Стабильность ферментов и белков [

Ферменты – глобулярные белки, содержащие [²] как регулярные участки (α-спирали и β-листы), так и нерегулярные области типа полимерных петель. На Рис.1.1 приведена структура бактериальной люциферазы. Видно, что это весьма сложное молекулярное образование, которое удерживается в структурированном состоянии действием каких-то внутренних сил. Какова природа этих сил? Что заставляет большую совокупность атомов взаимодействовать друг с другом и формировать уникальную структуру? Очевидно [³], что эти же силы и взаимодействия проявляю себя в элементарных актах катализа, определяя способность субстрата, входить в активный центр и претерпевать химические изменения.

Конформационная гибкость белков должна обеспечивать молекулярную связь между их стабильностью и каталитической активностью. Конформационная жесткость и гибкость белков определяются внутримолекулярными взаимодействиями. Ниже приведен ряд наиболее значимых по вкладу в стабильность белков взаимодействий.

• 
  Ковалентные связи.
  

• 
  Электростатические взаимодействия.
  

U (r) = -z₁z₂e²/ εr (1)

Энергия взаимодействия заряженных частиц может быть весьма значительна. Однако в водном растворе особенно в растворах электролитов кулоновское взаимодействие существенно ослабляется. Молекулы воды имеют большой дипольный момент и поэтому способны, взаимодействуя с заряженными частицами, частично компенсировать их взаимное влияние.

Из изложенного выше следует два важных для практики вывода:

1. 
   в органических растворителях или в микрофазе, близкой по характеристикам к гидрофобному аполярному органическому растворителю, сила электростатического взаимодействия заряженных групп возрастает по сравнению с водой.
   
2. 
   введение в систему дополнительных заряженных ионов приводит к ослаблению к ослаблению электростатического взаимодействия в силу экранирования зарядов введенными ионами.
   

• 
  Водородная связь
  

Исследование показало, что димеризация обусловлена дипольным характером связи О-Н. В свою очередь дипольный характер связи определяется разными электроотрицательностями атомов, образующих связь. Электроотрицательность характеризует способность атома поляризовать ковалентные связи. У кислорода электроотрицательность 3,5, а водорода 2,1. Это приводит к тому, что на атоме кислорода связи О-Н локализуется некоторый избыточный отрицательный заряд, на атоме водорода – некоторый избыточный положительный заряд.

Энергия водородной связи в димере алифатических кислот равна 28,4 ± 0,6 кДж/ моль.

Водородные связи формируют вторичную структуру белка. Образование фермент-субстратного комплексов и «узнавание» молекул субстрата активным центром происходит в большинстве случаев с участием водородных связей.

• 
  Гидрофобные взаимодействия.
  

Гидрофобные взаимодействия играют важную роль в белковых системах. В глобулярных белках [⁵] гидрофобные взаимодействия часто формируют ядро белковой молекулы. Важную роль гидрофобные взаимодействия выполняют при «узнавании» субстратов или ингибиторов активными центрами. Гидрофобные фрагменты субстрата взаимодействуют с гидрофобными участками активного центра, образуя специфические комплексы, ориентирующие реакционный центр субстрата относительно каталитических групп.

Рассмотренные выше молекулярные силы (электростатические, гидрофобные, водородные) характеризуются следующими особенностями.

1. Это слабые взаимодействия, обеспечивающие относительно небольшой выигрыш энергии (свободная энергия образования этих связей составляет 2-25 кДж/моль). Однако в любой белковой молекуле таких связей довольно много. Практически каждая аминокислота полипептидной цепи участвует в образовании одной или двух связей. Это и определяет высокую энергию внутрибелковых связей.

2. Взаимодействия с участием электростатических, водородных и гидрофобных связей протекают кинетически быстро. Скорости образования и распада связей определяются скоростями переориентацией диполей и соизмеримы со скоростями движения молекул. Данное свойство позволяет биологическим системам реализовывать многостадийные процессы с перемещением больших групп ядер, разыгрывая различные сценарии взаимодействий и осуществляя процессы по маршруту с наименьшими кинетическими и термодинамическими барьерами.

Общая инактивационая модель [1] для одноцепочечного белка или фермента включается в себя денатурацию (разворачивание) третичной структуры полипептида (N). Денатурированный белок (U) может повторно скрутиться до начального (неденатурированого) состояния или претерпеть некоторые дальнейшие изменения которые приведут к полной инактивации (I).

N ↔ U → I



Конформационная стабильность свернутого (нативного) белка описывается N ↔ U равновесием, которое можно обозначить, как Tm , которая обозначает температуру, при которой происходит денатурация 50% белка. В большинстве случаях, можно различать  энергию Гиббса (G) при денатурации белка, но для ее расчета, необходимы чтобы белок соответствовал одному из двух состояний, т.е. белок должен быть либо в полностью сложенном (нативном) состоянии, либо полностью в денатурированном (развернутом) состоянии, без существующих промежуточных форм. Биотехнологи, однако, как правило,заинтересованы в скорости перехода N → I состояния. Обычно скорость перехода N → I состояния описывается с помощью экспоненциального закона:

A_t / A₀ = exp (-kt), где

A_t и A₀ активность фермента в момент времени t и 0 соответственно, k – константа скорость первого порядка.