие: 1. Атомы углерода и азота в ее хребте располагаются приблизительно в одной плоскости, в то время как атомы водорода и радикалы аминокислот направлены к этой плоскости под углом 109º28/. Кислород карбонильной группы и водород NH-группы чаще всего находятся в транс-положении, группа, связанная с α-углеродным атомом, обладает свободным вращением. 2. Дли на связи C-N в пептидной связи (0,132 нм) носит промежуточный характер между длиной истинной одинарной связи C-N (0,149 нм) и длиной истинной двойной связи C=N (0,127 нм). Это, по-видимому, является следствием сопряжения π-электронов карбонильной группы со свободными р-электронами атома азота. 3. Полипептидный хребет окружен разнообразными по природе радикалами аминокислот. Они представлены как алифатическими (ала, вал, лей), ароматическими (тир, фен) так и гетероциклическими (про, три, гис). Многие из них несут ионизированные группы (асп, глу, лиз), гидроксильные (сер, тре), амидные (асн, глн), тиольные (цис) и другие группы. Долгое время представления о белковой молекуле ограничивались признанием полипептидной цепи, как ее основы, без какой-либо детализации закономерностей чередования аминокислотных остатков или конфигурации цепи. Лишь разработка новых методов исследования структуры белка дала возможность продвинуться вперед в решении как первой, так и второй проблем. В настоящее время в достаточной мере разработан вопрос о первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах белковой молекулы. Впервые представление об уровнях организации белков было выдвинуто К. Линдерстрёмом-Лангом. 2.4.1. Первичная структура белковой макромолекулы Под первичной структурой белковой молекулы понимают последовательность в расположении аминокислотных остатков составляющих полипептидную цепь. Зная первичную структуру белка можно написать его полную химическую формулу. Однако, поскольку в состав белка входит несколько тысяч аминокислотных остатков, то расшифровка первичной структуры белка представляет весьма трудную задачу. Обычно исследуют белок в следующей последовательности. 
Определению первичной структуры белков предшествует денатурация белков. Это достигается обработкой белка избытком меркаптоэтанола (HSCH2CH2OH) или надкислотами (HCOOOH). Расщепление на пептиды достигается с помощью ферментативного гидролиза протолитическими ферментами, так пепсин работает по остаткам гидрофобных аминокислот, трипсин работает по остаткам лиз или арг, химотрипсин работает по остаткам три, фен, тир. Далее определяют аминокислотную последовательность различными химическими методами. К наиболее ранним методам можно отнести метод Ф.Сенжера (динитрофенольный метод). Химизм его можно представить следующей схемой: 
Структуру ДНФ аминокислоты можно определить с помощью качественной реакции или спектральными методами. Этот метод является методом определения N-концевой аминокислоты. Существуют и другие химические методы дансильный метод (N-концевая аминокислота), метод С. Акабори (С-концевая аминокислота). В 1950 году П.Эдман предложил универсальный метод определения аминокислотной последовательности в пептидах (фенилизотиоцианатный метод). Данный метод позволяет определять всю последовательность аминокислотных остатков. Химизм метода можно представить следующей схемой: 
СтруктуруфенилтиогидантионногопроизводногоN-концевой аминокислоты обычно определяют спектральными методами. Этим способом возможно определение всех аминокислот в пептиде. Метод Эдмана в настоящее время полностью автоматизирован, расшифровку аминокислот ведут в приборах секвенаторах. Кроме химических методов определения аминокислотной последовательности применяют и физические методы (рентгеноструктурный анализ, масс-спектрометрия), однако они имеют ряд ограничений и поэтому не могут найти абсолютное применение в решении этой проблемы. При рассмотрении первичной структуры белка возникает вопрос, осуществляется ли в белках все потенциально возможные комбинации из аминокислотных остатков, или имеются какие-либо сочетания аминокислот, характерные для части или всех белков? Поскольку из 20 белковых аминокислот теоретически возможно 2 · 1018 белков, то раньше считали, что в природе возможно встретить любой из 2 · 1018 изомеров белка. Однако, анализ чередования аминокислотных остатков в белках привел к открытию двух принципов: принцип структурного подобия и принцип взаимозаменяемости. Эти принципы были разработаны Ф. Шормом. Принцип структурного подобия заключается в том, что в различных белках встречаются идентичные пептидные группировки (трипептиды). Тождественные трипептиды: инсулин цепь Арибонуклеаза
8 9 10 122 123 124 вал-цис-сер вал-цис-сер 10 11 12 57 58 59 Принцип взаимозаменяемости заключается в том, что в полипептидной цепи существуют участки, которые отличаются друг от друга взаимозаменяемыми аминокислотными остатками, близкими по строению или биогенетически. Например, гли – сер; гли – ала; лей – изолей; лей – вал; глу – асп. Аналогичные трипептиды: инсулин цепь Арибонуклеаза
4 5 6 70 71 72 Таким образом, принцип взаимозаменяемости аминокислот в пептидах тесно увязывается с принципом структурного подобия.
Рис.1. α-Спираль белка аполипопротенина С-1 (по В.М. Степанову): а – гидрофильная поверхность; б – гидрофобная поверхность α-спирали белка В α-спирали полностью использована возможность образования водородных связей, поэтому она не способна в отличие от β-структуры образовывать водородные связи с другими элементами вторичной структуры. При формировании такой структуры боковые цепи аминокислот могут сближаться, образуя гидрофобные (ориентированы во внутреннюю сферу белковой макромолекулы) или гидрофильные (ориентированы во внешнюю сферу белковой макромолекулы) компактные сайты. Эти сайты играют существенную роль при образовании трехмерной конформации белковой макромолекулы. Для того, чтобы молекула белка могла существовать в α-спирали, она должна соответствовать определенным критериям Л.Полинга и Р.Кори. 1. Модель полипептидной цепи со значениями валентных углов и межатомных расстояний не должна отличаться от их значений, вычисленных при рентгеноструктурном анализе. 2. Конфигурация пептидной связи должна быть плоской. Отклонения от плоскостного строения вызывает увеличение энергии на 4200 кДж/моль. 3. Участки полипептидной цепи должны иметь винтовую симметрию. 4. Модель должна быть насыщена водородными связями. Спираль-клубок. Содержание α-спирали неодинаково и для каждого белка является индивидуальной характеристикой. В среднем глобулярные белки имеют степень спирализации 60-70%. Спирализованные участки чередуются с хаотическими клубками. Спирализация полипептидной цепи зависит от аминокислотных остатков, ее образующих. Например, отрицательно заряженные группы глутаминовой кислоты, расположенные в непосредственной близости друг от друга, испытывают сильное взаимное отталкивание, что препятствует образованию соответствующих водородных связей в α-спирали. Аналогичная картина складывается и в случае близко расположенных положительно заряженных химических группировок лизина и аргинина. Большие размеры радикалов аминокислот также являются причиной, по которой спирализация полипептидной цепи затруднена (например, серин, треонин, лейцин). Наиболее часто интерферирующим фактором при образовании α-спирали, является аминокислота пролин, так как атом азота входит в состав жесткого кольца, что препятствует вращению вокруг связи N-Cα. Кроме того, пролин не образует внутримолекулярную водородную связи из-за отсутствия атома водорода при азоте. Таким образом, во всех случаях, когда в полипептидной цепи встречается пролин, α-спиральная структура нарушается и образуется клубок или β-изгиб. β-Изгиб. Глобулярные белки имеют шарообразную форму благодаря тому, что для полипептидной цепи характерно наличие петель, зигзагов, шпилек, причем направление цепи может меняться даже на 180º. В последнем случае имеет место β-изгиб, рис.2. Этот изгиб стабилизируется одной водородной связью. Фактором, способствующим его образованию может являться включение в его состав наименьшего аминокислотного остатка – глицина. Фактором, препятствующим его образованию, могут быть большие боковые радикалы аминокислот. Такая конфигурация всегда оказывается на поверхности белковой глобулы, в связи с чем β-изгиб принимает участие во взаимодействии с другими полипептидными цепями. 
Рис. 2. β-Изгиб полипептидной цепи 
Рис. 3. Параллельная β-структура флаводоксина, пунктиром показаны водородные связи β-Структура. В отличие от α-спирали β-структура стабилизируется за счет межмолекулярных водородных связей между соседними участками полипептидной цепи, так как внутрицепочечные контакты отсутствуют. Если эти цепочки направлены в одну сторону, то такая структура называется параллельной (рис.3), если же в противоположную, то антипараллельной (рис.4). 
Рис.4. Антипараллельная и кристаллическая структуры супероксиддисмутазы β-Структура имеет зигзагообразную форму и не спирализована. Расстояние между соседними аминокислотными остатками равно 0,35 нм, больше, чем в случае α-спирали, число остатков аминокислот приходящихся на один виток равно 2. В отличие от α-спирали, каждый участок полипептидной цепи в β-структуре открыт для образования дополнительных водородных связей как в параллельном так и в антипараллельном вариантах. В отрезке полипептидной цепи, образующей β-структуру, находится от 3 до 7 аминокислотных остатков. Супервторичные структуры. Впервые супервторичные структуры были постулированы а затем и обнаружены Л. Порлингом и Р. Кори. Суперспирализованные структуры чаще всего включают в себя как α-спирали, так и β-складчатые листы. В целом их можно охарактеризовать как домены. Они представляют собой обособленные глобулярные участки, соединенные друг с другом короткими так называемыми шарнирными участками полипептидной цепи. В белках находится как правило несколько структурных доменов каждый из которых содержит до 200 аминокислотных остатков. Примером может служить фермент глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (ГАДФ), рис. 5. 
Рис.5. Домены ГАДФ из мышц омара: а – НАД+ связывающий домен; б – каталитический домен 2.4.3. Третичная структура белковой макромолекулы Под третичной структурой белковой молекулы понимают общее расположение в пространстве полипептидной цепи. Установление третичной структуры белка представляет собой сложную задачу. Первая модель третичной структуры белка – миоглобина была расшифрована в 1957 году Дж. Кендрью. К настоящему времени установлена третичная структура миоглобина, субъединиц гемоглобина, рибонуклеазы, лизоцима куриного яйца, химотрипсиногена. На рис. 6 и 7 представлены третичные структуры лактоглобулина и рибонуклеазы. Полагают, что третичная структура белковой молекулы определяется ее первичной структурой, так как решающую роль в поддержании ее структуры принадлежит аминокислотным радикалам. 
Рис. 6. Третичная структурарибонуклеазы 
Рис. 7.Нативная структура лактоглобулина Особое значение в формировании и стабилизации третичной структуры придают следующим взаимодействиям: ионные связи, водородные связи, дисульфидные связи, гидрофобные связи, а также гидратируемые группы. На рис. 8 схематично представлены данные виды взаимодействия. 
Рис.8. Типы взаимодействий, формирующие третичную структуру белков I. Ионная связь относится к электростатическим взаимодействиям. II. Водородная связь возникает между боковыми цепями и пептидными связями. III. Дисульфидная связь образуется между цистеиновыми остатками. IV. Гидрофобная связь отражает взаимодействие неполярных групп. V. Гидратируемые группы. Молекулы воды, окружающие белковую молекулу, могут образовывать структуру, подобную структуре льда. Этот водный слой способствует структурной стабильности белковой молекулы. Одним из способов изучения сворачивания полипептидной цепи в трехмерную структуру является денатурация и последующая ренатурациябелковой молекулы. Одной из распространенных гипотез самоорганизации белка является гипотеза расплавленной глобулы. В рамках этой концепции выделяют несколько этапов самосборки белков.
Каталог: attachments -> article article -> Дневник здоровья article -> Влияние сотового телефона на здоровье человека article -> Программа кандидатского экзамена по специальности 14. 00. 40 «Урология» по медицинским наукам article -> Тесты I уровня по вопросам первичной медицинской помощи article -> Методические рекомендации по организации паллиативной помощи article -> Программа кандидатского экзамена по специальности 14. 00. 07 article -> Федеральные клинические рекомендации по диагностике и лечению пагубного употребления психоактивных веществ Скачать 0.83 Mb. Поделитесь с Вашими друзьями:
|
