Учебно-методический комплекс Направление подготовки 020400 Биология Квалификация (степень) выпускника Магистр Форма обучения очная

ФГАОУ ВО «НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

учебно-методический комплекс

020400 Биология

Форма обучения

Новосибирск

2014 г.

Учебно-методический комплекс дисциплины «Генетическая инженерия» ориентирован на студентов 1 курса факультета естественных наук, направление подготовки 020400 "Биология" (магистр). В состав разработки включены: программа курса лекций, структура курса, приведены примеры контрольных вопросов по материалам лекций на экзамене.

Щелкунов Сергей Николаевич

© Новосибирский государственный университет, 2014

Содержание:

Аннотация рабочей программы 4

1. Цели освоения дисциплины 5

2. Место дисциплины в структуре ООП 5

3. Компетенции обучающегося, формируемые в результате освоения дисциплины «Генетическая инженерия»

4. Структура и содержание дисциплины 7

Рабочий план 8

5. Образовательные технологии. 18

6. Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы студентов. Оценочные средства для текущего контроля успеваемости, промежуточной аттестации по итогам освоения дисциплины. 18

Образцы вопросов для подготовки к экзамену.

7. Учебно-методическое и информационное обеспечение дисциплины 20

8. Материально-техническое обеспечение дисциплины 21
Аннотация рабочей программы

Курс «Генетическая инженерия» является дисциплиной по выбору вариативной части профессионального цикла ООП по направлению подготовки «020400 БИОЛОГИЯ» (квалификация (степень) магистр). Дисциплина реализуется на Факультете естественных наук Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Новосибирского государственного университета (НГУ) кафедрой молекулярной биологии.

Содержание дисциплины охватывает основы современных представлений о сформировавшихся и развивающихся направлениях в области разработки векторных систем для клонирования и экспрессии генов в клетках бактерий, дрожжей, млекопитающих и растений с целью создания организмов со свойствами, важными для практического применения в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве.

Дисциплина предназначена для повышения биологической грамотности и развития абстрактного и структурного стиля мышления у студентов-биологов и нацелена на формирование у выпускника общекультурных компетенций: ОК-2, OK-6, профессиональных компетенций: ПК-1-4 ПК-9-12.

Преподавание дисциплины предусматривает следующие формы организации учебного процесса: лекции, самостоятельная работа студента.

Результатом прохождения дисциплины является итоговая оценка по пятибалльной шкале (экзамен).

Программой дисциплины предусмотрены следующие виды контроля:

Текущий контроль. Формой текущего контроля при прохождении дисциплины «Генетическая инженерия» является контроль посещаемости занятий. и сдача домашних заданий.

Для того чтобы быть допущенным к экзамену, студент должен в ходе обучения посетить не менее 70 % лекционных занятий и сдать два домашних задания.

Общая трудоемкость дисциплины составляет 3 зачетных единицы, 108 академических часов. Программой дисциплины предусмотрены 28 часов лекционных, 44 часа самостоятельной работы студентов, которая включает подготовку домашних заданий и к экзамену, 36 часов - контроля СРС.

Основной целью освоения дисциплины "Генетическая инженерия" является приобретение студентами знаний по современным направлениям этой новейшей области экспериментальной молекулярной биологии. Для достижения поставленной цели выделяются задачи представить в курсе лекций информацию о современных направлениях создания молекулярных векторов различных систем клонирования генов, методах получения суперпродуцентов белков в прокариотических и эукариотических системах, подходам по созданию современных безопасных противовирусных вакцин методами генетической инженерии, методам создания трансгенных животных и растений.

Дисциплина «Генетическая инженерия» опирается на следующие дисциплины данной ООП:

1. 
   Микробиология.
   
2. 
   Ботаника (про- и эукариоты, высшие организмы).
   
3. 
   Молекулярная биология (структура и функции белков и нуклеиновых кислот, гены и геномы, самоорганизация живых систем, биотехнология).
   
4. 
   Биохимия.
   
5. 
   Генетика.
   
6. 
   Иммунология.
   

Результаты освоения дисциплины «Генетическая инженерия» используются в следующих дисциплинах данной ООП:

• 
  Механизмы репликации, транскрипции и трансляции;
  
• 
  Молекулярная вирусология;
  
• 
  Мутагенез и репарация;
  
• 
  Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов.
  

• 
  ОК-2: способен к инновационной деятельности;
  
• 
  ОК-6: способен самостоятельно приобретать с помощью информационных технологий и использовать в практической деятельности новые знания и умения, в том числе в новых областях знаний, непосредственно не связанных со сферой деятельности.
  

• 
  ПК-1: понимает современные проблемы биологии и использует фундаментальные биологические представления в сфере профессиональной деятельности для постановки и решения новых задач;
  
• 
  ПК-2: знает и использует основные теории, концепции и принципы в избранной области деятельности, способен к системному мышлению;
  
• 
  ПК-3: самостоятельно анализирует имеющуюся информацию, выявляет фундаментальные проблемы, ставит задачу и выполняет полевые, лабораторные биологические исследования при решении конкретных задач по специализации с использованием современной аппаратуры и вычислительных средств, демонстрирует ответственность за качество работ и научную достоверность результатов;
  
• 
  ПК-4: демонстрирует знание истории и методологии биологических наук, расширяющее общепрофессиональную, фундаментальную подготовку;
  
• 
  ПК-9: профессионально оформляет, представляет и докладывает результаты научно-исследовательских и производственно-технологических работ по утвержденным формам;
  
• 
  ПК-10: глубоко понимает и творчески использует в научной и производственно-технологической деятельности знания фундаментальных и прикладных разделов специальных дисциплин магистерской программы
  
• 
  ПК-11: умеет планировать и реализовывать профессиональные мероприятия;
  
• 
  ПК-12: применяет методические основы проектирования и выполнения полевых и лабораторных биологических и экологических исследований с использованием современной аппаратуры и вычислительных комплексов , генерирует новые идеи и методические решения.
  

• 
  иметь представление о современных и развивающихся направлениях генетической инженерии;
  
• 
  знать биохимические и молекулярно-биологические основы генетической инженерии;
  
• 
  знать об особенностях методов, используемых для получения новых векторных систем и суперпродуцентов целевых белков;
  
• 
  иметь представление о перспективах развития генетической инженерии и связанных с ней областей наук о жизни.
  

Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Изменчивость фага  , контролируемая хозяином. Рестрикция-модификация фаговой ДНК в бактериальных клетках. Классификация ферментов рестрикции. Участок узнавания (сайт) эндонуклеазы рестрикции на молекуле ДНК. Липкие и тупые концы фрагментов ДНК, генерируемые эндонуклеазами рестрикции. Изошизомеры. Методы поиска штаммов, продуцирующих эндонуклеазы рестрикции.

ДНК-лигазы E.coli и фага Т4. ДНК-полимераза I E.coli, ее ферментативные активности. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I. Метод репарации, направляемой праймером. Taq полимераза. Полимеразная цепная реакция. Концевая дезоксинуклеотидил трансфераза (терминальная трансфераза). РНК-зависимая ДНК-полимераза (обратная транскриптаза, ревертаза). Нуклеаза Bal31.
Тема 2. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ

Методы конструирования гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК (рекДНК). Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы. Линкерные молекулы и их использование при конструировании рекДНК. Применение полимеразной цепной реакции в извлечении и клонировании фрагментов ДНК.

Векторные молекулы ДНК. Требования, предъявляемые к молекулярному вектору. Понятия о клонирующих, интегративных и экспрессирующих молекулярных векторах.

Введение молекул ДНК в клетки. Компетентность клеток физиологическая и индуцированная. Трансфекция. Трансформация генетическая. Биохимические и физические методы трансфекции /трансформации.

Методы отбора гибридных клонов бактериальных клеток. Фенотипическая система селекции. Функциональная комплементация мутаций. Гибридизация нуклеиновых кислот in situ. Радиоиммуноанализ белков in situ.

Тема 3. ГЕННО-ИНЖЕНЕРНАЯ СИСТЕМА ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ Escherichia coli

Методы введения плазмидных и фаговых молекул ДНК в клетки E.coli. Получение сферопластов. Индукция компетентности клеток. Упаковка ДНК фага лямбда in vitro. Электропорация.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВЕКТОРЫ E. coli.

Клонирующие плазмидные векторы. ColE1-, pSC101-, pUR-производные.

Клонирующие векторы на основе ДНК нитевидных фагов. Создание фага M13mp2 и его производных. Преимущества и недостатки векторных нитевидных фагов.

Векторы на основе ДНК фага лямбда. Векторы внедрения или замещения. Емкость фаговых векторов. Селекция гибридных фагов.

Космиды. Создание библиотек и энциклопедий генов.

Векторные плазмиды, обеспечивающие прямой отбор гибридных ДНК. Векторы, обеспечивающие экспрессию клонированных нуклеотидных последовательностей в клетках E. coli. Разработка векторов E. coli, детерминирующих секрецию чужеродных белков.

ПОДХОДЫ К ДОСТИЖЕНИЮ ПОВЫШЕННОЙ ПРОДУКЦИИ БЕЛКОВ, КОДИРУЕМЫХ КЛОНИРОВАННЫМИ ГЕНАМИ. Эффект дозы гена в экспериментах по молекулярному клонированию. Влияние на уровень экспрессии клонированных генов эффективности их транскрипции. Организация бактериальных промоторов. Сила промотора. Эффективность трансляции матричных РНК. Частота встречаемости кодонов в составе матричных РНК. Структура участка связывания рибосом с мРНК. Использование штаммов E. coli с пониженной активностью нуклеаз и протеаз. Оптимизация условий культивирования гибридных штаммов. Тельца включения.

ЭКСПРЕССИЯ КЛОНИРОВАННЫХ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ E. coli. Сравнительный анализ организации генетического аппарата прокариот и эукариот. Возможность экспрессии хромосомных эукариотических генов в бактериальных клетках. Клонирование ДНК-копий матричных РНК и изучение их экспрессии. Клонирование химико-ферментативно синтезированных эукариотических генов. Создание белков с гибридными свойствами. Иммунотоксины. Искусственные иммуногены. Фаговый дисплей.

СТАБИЛЬНОСТЬ ВНЕХРОМОСОМНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК В КЛЕТКАХ E.coli. Влияние условий культивирования клеток на поддержание плазмид. Структура молекулы ДНК и ее стабильность в клетке. Повторяющиеся последовательности. par-локус. Связь копийности плазмид со стабильностью их наследования.
Тема 4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ Bacillus subtilis

Трансформация клеток бацилл хромосомной ДНК. Плазмидная трансформация компетентных клеток B. subtilis. Введение плазмид в протопласты бацилл.

Клонирующие векторы B. subtilis на основе плазмид Staphylococcus. Механизм репликации плазмид Staphylococcus. Челночные векторные плазмиды, реплицирующиеся как в B. subtilis, так и в E. coli.

Некоторые особенности строения и экспрессии генов бактерий рода Bacillus по сравнению с генами E. coli. Экспрессия в клетках бацилл клонированных генов. Секреция из клеток бацилл чужеродных белков. Молекулярные векторы экспрессии-секреции клеток бацилл. Стабильность плазмид в клетках B. subtilis. Перспективы использования создаваемых штаммов-продуцентов бацилл в биотехнологии.

Генетическая организация дрожжей-сахаромицетов. Плазмиды дрожжей 2мкм (Scp1) и 3мкм, их молекулярно-генетическая структура. Плазмидная трансформация клеток дрожжей. Получение сферопластов. Индукция компетентности клеток дрожжей.

Векторные молекулы дрожжей-сахаромицетов. Векторы интеграции (YIp-типа). Клонирующие векторы (YEp-, YRp- и YCp-типа), их сравнительные характеристики. Метод клонирования последовательностей ДНК, обеспечивающих репликацию гибридных плазмид в клетках дрожжей.

Стабильность гибридных молекул ДНК в клетках дрожжей. Метод клонирования центромерных областей дрожжевых хромосом. Клонирование генов в клетках дрожжей. Секреция чужеродных белков из дрожжевых клеток. Генно-инженерные субъединичные вакцины, продуцируемые клетками дрожжей.

МЕТОДЫ ПЕРЕНОСА МОЛЕКУЛ ДНК В КЛЕТКИ ЖИВОТНЫХ. Гипертонический солевой метод. ДЭАЭ-декстрановый метод. Кальций-фосфатный метод. Использование липосом для трансфекции вирусных ДНК. Микроинъекция молекул ДНК в клетки животных. Введение плазмид и фрагментов ДНК в культивируемые клетки животных. Прямой перенос плазмид из бактерий в клетки животных. Метод прокалывания клеток.

ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ. Вирус SV40 как молекулярный вектор. Литические векторы. Использование вирусов-помощников. Комплементирующая ранние функции SV40 культура клеток COS. Нелитические эписомные молекулярные векторы на основе генетических элементов SV40.

Введение генов в клетки животных совместно с селективным маркером, обусловливающим генетическую трансформацию клеток. Генетическая трансформация мутантных линий клеток животных. Котрансформация. Доминантные амплифицируемые маркеры генетической трансформации клеток животных. Коамплификация. Эписомные векторы генетической трансформации клеток животных.

Аденовирусы в качестве молекулярных векторов. Комплементирующая линия клеток 293. Выпотрошенный молекулярный вектор на основе аденовируса. Генная терапия.

Экспрессирующие векторы на основе ортопоксвирусов. Временная доминантная селекция и ее использование для направленного введения в поксвирусный геном целевых генов и/или делеций. Создание живых поливалентных вакцин на основе вируса осповакцины. Типы противовирусных вакцин. ДНК вакцины.

Высокоэффективные экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов. Клонирующая система Bac-to-Bac.
Тема 7. ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ И РАСТЕНИЯ

Методы создания трансгенных животных. Нокаутные животные. Тканеспецифичная и индуцируемая экспрессия трансгенов в организме животных. Подходы к генной терапии и перспективы развития данных исследований.

Методы получения трансгенных растений. Бинарная векторная система агробактерий. Прямой перенос трансгенов в растения. Съедобные вакцины. Транспластомные растения.
5. Образовательные технологии.
Виды/формы образовательных технологий.

Преподавание курса ведется в виде лекций. Каждую лекцию сопровождает подготовленная и постоянно обновляющаяся презентация.

Преподаватель курса является действующим специалистом в области микробиологии и генетической инженерии и заинтересован в освоении студентами основ генетической инженерии. В связи с этим со студентами на лекциях часто обсуждаются задачи, построенные на основе современных исследовательских данных.
6. Учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы студентов. Оценочные средства для текущего контроля успеваемости, промежуточной аттестации по итогам освоения дисциплины.

Формой текущего контроля при прохождении дисциплины «Генетическая инженерия» является контроль посещаемости занятий.

1. 
   Изменчивость фага  , контролируемая хозяином. Рестрикция-модификация фаговой ДНК в бактериальных клетках.
   
2. 
   Эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы). Классификация ферментов рестрикции.
   
3. 
   Участок узнавания (сайт) рестриктазы на молекуле ДНК. Липкие и тупые концы фрагментов ДНК, генерируемые эндонуклеазами рестрикции 2-го класса. Изошизомеры.
   
4. 
   Методы поиска штаммов, продуцирующих эндонуклеазы рестрикции 2-го класса.
   
5. 
   ДНК-полимераза I E.coli, ее ферментативные активности. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I.
   
6. 
   Полимеразная цепная реакция.
   
7. 
   Методы конструирования гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК. Коннекторный и рестриктазно-лигазный методы.
   
8. 
   Линкерные молекулы и их использование при клонировании фрагментов ДНК. Применение полимеразной цепной реакции в извлечении и клонировании фрагментов ДНК.
   
9. 
   Векторные молекулы ДНК. Требования, предъявляемые к молекулярному вектору. Понятия о клонирующих, интегративных и экспрессирующих векторах.
   
10. 
    Введение молекул ДНК в клетки бактерий. Компетентность клеток физиологическая и индуцированная. Трансфекция. Трансформация генетическая.
    
11. 
    Методы отбора гибридных клонов бактериальных клеток.
    
12. 
    Методы введения плазмидных и фаговых молекул ДНК в клетки E. coli.
    
13. 
    Клонирующие плазмидные векторы. pSC101-, ColE1-производные.
    
14. 
    Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов.
    
15. 
    Векторы на основе ДНК фага лямбда.
    
16. 
    Космиды. Создание библиотек и энциклопедий генов.
    
17. 
    Векторные плазмиды, обеспечивающие прямой отбор гибридных ДНК.
    
18. 
    Векторы, обеспечивающие экспрессию клонированных нуклеотидных последовательностей в клетках E. coli.
    
19. 
    Эффект дозы гена в экспериментах по молекулярному клонированию. Влияние на уровень экспрессии клонированных генов эффективности их транскрипции.
    
20. 
    Использование штаммов E. coli с пониженной активностью нуклеаз и протеаз для суперпродукции белков.
    
21. 
    Клонирование ДНК-копий матричных РНК и изучение их экспрессии.
    
22. 
    Клонирование химико-ферментативно синтезированных эукариотических генов.
    
23. 
    Иммунотоксины. Искусственные иммуногены.
    
24. 
    Фаговый дисплей и области его применения.
    
25. 
    Влияние структуры молекулы ДНК на ее стабильность в бактериальной клетке.
    
26. 
    Клонирующие векторы B. subtilis на основе плазмид Staphylococcus.
    
27. 
    Особенности строения и экспрессии генов бактерий рода Bacillus по сравнению с генами E. coli.
    
28. 
    Молекулярные векторы экспрессии-секреции из клеток бацилл чужеродных белков.
    
29. 
    Плазмиды дрожжей 2мкм (Scp1) и 3мкм, их молекулярно-генетическая структура.
    
30. 
    Плазмидная трансформация клеток дрожжей.
    
31. 
    Векторные молекулы дрожжей-сахаромицетов. Векторы интеграции (YIp-типа).
    
32. 
    Клонирующие векторы дрожжей (YEp-, YRp- и YCp-типа).
    
33. 
    Стабильность гибридных молекул ДНК в клетках дрожжей.
    
34. 
    Генно-инженерные субъединичные вакцины, продуцируемые клетками дрожжей.
    
35. 
    Введение плазмид и фрагментов ДНК в культивируемые клетки млекопитающих.
    
36. 
    Вирус SV40 как молекулярный вектор.
    
37. 
    Генетическая трансформация мутантных линий клеток животных.
    
38. 
    Котрансформация клеток млекопитающих. Доминантные амплифицируемые маркеры генетической трансформации клеток животных.
    
39. 
    Аденовирусы в качестве молекулярных векторов. Выпотрошенный вектор.
    
40. 
    Экспрессирующие векторы на основе ортопоксвирусов. Создание живых поливалентных вакцин на основе вируса осповакцины.
    
41. 
    Высокоэффективные экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов.
    
42. 
    Методы создания трансгенных животных.
    
43. 
    Подходы к генной терапии и перспективы развития данных исследований.
    
44. 
    Бинарная векторная система агробактерий для получения трансгенных растений. Прямой перенос трансгенов в растения.
    
45. 
    Транспластомные растения.
    
46. 
    Съедобные вакцины.
    

1. 
   Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб.-справ. пособие. – 4-е изд., испр. и доп. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2010. – 514 с.
   

1. 
   Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. Т. 1. Генная и белковая инженерия. – М.: Наука, 2004. – 526 с.
   
2. 
   Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК. Краткий курс. М., «Мир», 1986. - 285 с.
   

• 
  Ноутбук, медиа-проектор, экран.
  
• 
  Программное обеспечение для демонстрации слайд-презентаций.
  

Программа составлена в соответствии с требованиями ФГОС ВПО по направлению «020400.68 Биология», а также в соответствии с Образовательным стандартом высшего профессионального образования, принятым в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет».

"23" августа 2014 г.