Фармакогностическое изучение льнянки обыкновенной, произрастающей в пермском крае

Официальные оппоненты:

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита состоится «18» сентября 2012 г. в 13.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.085.06 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2. Тел./факс (342)233-5501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Минздравсоцразвития России по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Автореферат разослан «14» августа 2012 г.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки РФ http://www.mon.gov.ru «14» августа 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России http://www.pfa.ru «14» августа 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01,

кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.

Актуальной проблемой фармацевтической науки на современном этапе является создание эффективных фитопрепаратов из лекарственного растительного сырья. Это связано с тем, что при использовании синтетических препаратов часто развивается лекарственная резистентность и возникают побочные реакции, в то время как некоторые растительные вещества родственны имеющимся в организме человека, потому они малотоксичны и бесконфликтно входят в живую клетку.

Основным источником для поиска новых лекарственных растений является арсенал средств народной медицины. Наибольший интерес при этом вызывают растения, обладающие комплексным действием, так как появляется возможность применения одного средства для лечения целого ряда сопутствующих заболеваний. Например, при сердечно-сосудистых заболеваниях нередко наблюдается нарушение водно-солевого обмена и повышенная свертываемость крови, поэтому наряду с кардиотониками возникает необходимость использования мочегонных средств, относящихся к группе салуретиков и препаратов, предотвращающих развитие тромбоза.

Широкое использование льнянки обыкновенной в народной медицине при лечении заболеваний сердечно-сосудистой системы указывает на необходимость углубленного фармакогностического изучения этого растения, химический состав и фармакологические эффекты которого также изучены недостаточно. В связи с этим, комплексное изучение травы льнянки обыкновенной с целью внедрения ее в научную медицину является актуальным.

Цель исследования. Целью работы являлось анатомо-морфологическое и фитохимическое изучение травы льнянки обыкновенной, произрастающей в Пермском крае, исследование возможности получения экстракционных форм и установление их специфической активности и острой токсичности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить качественный состав биологически активных веществ в траве и органах льнянки обыкновенной.

2. Разработать методику количественного определения флавоноидов спектрофотометрическим методом и составить проект нормативной документации на стандартный образец, используемый в методе количественного определения флавоноидов. Адаптировать методику количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом для травы льнянки обыкновенной.

3. Исследовать динамику накопления биологически активных веществ в траве и органах растения в зависимости от места заготовки, фазы развития и сроков хранения сырья.

4. Разработать оптимальные условия получения экстракционных форм льнянки обыкновенной, исследовать их специфическую активность и острую токсичность.

5. Провести морфолого-анатомическое исследование травы льнянки обыкновенной, выявить диагностические признаки сырья.

6. Установить показатели доброкачественности травы льнянки обыкновенной и разработать проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное фармакогностическое исследование травы льнянки обыкновенной. На основании полученных данных разработан проект ФС «Льнянки обыкновенной трава».

Изучены фармакологические эффекты растения. Установлена ранее неисследованная диуретическая активность и влияние на свертывающую систему крови экстракционных форм из травы и органов льнянки обыкновенной.

Изучен химический состав травы и отдельных органов льнянки обыкновенной, а также динамика накопления основных групп биологически активных веществ в разные фазы развития.

Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в траве льнянки обыкновенной спектрофотометрическим методом. Показана целесообразность стандартизации травы льнянки обыкновенной по содержанию флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин. Разработан проект фармакопейной статьи «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец».

Впервые установлен состав липофильных веществ травы льнянки обыкновенной методом ГЖХ-МС.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований установлена возможность расширения ассортимента лекарственного растительного сырья за счет использования травы льнянки обыкновенной. Установлены основные показатели подлинности и доброкачественности растительного сырья, которые легли в основу ФС «Льнянки обыкновенной трава» и инструкции по сбору и сушке травы льнянки обыкновенной.

Для разработки методики количественного определения флавоноидов в траве льнянки обыкновенной спектрофотометрическим методом составлен проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец».

Научно обоснована целесообразность использования льнянки обыкновенной для получения экстракционных форм, оказывающих диуретическое и антикоагулянтное действие.

Основные положения, выносимые на защиту. Результаты фармакогностического, фитохимического, фармакологического исследования травы льнянки обыкновенной и экстракционных форм на ее основе, обладающих диуретической и противосвертывающей активностью.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермской государственной фармацевтической академии (номер государственной регистрации 01.9.10018875).

Апробация полученных результатов. Основные положения работы доложены и обобщены на научно-практических конференциях: Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования (ПГФА, Пермь, 2009 – 2012); International conference “Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine” (Saint Petersburg, 2011); Межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, 2009); ежегодная конференция «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010); IV международная пироговская научная медицинская конференция студентов и молодых ученых (Москва, 2011); Всероссийская конференция «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010); конференция молодых ученых и студентов ТГМУ им. Абуалиибни Сино с международным участием «Современная медицина в Таджикистане; проблемы, достижения и перспективы развития» (Душанбе, 1012); III международная научно-практическая конференция "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2012).

Личное участие автора. Автор непосредственно участвовал в проведении научных экспериментов, обработке и интерпретации экспериментальных данных, в апробации результатов исследования, подготовке основных публикаций по выполненной работе.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 18 научных работ, из них в изданиях, рекомендованных ВАК – 6 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 185 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, трех глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований, и выводов. Работа иллюстрирована 56 таблицами и 42 рисунками. Библиографический указатель включает 169 источников, из них 27 на иностранных языках.

Во введении изложена актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, обозначена новизна и практическая значимость проведенных исследований; описаны положения, выносимые на защиту.

Первая глава содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы: распространение рода Linaria Mill. и вида L. vulgaris Mill. в Российской Федерации и за рубежом, систематическое положение и ботаническое описание L. vulgaris; данные по химическому составу и использованию вида в народной медицине.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третей главе отражены результаты исследований качественного состава фенольных, иридоидных соединений, углеводов, липофильных веществ льнянки обыкновенной. Приведена адаптация методики количественного определения иридоидов фотоэлектроколориметрическим методом. Описана динамика накопления флавоноидов и ирдоидов в траве и органах растений, произрастающих в разных местообитаниях.

В четвертой главе изложена технология получения экстракционных форм льнянки обыкновенной и исследование их диуретической и антимикробной активности, влияния на свертывающую систему крови и острой токсичности.

В пятой главе приведена разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье: результаты морфолого-анатомических исследований льнянки обыкновенной, стандартизация сырья и разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на ацетилпектолинарин. Описана разработка нормативной документации на государственный стандартный образец ацетилпектолинарин, приведены валидации методик.

В приложении представлены проект ФС «Льнянки обыкновенной трава», проект ФС «Ацетилпектолинарин – государственный стандартный образец», инструкция по сбору и сушке травы льнянки обыкновенной, хроматограммы и спектры, подтверждающие результаты исследования химического состава льнянки обыкновенной, основные документы, отражающие внедрение результатов диссертационной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектом фармакогностического исследования являлась надземная часть с корнями дикорастущего многолетнего травянистого растения льнянки обыкновенной (л. обыкновенная) –Linaria vulgaris (L.vulgaris).

Образцы для исследования собраны в 2008 – 2011 гг. в разных ботаникогеографических зонах Пермского края.

Морфолого-анатомическое строение исследовали на свежем и гербарном материале (30-50) образцов по общепринятым методикам. Изучение объектов проводили с помощью микроскопа МБИ – 1. Изучение срезов и выполнение микрофотографий осуществляли с помощью микроскопа “Motic” (Германия) с цифровой насадкой. Полученные изображения редактировали с применением программ «Motic Image 2000» и «Adobe Photoshop 7.0».

Качественный состав и количественное содержание БАВ исследовали с помощью современных методов фитохимического анализа: хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента, фотоэлектроколориметрия, УФ спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография. Спектрофотометрическое исследование проводилось на приборе СФ-2000. Обнаружение фенольных соединений методом ВЭЖХ проводили на отечественном жидкостном хроматографе «Милихром – 6» на колонке КАХ-6-80-4, заполненной сорбентом Сепарон С-18 с последующей компьютерной обработкой результатов анализа в программе “UniChrom”. Липофильный состав льнянки обыкновенной определяли методом хромато-масс-спектрометрии на хромат-масс-спектрометре Agilent 6890N/5975B.

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI. При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества ЛС. Основные положения».

Исследование диуретической активности проводили на белых крысах мужского пола линии Wistar массой 190-200 г. Препараты сравнения готовили из травы хвоща полевого и листьев брусники. Экскрецию креатинина с мочой определяли унифицированным методом Поппера, основанном на реакции Яффе с помощью стандартного набора реактивов. Концентрацию ионов натрия и калия в моче определяли методом фотометрии на пламенном фотометре JENWAYPSP7.

Антикоагулянтную активность экстрактов исследовали invitro с помощью коагулометра «Minilab-701». Для исследования использовали кровь собаки, стабилизированную 3,8% раствором натрия цитрата в соотношении 9:1. Индуктором свертывания крови служил 0,28% раствор кальция хлорида. Эталоном антикоагулянтной активности служил гепарин, который испытывали в концентрации 1 ED/мл в аналогичных условиях.

Исследования антимикробной активности проводили в соответствии с ГФ XI по отношению к 3 видам тест-микроорганизмов: Escherichia coli АТСС 25922; Staphylococcus aureus АТСС 6538-P; Candida albicans АТСС 885-653.

Изучение острой токсичности сухих экстрактов льнянки обыкновенной проводили на белых мышах при однократном пероральном введении экстрактов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ статистической обработки данных «STAT – Статистика». Для выявления статистической значимости различий использовали параметрический критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химический состав и распределение основных групп БАВ в льнянке обыкновенной

На основании результатов качественного анализа установлено, что преобладающими группами БАВ в траве л. обыкновенной являются фенольные соединения и иридоиды. Изучена химическая изменчивость указанных групп природных соединений по органам растения и в зависимости от фазы развития.

Фенольные соединения

Состав фенольных соединений л. обыкновенной изучен методами хроматографии на бумаге, ТСХ и ВЭЖХ. Методом ТСХ обнаружено 8 веществ фенольной природы (табл. 1). Сравнительный хроматографический анализ травы и органов л. обыкновенной показал, что качественный состав фенольных соединений отличается незначительно, компонентный состав колеблется от четырех до шести веществ. Компоненты 3, 4, 5, 6 по флюоресценции в УФ свете после обработки хромогенным реактивом отнесены к флавоноидам, соединения 1, 2, 7, 8 – к фенолкарбоновым кислотам. С помощью аутентичных образцов (по значению R_f и методом добавки) вещество 5 было идентифицировано как линарин, соединение 6 – как ацетилпектолинарин.

Иридоиды

Иридоидный состав л. обыкновенной изучен методом хроматографии на бумаге. Обнаружено 7 веществ иридоидной природы (табл. 2). Анализируя характер окраски компонентов при проявлении их хромогенными реактивами, установлено, что вещество 4 проявляется только реактивом Бэкона-Эдельмана, а вещества 3, 6, 7 приобретают синюю окраску различной интенсивности при обработке реактивом Шталя. При анализе литературных данных было выявлено, что такое поведение характерно для соединений подгруппы каталпола. Компоненты 1, 2 и 5 проявляют сиреневую окраску под влиянием реактива Шталя, данный факт, позволяет отнести их к подгруппе аукубина.

Исследовано количественное содержание флавоноидов и иридоидов в зависимости от фазы развития в разных органах л. обыкновенной (рис. 1). Для этого разработана методика количественного определения флавоноидов и оптимизирована методика количественного определения иридоидов. Оптимальной для сбора является фаза цветения, т.к. в этот период отмечается высокое содержание БАВ (флавоноиды – 16,7%; иридоиды – 0,21%). Наибольшее количество действующих веществ накапливается в листьях, стеблях и генеративных органах. Учитывая незначительное содержание флавоноидов в корнях

Каталог: files
files -> Вопросы сертификационного экзамена для врачей по специальности «лфк и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа составлена в соответствии с Требованиями к содержанию дополнительных профессиональных образовательных программ
files -> Рабочая программа дисциплины Лечебная физическая культура и массаж Направление подготовки 050100 Педагогическое образование
files -> Лечебная физкультура
files -> К рабочей программе дисциплины «Лечебная физкультура и спортивная медицина»
files -> Рабочая программа учебной дисциплины «медицинская реабилитация» цикла Медицинская реабилитация для специальности 310501 «Лечебное дело» по специализации 310501 «Лечебное дело»
files -> Лекции (час) Семинары (час) Самост работа Всего баллов Модуль 1
files -> Влияние мобильного телефона на здоровье человека