Курсовая работа на тему

История появления

Каждый день в крови погибает огромное количество клеток, а им на смену приходят новые лейкоциты, эритроциты и лимфоциты. Изучая процесс кроветворения, русский ученый А.А. Максимов догадался, что обновление клеток крови отличается от простых клеточных делений. Чтобы поддерживать количество клеток крови, нужен был бы костный мозг огромных размеров. Исходя из того, что наш костный мозг не настолько велик, Максимов предположил, что в нем содержатся специальные клетки, способствующие кровообразованию. Ученый назвал эти клетки стволовыми в 1908 году.

2. Деление стволовых клеток

- симметричное деление

- ассиметричное деление.

В процессе симметричного деления клетки делятся митозом, образуя две новые стволовые клетки, являющиеся аналогами материнской. При помощи такого вида деления поддерживается количественный пул стволовых клеток.

Во время ассиметричного деления стволовых клеток образуется одна дочерняя клетка, аналогичная материнской, и одна клетка, с частично детерминированной функцией (частично дифференцированная).

3. Классификация стволовых клеток.

Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны, а значит могут дифференцироваться во все три зародышевых листка: наружный – эктодерму, внутренний – эндодерму и средний – мезодерму.

Эксперименты с использованием эмбриональных стволовых клеток могут помочь разобраться в сложнейших процессах развития человеческого организма. Разобравшись в функционировании клетки в норме, можно понять, какие нарушения в жизнедеятельности клетки приводят к неизбежным для ткани, а, следовательно, для организма последствиям.

Плюрипотентные клетки, дифференцирующиеся с образованием строго специализированных клеток, могут служить возобновляемым источником не затронутых поражением клеток, замещающих дефектные (поврежденные) клетки, что открывает широкие возможности для лечения таких тяжелых заболеваний, как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, сахарный диабет 1 типа и другие. Тем не менее, получение и использование человеческих эмбриональных СК связано с целым рядом этических проблем, учитывая, что для их получения необходимо нарушать целостность человеческого эмбриона на ранних этапах развития.

Гемопоэтические стволовые клетки находятся в кроветворных органах и крови. Они способны давать начало различным росткам кроветворения.

Регионарные стволовые клетки находятся в тканях кожи, сосудов, кишечника и т. д. и дифференцируются в клетки этих тканей.

В нашем организме присутствуют также мезенхимальные стромальные клетки (МСК), содержащиеся в жировой ткани. Эти клетки способны дифференцироваться в клетки четырёх тканей организма: адипоциты, хондроциты, миобласты и остеобласты.

Очень важной особенностью МСК является их низкая иммуногенность, а также способность подавлять иммунный ответ организма, что крайне важно при осуществлении различного рода аллогенных трансплантаций.

На сегодняшний день обсуждаются возможные области применения МСК для лечения фиброза легких, расстройств центральной нервной системы, остеопороза, восстановления повреждений сердечно-сосудистой системы, спинного мозга, при заболеваниях и травмах суставов и др.

В последней главе данной курсовой работы подробно описывается методика получения, культивирования и дифференцировки МСК из подкожной жировой клетчатки мыши.

Стволовые клетки взрослых организмов (неэмбриональные) используются для лечения различных заболеваний, например, некоторых заболеваний крови и иммунной системы (в том числе генетических). Разрабатываются методы лечения таких патологий, как онкологические заболевания, диабет, синдром Паркинсона, слепота.

4. История получения индуцированных стволовых клеток

Этот процесс теперь называют репрограммированием клеток: превращение дифференцированных клеток в состояние плюрипотентных недифференцированных стволовых клеток. Это достижение привело к тому, что

- любая соматическая клетка, путем манипуляции, может изменить свой уровень дифференцировки и специализации;

- клетки конкретного человека путем манипуляции можно превратить в любые дифференцированные клетки этого же человека, а это удобно, т.к. при пересадке таких клеток они не будут отторгаться иммунной системой, потому что являются клетками того же человека.

5. Использование человеческих стволовых клеток

• 
  выявлять различия между клетками;
  
• 
  понимать, как лечить врожденные дефекты;
  
• 
  испытывать препараты на токсичность до проведения клинических испытаний;
  
• 
  генерировать ткани и/или клетки для трансплантации (при лечении дегенеративных изменений головного мозга, при лечении инфаркта миокарда, переломов).
  

6. Выделение и культивирование первичной культуры стромальных клеток из подкожной жировой клетчатки мыши.

Жировую ткань с области бёдер вырезали в стерильных условиях и поместили в буфер Хэнкса (HBSS, HyClone), содержащий 500 ед/мл пенициллина (Gibco), 500 ед/мл стрептомицина (Gibco), 500 ед/мл фунгизона (Gibco), для избегания контаминации.

Затем пробирку с жировой тканью перенесли в стерильный ламинарный бокс, дополнительно обработав ее спиртом.

В стерильных условиях ламинарного бокса стерильными медицинскими инструментами жировую ткань перенесли в чашку Петри и измельчили до пучения однородной массы с размером частиц не более 2 мм.

Полученную массу переместили в стерильную пробирку с равным объёмом среды роста DMEM (HyClone), содержащей коллагеназу I типа (Wortington) 200 ед/мл и десятую часть объёма нейтральной протеазы (Wortington) с активностью 30 ед/мл.

Жировую ткань инкубировали в растворе ферментов при +35°С в течение 1 часа при постоянном помешивании (300 об/мин).

Далее к образцу ферментированной ткани добавили равный объём полноценной среды роста для инактивации ферментов и центрифугировали 10 минут при 200 g. Состав полноценной среды роста: DMEM, 10% FBS, (HyClone), 10 ед/мл пенициллина (Gibco), 100 ед/мл стрептомицина (Gibco), 100 ед/мл фунгизона (Gibco).

Супернатант удалили, осадок ресуспендировали в 5 мл полноценной среды роста. Полученную суспензию клеток центрифугировали 5 минут при 200 g. Супернатант удалили, к полученному осадку добавили 9 мл стерильной дистиллированной воды для лизиса эритроцитов, смесь ресуспендировали и инкубировали 2 минуты до покраснения раствора. Красный цвет раствора означает лизис эритроцитов. В полученный раствор добавили 1 мл стерильного 10-ти кратного раствора PBS для восстановления осмотического давления, хорошо ресуспендировали и центрифугировали 5 минут при 200 g. Супернатант удалили, а осадок растворили в полноценной среде роста и пропустили через нейлоновое (т.н. клеточное сито) сито (BD, Falcon) с диаметром пор 40 мкм.

Затем клетки высадили в чашку Петри (перед этим чашку Петри подписали). После этого помещаем чашку в инкубатор при 37⁰С и 5% содержании СО₂.

Через сутки прикрепившиеся клетки промыли один раз средой роста, и добавили свежую порцию среды.

Выделенные МСК мыши культивировали в среде роста с сывороткой и антибиотиками в СО₂-инкубаторе при 37⁰С и 5% содержанием СО₂. Среду в чашках Петри меняли 2 раза в неделю. Затем, при достижении клетками конфлюэнтного монослоя клетки пассировали. Для этого монослой клеток однократно промыли буфером раствора Версена и обработали раствором 0,25% трипсина и 0,02% ЭДТА (Gibco).

Суспензию открепившихся от подложки клеток разбавили средой культивирования, пипетировали для дезагрегации и рассадили в двенадцати луночный планшет (Corning Costar).

На рисунке ниже представлена фотография МСК-ЖТ первого пассажа редкого монослоя, сделанная с использованием светового микроскопа:

Для изучения дифференцировки клеток в адипоцитарном и остеогенном направлении использовали коммерческие наборы для дифференцировки клеток: Mesenchymal Stem Cell Protocol: Adipogenic Differentiation Thermo Scientific (USA) и Mesenchymal Stem Cell Protocol: Osteogenic Differentiation Thermo Scientific (USA), соответственно. Методику дифференцировки клеток осуществляли в строгом соответствии с протоколом изготовителя.

Через 4 недели для подтверждения дифференцировки клеток в остеогенном и адипогенном направлении проводили цитологическую окраску Ализариновым красным на отложения Ca (Alizarin Red S) и Oil Red O на жировые отложения в клетках, соответственно. Окрашивание клеток также осуществляли в строгом соответствии с протоколами окрашивания.

На рисунках 2 и 3 представлены клетки, дифференцированные в остеогенном и адипогенном направлении.

7. Вывод

8. Список использованной литературы

• 
  T. V. Sadler, Langman’ s Medical Embriologi, sixth edition;
  
• 
  https://en.wikipedia.org/wiki/Shinya_Yamanaka;
  
• 
  https://www.stvolkletki.ru/articles/1.html;
  
• 
  https://xreferat.ru/55/8158-1-mehanizm-polucheniya-stvolovyh-kletok-problemy-i-perspektivy-ispol-zovaniya-ih-v-medicine.html;
  
• 
  https://en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell.