Учебно-методическое пособие предназначено для студентов института биологии и биомедицины, специализирующихся на кафедре молекулярной биологии и биомедицины, обучающихся по направление подготовки: 06. 03

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методической комиссией института биологии и биомедицины

для студентов высших учебных заведений, обучающихся

по направлению подготовки 06.03.01 "Биология"

Нижний Новгород

2015

УДК 579.63

К 15

В учебно-методическом пособии освещены задачи частной, медицинской микробиологии, а также подробно представлены ее методы. Дана характеристика показательных микроорганизмов.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов института биологии и биомедицины, специализирующихся на кафедре молекулярной биологии и биомедицины, обучающихся по направление подготовки: 06.03.01 "Биология" и проходящих занятия в рамках спецкурса «Современные проблемы прикладной микробиологии» и спецпрактикума.
Ответственный за выпуск:

председатель методической комиссии института биологии и биомедицины ННГУ, д.п.н., профессор И.М. Швец

УДК 579.63

ББК Е4
© Нижегородский государственный

ОГЛАВЛЕНИЕ

Возбудители стафилококковых инфекций

Морфологические и культурально-биохимические свойства

Устойчивость к факторам внешней среды

Антигены стафилококков

Внутривидовое разнообразие стафилококков

Факторы патогенности стафилококков

Лабораторная диагностика

Лабораторные диагностические тесты

Диагностические питательные среды для выделения и изучения

стафилококков

Микробиологическая диагностика кишечных инфекций

Схема бактериологической диагностики коли-энтеритов

Лабораторная диагностика

Среды для выделения, культивирования, дифференциации и идентификации энтеробактерий

Тифо-паратифозная группа бактерий

Возбудители брюшного тифа и паратифов А и В

Лабораторная диагностика

Молекулярно-генетические методы типирования изолированных штаммов сальмонелл

Контрольные вопросы

Список литературы

Предметом изучения медицинской микробиологии являются болезнетворные (патогенные) и условно-патогенные для человека микроорганизмы, а также разработка методов микробиологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения вызываемых ими инфекционных заболеваний.

Выделяют шесть основных групп возбудителей инфекционных заболеваний человека:

Прионы (от англ. prion – Protein infection, Proteinaceous infectious (particle) – белковая инфекционная частица – новый класс инфекционных агентов;

Вирусы;

Бактерии;

Паразитические простейшие;

Паразитические черви (гельминты).

ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Патогенные кокки
К патогенным коккам относятся стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки, гонококки. Все они обладают способностью вызывать у человека воспалительные процессы, сопровождающиеся образованием гноя. Поэтому они называются гноеродными или пиогенными кокками.

Среди патогенных кокков менингококки и гонококки являются наиболее выраженными паразитами человека, они не могут длительно сохраняться вне организма и в естественных условиях не вызывают заболеваний у животных.

Степень органотропности у патогенных кокков выражена неодинаково. Она наиболее резко проявляется у пневмококков, менингококков и гонококков и менее выражена у стафилококков и стрептококков.

Стафилококки и стрептококки обладают полиморфизмом. Не имея специфической локализации в организме, они вызывают воспалительные процессы кожи, подкожной клетчатки и слизистых (фурункулы, карбункулы, абсцессы, дерматиты, панариции, конъюктивиты), костной системы (остеомиелиты), внутренних органов (пневмонии, аппендициты, холециститы, менингиты), воспаление брюшины, а также сепсис. Стафилококки и стрептококки являются причиной послеоперационных осложнений. Стрептококки – возбудители подострого септического эндокардита, рожи, скарлатины, ревматизма.

Большинство заболеваний, вызываемых патогенными кокками не контагиозны. Эпидемически распространяются скарлатина, рожа, менингит, гонорея. Источником инфекции являются здоровые носители и больные люди. Механизм передачи разнообразен, но в основном капельный. Исключение составляет гонорея, передающаяся половым путем. Восприимчивость людей к кокковым заболеваниям неодинакова. Иммунитет отсутствует лишь к гонорее.

Грамположительные кокки широко распространены в природе. В естественных условиях встречаются сапрофитные виды, не отличающиеся от патогенных кокков по своей морфологии.

Возбудители стафилококковых инфекций
Стафилококки открыты Л. Пастером в 1880 г. Стафилококки принадлежат к порядку Bacillales, семейству Staphylococcaceae, роду Staphylococcus. В настоящее время выделяют следующие виды стафилококка: S. aureus, S. capitis, S. еpidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. warneri, S. xylosus и др.

Из 19 видов Staphylococcus, представленных в руководстве Bergen (2004), только 3 вида связаны с организмом человека: S. aureus – стафилококк золотистый, S. еpidermidis (ранее названный S. albus) – стафилококк эпидермальный, S. saprophyticus – стафилококк сапрофитный. Заболевания, отличающиеся разнообразием клинических проявлений, вызывают золотистые, реже – эпидермальные и ещё реже – сапрофитные стафилококки.

Морфологические и культурально-биохимические свойства
Стафилококки представляют собой клетки сферической формы диаметром 0,5-1,5 мкм, своим расположением в мазке напоминающие гроздья винограда, поскольку их деление происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Иногда клетки могут располагаться поодиночке, попарно или в виде коротких цепочек. Они неподвижны и не образуют спор. Клеточная стенка представляет собой многослойную структуру толщиной 70-80 нм. В состав клеточной стенки входят пептидогликановый слой, покрывающий цитоплазматическую мембрану, и отрицательно заряженные полимеры – тейхоевые кислоты. Часть тейхоевых кислот ковалентно связана с пептидогликаном, а часть – с липидами цитоплазматической мембраны. У S. aureus эти полимеры состоят из рибитолфосфата – это так называемые рибитолтейхоевые кислоты, а у S. epidermidis – из молекул глицеролфосфата – это глицеролтейхоевые кислоты. У S. saprophyticus выделяют оба типа тейхоевых кислот. Клеточная стенка бывает покрыта полисахаридной капсулой.

Стафилококки активно растут практически на всех искусственных средах, обычно образуя непрозрачные гладкие блестящие колонии. При выращивании на кровяном агаре, вокруг колоний патогенных стафилококков, продуцирующих гемолизины, образуется зона гемолиза. При культивировании в аэробных условиях стафилококки синтезируют пигменты на питательных средах с содержанием крови, молока, картофеля или углеводов. Цвет пигмента колоний может быть различен (белый, оранжевый, желтый, кремовый) у разных штаммов одного и того же вида, поэтому пигментообразование не является дифференциальным (видовым) признаком. В анаэробных условиях или в жидкой питательной среде пигмент не образуется.

Стафилококки – факультативные анаэробы, каталазоположительные и оксидазонегативные, хорошо растут в присутствии кислорода, но легко переносят и отсутствие кислорода, а некоторые штаммы являются строгими анаэробами.

Температурный оптимум роста 25-35°С, предпочтительна слабощелочная реакция среды. Стафилококки хорошо переносят повышенное осмотическое давление, поэтому селективной питательной средой для них может быть среда с высоким содержанием хлорида натрия (до 15%). Такую концентрацию соли другие бактерии не переносят, вследствие чего солевые среды являются элективными для стафилококков.

Стафилококки являются хемоорганотрофами с окислительным и бродильным типами метаболизма. Они расщепляют многие углеводы в аэробных и анаэробных условиях. Дифференциально-диагностическое значение имеет тест на способность стафилококков сбраживать глюкозу и маннит в анаэробных условиях.

Устойчивость к факторам внешней среды

Стафилококки относительно устойчивы к действию фенола и этилового спирта (в 3% растворе фенола погибают через 30 минут, а в 50 % этиловом спирте – через 10 минут).

Важнейшим свойством стафилококков является их выраженная приобретенная устойчивость к антибиотикам, контролируемая плазмидами. Большую роль в патологии человека играют метициллинорезистентные стафилококки, с которыми связывают эпидемические вспышки внутрибольничных инфекций.

Антигены стафилококков

Стафилококки обладают разнообразными антигенами, локализованными в основном в клеточной стенке, S. aureus имеет также капсульный антиген. Из компонентов клеточной стенки антигенами являются пептидогликан, белок А, расположенный снаружи пептидогликана. Наличие белка А характерно для S. aureus. Этот белок способен к неспецифическому соединению с Fc-фрагментами IgG, в связи с чем стафилококки, обладающие белком А, способны агглютинироваться нормальной человеческой сывороткой и давать неспецифическое свечение при обработке гетерологичными флюоресцирующими сыворотками. В настоящее время на этом феномене основан метод, применяемый для диагностики ранней инфекции.

Капсульный антиген S. aureus имеет сложное строение. Он состоит из уроновых кислот, моносахаридов и аминокислот.

У стафилококков описаны и видоспецифические антигены. Видоспецифичными АГ являются тейхоевые кислоты. Тейхоевые кислоты – это группа сложных соединений, состоящих из многоатомных спиртов, фосфата, сахаров, аминосахаров и аминокислот. Они обнаружены в клеточной стенке многих Грам+ бактерий, причем состав их варьирует в зависимости от вида бактерий. Так, в клеточной стенке S. aureus находится рибиттейхоевая кислота, S. epidermides – глицеринтейхоевая, у S. saprophyticus – выявляют оба типа кислот. Антитела к рибиттейховой кислоте в высоком титре обнаружены в сыворотке крови взрослых и детей с тяжелой стафилококковой инфекцией (эндокардит, септицемия, остеомиелит). Определение уровня антител к рибиттейхоевой кислоте является надежным и специфическим методом серологической диагностики.

Антигенными свойствами обладают также внеклеточные ферменты: нуклеаза, каталаза, протеаза, плазмокоагулаза и другие. По наличию коагулазы все стафилококки разделяют на две группы; среди патогенных видов коагулаза-положителен лишь S. aureus; остальные виды называют коагулаза-отрицательными. Этот признак, как и ряд других, имеет диагностическое значение (табл. 1).

Стафилококки подразделяются на коагулазоположительные и коагулазоотрицательные. Коагулазоположительные стафилококки наиболее вирулентны; кроме того, способность S. aureus вырабатывать коагулазу – один из основных дифференциальных признаков этого вида. На основании различий в антигенном составе выделяют 10 серотипов коагулазоположительных стафилококков.

Один из вариантов внутривидовой гетерогенности стафилококков – фаговары. Установлено, что специфические бактериофаги реагируют с 60 % коагулазоположительных стафилококков. Поскольку этот процесс специфический, он используется для маркировки штаммов стафилококков. Для удобства бактериофагам присвоены определенные номера, и штаммы стафилококка, лизирующиеся определенным фагом, имеют номер этого фага и обозначаются как соответствующий фаговар. Это касается только штаммов S. auresus. Большинство других стафилококков относятся к нетипирующимся фаготипам. Фаготипирование используется в эпидемиологических целях для выявления источника инфекции, так как фаги высокоспецифичны. В случаях внутрибольничных инфекций данным методом можно точно выявить носителя патогенного штамма.

Таблица 1

Дифференциальные признаки стафилококков,

имеющих основное медицинское значение

Признак	S. aureus	S. epidermidis	S. saprophyticus
Наличие пигмента Способность к росту в анаэробных условиях Рост на средах с 10 % NaCl Рост при:15°С 45°С Образование кислоты при ферментации углеводов в аэробных условиях: ксилоза арабиноза раффиноза сахароза маннит манноза трегалоза лактоза галактоза фруктоза ксилит Восстановление нитратов Щелочная фосфатаза Гиалуронидаза Уреза Коагулаза (на сыворотке кролика) Фибринолизин Гемолитическая активность ДНК-аза Чувствительность к новобиоцину	± + + + + – – – + + + + + + + – + + + ± + ± + + +	– + ± – + – – – + – ± – ± ± + – + + ± + – ± – – +	+ ± + + ± – – – + ± – + ± – + ± – – + – – – –

Внутривидовое разнообразие стафилококков

Факторы патогенности стафилококков

Стафилококки образуют разнообразные внеклеточные ферменты: плазмокоагулазу, гиалуронидазу, протеазы, эстеразы, лизоцим, фосфатазу, эндонуклеазы, активно гидролизируют желатин, восстанавливают нитраты. Патогенные стафилококки обладают способностью продуцировать токсины, которые характеризуются летальным, гемолитическим и дермонекротическим действием, отличаются друг от друга по механизму действия. К ним относятся мембраноповреждающие токсины или мембранотоксины. Они образуют каналы в цитоплазматической мембране эритроцитов, лейкоцитов и других клеток, что приводит к нарушению осмотического давления и лизису соответствующих клеток. Ранее их называли гемолизинами, полагая, что они лизируют только эритроциты. Мембранотоксины отличаются друг от друга по антигенным свойствам «мишени» и другим признакам. α-токсин (α-гемолизин) ингибирует миграцию как полиморфноядерных лейкоцитов, так и моноцитов (вызывает лизис эритроцитов и моноцитов), обладает дермонекротическим и кардиотоксическим действием. Он представляет собой белок с выраженными иммуногенными свойствами. Из него получен анатоксин, использующийся для лечения и профилактики стафилококковых заболеваний.

Способность некоторых стафилококков вызывать пищевые отравления связана с образованием энтеротоксинов. Известно 6 энтеротоксинов, различающихся по антигенным свойствам.

В патогенном действии стафилококков значительная роль принадлежит внеклеточным ферментам. Наличие коагулазы, свертывающей плазму крови, является важным и постоянным критерием патогенности стафилококков. Большие концентрации коагулазы, циркулирующие в организме больного, приводят к понижению свертываемости крови, нарушению гемодинамики, прогрессирующему кислородному голоданию тканей. Образуемый стафилококками фибринолизин растворяет фибрин, ограничивающий местный воспалительный очаг, чем приводит к генерализации инфекции.

Важное свойство стафилококков – способность синтезировать гиалуронидазу, субстратом действия которой является гиалуроновая кислота, скрепляющая элементы соединительной ткани. Благодаря действию этого фермента стафилококки расщепляют гиалуроновую кислоту и легко проникают вглубь тканей.

Плазмокоагулаза вызывает свертывание плазмы крови. Стафилококки, продуцирующие этот фермент, покрываются фибриновым чехлом, защищающим их от фагоцитоза.

Лецитиназа разрушает лецитин в составе клеточных мембран лейкоцитов и других клеток, что способствует лейкопении.

Определенную роль в проявлении патогенных свойств стафилококков играет белок А. Его способность неспецифически реагировать с Fc-фрагментом иммуноглобулинов приводит к образованию комплекса белок A-YgG. Этот комплекс инактивирует комплемент, что в свою очередь ослабляет фагоцитарную реакцию. Взаимодействие белка А с комплементом вызывает повреждение тромбоцитов.

Важным фактором вирулентности стафилококков (особенно при формировании хронических форм инфекции) является способность продуцировать биопленку, которая облегчает адгезию и формирование микроколоний микроорганизмов на слизистых оболочках и раневой поверхности. Биопленка представляет собой экзополисахаридный матрикс, продуцируемый стафилококками, внутри которого возбудитель очень устойчив к воздействию иммунной системы и факторов окружающей среды. Заболевания, вызванные микроорганизмами, продуцирующими биопленку, трудно поддаются лечению (в том числе антибиотикотерапии) и чаще всего требуют оперативного вмешательства. Нередко стафилококковая инфекция задерживается на стадии колонизации. Однако механизмы, при помощи которых одни люди колонизируются стафилококком, т.е. становятся носителями, а другие нет – не ясны. Далеко не всегда стафилококковый процесс ограничивается колонизацией. Возбудитель стремится расширить очаг поражения для увеличения своей популяции.

Лабораторная диагностика

Изучение выделенной чистой культуры имеет задачей прежде всего дифференциацию патогенного стафилококка от сапрофитных, которые вследствие их большой распространенности могут обсеменить исследуемый материал.

1. 
   Для подтверждения принадлежности культуры к роду Staphylococcus ставят реакцию на каталазу на стекле.
   

Каталаза (греч. кatalysis - разрушение) – фермент, способствующий расщеплению перекиси водорода на воду и молекулярный кислород.

2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂

Тест основан на том, что с первых же секунд контакта перекиси водорода с каталазой начинается её расщепление, сопровождающееся выделением пузырьков кислорода. Каталазную активность определяют при нейтральном значении рН в условиях комнатной температуры.

На чистое, хорошо обезжиренное предметное стекло наносят каплю 3 % раствора перекиси водорода и эмульгируют в ней 1 каплю исследуемой культуры.

При наличии каталазы в микробной культуре в капле раствора перекиси водорода на предметном стекле в первые 2-3 секунды появляются пузырьки кислорода. Независимо от интенсивности газообразования (бурное или умеренное) реакция учитывается как положительная. Появление единичных пузырьков или наступление газообразования в более поздние сроки (13-15 сек.) расценивается как реакция сомнительная, требующая повторной постановки. Отсутствие газообразования или появление одиночных пузырьков газа через продолжительное время после добавления реактива определяется как реакция отрицательная. Для получения более быстрого результата, позволяющего ориентировочно отличить культуру стафилококка от каталазоположительных микрококков, отсевают культуру на кровяной агар (КА). Микрококки никогда не образуют зон гемолиза в отличие от большинства штаммов стафилококка, особенно S. aureus.

1. При положительной реакции на каталазу, культуру отсевают на среду Хью-Лейфсона с глюкозой для выявления ферментации в анаэробных условиях.

Испытуемую культуру засевают уколом в 2 пробирки со средой; содержимое одной из них заливают стерильным вазелиновым маслом слоем 1 см. Инкубируют при 37°С 72 часа до изменения цвета среды хотя бы в одной пробирке. При окислении углевода в пробирке под маслом, без доступа кислорода, цвет среды остается зеленым, без масла – становится желтым. При ферментации в пробирке под маслом и в пробирке без масла цвет становится желтым. В случае отсутствия разложения углевода в обеих пробирках сохраняется первоначальный сине-зеленый цвет.

На основании этого теста патогенные стафилококки дифференцируют от сходных по морфологии сапрофитных стафилококков (S. aureus не расщепляет глюкозу).

Рис. 1. Схема микробиологического исследования при стафилококковых инфекциях

2. 
   Реакция плазмокоагуляции
   

Тест основан на свертывании плазмы в результате продукции плазмокоагулирующим возбудителем тромбиноподобного вещества. Известны две формы плазмокоагулазы:

– связанная с клеточной стенкой микроорганизма;

– находящаяся в клетке в свободном виде.

Свободная коагулаза действует на протромбин, способствуя образованию тромбиноподобного продукта, который, вступая во взаимодействие с фибриногеном, образует сгусток фибрина. Тест определения свободной коагулазы воспроизводится пробирочным методом.

Для постановки теста необходимо иметь коммерческую сухую плазму крови кролика с цитратом натрия. Перед употреблением сухую плазму крови необходимо растворить в стерильном физрастворе из расчета 1 мл на ампулу и сделать разведение 1:5 (1 мл плазмы + 4 мл физраствора).

Постановка реакции: в стерильную пробирку с 0,5 мл разведенной кроличьей плазмы вносят колонию (или петлю) испытуемого штамма стафилококка. Контролем служит пробирка с плазмой, но без культуры. Пробирки инкубируют в термостате при 37°С до 24 часов. Результат оценивают через 1, 2, 4 часа. Реакция считается положительной, когда образуется сгусток (или желеобразная масса), который не разрушается при легком встряхивании. Время наступления плазмокоагуляции соответствует уровню ферментативной активности микробов. Если разжижение сгустка происходит в более поздние сроки, то судят о наличии фибринолизина.

Если в течение первых 4 часов сгусток не образовался, посевы оставляют в термостате на 24 часа для окончательного учета результатов реакции.

Если первичный посев материала был сделан только на кровяной агар, культуру пересевают на среду, содержащую яичный желток, для выявления лецитиназы (лецитовителлазы). О присутствии лецитиназы судят по появлению четко выраженной зоны помутнения с радужным венчиком по периферии вокруг колоний стафилококка, продуцирующих лецитиназу. При отсутствии плазмокоагулазы, но при наличии пигмента и /или лецитиназы для идентификации S. aureus необходимо поставить дополнительные тесты, которые помогают судить о видовой принадлежности и являются признаками патогенности. Это тест на определение ДНК-азной активности и ферментацию маннита в анаэробных условиях путем посева на среду Хью-Лейфсона с маннитом.

Определение ДНК-азной активности стафилококков

В расплавленный МПА добавляют ДНК из расчета 1 мг на 1 мл агара. Навеску ДНК предварительно растворяют в 3-5 мл дистиллированной воды, подщелоченной 4-5 каплями 2М раствора гидроксида натрия (NaOH). В расплавленный МПА добавляют растворенную навеску ДНК, перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане 20 мин. Для постановки теста перед разливкой в чашки Петри добавляют по 0,5 мл стерильного фармакопейного 10 % раствора хлорида кальция (CaCl₂). [0,08 мл СаCl₂ на 1 мл среды]. Испытуемые культуры засевают штрихами или бляшками и инкубируют сутки при 37°С. Через 24 часа на поверхность агара с культурами наливают 0,1 н раствор HCl на 3-5 мин.

При наличии ДНКазы вокруг роста культуры появляются зоны просветления за счет деполимеризации ДНК бактериальной ДНКазой. Положительный результат обеих проб или хотя бы одной из них позволяют отнести выделенный штамм к коагулазоотрицательному S. aureus.

Коагулазоположительные культуры кокков, не обладающие ни золотисто-желтым пигментом, ни лецитиназой, ДНКазой и анаэробной ферментацией маннита к виду S. aureus не относятся.

Культура стафилококка, не являющаяся видом S. aureus, но нередко формирующая белые колонии, может относиться к видам S. epidermidis и S. saprophyticus. Эти представители нормальной флоры кожи и слизистых человека могут иногда вызвать гнойно-септические заболевания у ослабленных лиц, быть причиной внутрибольничных инфекций.

Для их идентификации необходимо поставить три дополнительных теста:

на устойчивость к антибиотику новобиоцину дисковым методом, тест на щелочную фасфатазу и на окисление маннита (путем посева на среду с маннитом и индикатором) (табл. 2).
Определение фосфатазной активности

К расплавленному МПА добавляют 10 % раствор фенолфталеина из расчета 0,008 мл на 1 мл среды. Чашки засевают бляшками и инкубируют сутки при 37°С. После инкубации вокруг посевов образуются светло-розовые зоны за счет образовавшегося свободного фенолфталеина. Реакция усиливается при помощи аммиака. Для этого на крышку чашки Петри наносят 5-6 капель 25 %-ного раствора гидроокиси аммония (NH₄OH) и ставят её под перевёрнутую (вверх дном) чашку с выросшими испытуемыми культурами. Бляшки культур, образующих фосфатазу, приобретают малиновое окрашивание. Фосфатазоотрицательные культуры сохраняют характерный для каждого штамма пигмент.

Таблица 2

Дифференциация видов S. epidermidis и S. saprophyticus

Вид стафилококка	Устойчивость к новобиоцину	Наличие фосфатазы	Окисление маннита
S. epidermidis	–	+	–
S. saprophyticus	+	–	+

Результаты определяют измерением зоны задержки роста микроба. Наличие роста вокруг диска свидетельствует о нечувствительности данного микроба к антибиотику. Зона задержки роста диаметром 15 мм является показателем малой чувствительности микроба к антибиотику. При диаметре зоны 15-25 мм микроорганизм обладает средней чувствительностью. Зона более 25 мм указывает на высокую чувствительность к антибиотику.

Диагностические питательные среды для выделения и изучения стафилококков
Сахарный бульон

Бульон предназначен для выращивания грамположительных кокков.

К МПБ с рН 7,4±2 прибавляют глюкозу в количестве 0,5-1,0 %. Перед добавлением глюкозу растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Приготовленную среду стерилизуют 3 дня подряд текучим паром по 30 мин. Глюкозу можно добавлять, используя 40%-ный стерильный раствор глюкозы.

Кровяной агар

Для выращивания большинства кокков требуется создать условия, близкие к естественным в организме, поэтому питательные среды должны содержать жидкость животного происхождения: кровь, сыворотку, желчь.

Для определения гемолитической активности бактерий используют дефибринированную кровь барана, лошади, кролика, донора.

К расплавленному и остуженному до 45-50°С 2%-ному агару добавляют 5-10 % стерильной дефибринированной крови животного (кроличьей, лошадиной, бараньей) или человеческой, не содержащей консервантов или антибактериальных препаратов. Смесь тщательно перемешивают, избегая образования пены, и разливают в стерильные чашки Петри.

Среда предназначена для выделения стафилококков и выявления пигмента.

Для приготовления среды используют МПА с добавлением 10 % хлорида натрия. (Агар стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин. при температуре 121°С).

Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до

Учет результатов производят через 36-48 часов инкубации в термостате при 37°С. На этой среде хорошо выявляются пигментные свойства микроорганизмов, обусловленные липохромным пигментом. Вокруг колоний можно видеть радужный венчик за счет образования лецитовителлазы (лецитиназы). Добавление к среде 10 % стерильного снятого молока усиливает пигментообразование.

Среда предназначена для определения лецитиназной активности стафилококков.

К МПА добавляют 20 % желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150-200 мл стерильного физраствора).

При определении лецитиназной активности по методу Чистовича исследуемую культуру стафилококка засевают на среду штрихами или бляшками. Посевы помещают в термостат при 37°С. Вокруг колоний стафилококка, продуцирующих лецитиназу, образуются четко выраженные зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

К расплавленному и остуженному до 60°С МПА, содержащего 6,5% хлористого натрия, добавляют 10% стерильного обезжиренного молока, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Хлорид натрия в повышенной концентрации подавляет рост части сопутствующей флоры, что облегчает выделение чистой культуры. Молоко (10%) способствует лучшему выявлению пигмента колоний стафилококка.

Среда Хью-Лейфсона

Предназначена для определения способа утилизации углеводов микроорганизмами по анаэробному или аэробному пути (ферментация, окисление или отсутствие утилизации).

Состав (на 1 л дистиллированной воды):

пептон – 2 г

NaCl – 5 г

KH₂PO₄ х 3H₂O – 0,3 г

глюкоза – 10 г

бромтимоловый синий – 0,05 г

агар – 2 г

Глюкоза может быть заменена на другие углеводы.

Углеводные среды применяют для дифференциации бактерий по способности ферментировать углеводные субстраты.

При ферментации углеводов происходит образование смеси кислот (молочной, уксусной, углекислоты и др.), которые снижают значение pH.

Конечными продуктами ферментации углеводов и спиртов в большинстве случаев являются кислоты, спирты, альдегиды и газообразные вещества (H₂ и CO₂). Для обнаружения ферментации углеводов в среды Гисса вводят индикатор (индикатор Андреде, бромтимоловый синий и др.). Для выявления газообразования в жидких средах применяют трубки-поплавки (маленькие трубочки, запаянные с одного конца). Образующийся газ вытесняет жидкость из поплавков. Газ скапливается у запаянного конца трубки.

Состав (на 1 л дистиллированной воды):

Пептон – 10 г

NaCl – 5 г

Углевод – 5-10 г

Индикатор Андреде – 10 мл или 1 мл 1,6%-ого раствора бромтимолового синего

рН – 7,2 ±0,2

К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Устанавливают рН. Добавляют 5-10 г одного из испытуемых углеводов, а затем индикатор Андреде или бромтимоловый синий.

Готовую среду разливают по 3 мл в пробирки вместе с поплавками, расположенными запаянным концом кверху. Среду стерилизуют при 112°С в течение 20 мин. Во время стерилизации поплавки доверху заполняются питательной средой.

Готовая среда бесцветная или имеет розовый оттенок – с индикатором Андреде, травянисто-зеленый – с индикатором бромтимоловым синим.

Вследствие роста бактерий, сопровождающегося расщеплением углеводов с образованием кислых продуктов распада, цвет среды изменяется (табл. 3): с индикатором Андреде она становится ярко-розовой; с бромтимоловым синим – желтой. Образование газа в среде определяют по наличию пузырьков, собирающихся в поплавке.

Индикатор Андреде:

Фуксин кислый – 1 г

Натрия гидроксид

(NaOH) 1 н раствор – 64 мл

Вода дистиллированная – 400 мл

Фуксин кислый растворяют в гидроксиде натрия, после растворения краски прибавляют 400 мл дистиллированной воды, настаивают 24 часа при 37°С (в термостате) и 2 суток держат на свету при комнатной температуре. Хранят во флаконе темного стекла с резиновой или хорошо притертой пробкой.

Изменение цвета индикатора Андреде

Среда принята комитетом ВОЗ как стандарт для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

Состав (г/л):

Вытяжка из говядины – 300

Гидролизат казеина кислотный – 17,5

Крахмал 1,5

Агар 17,0

рН 7,3±0,2

38 г сухой смеси суспендируют в 1000 мл дистиллированной воды. Кипятят до полного растворения. Устанавливают рН. Стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 15 мин.