5: Методы гематологических исследований

• 
  Знать расположение костного мозга в организме плода и взрослого человека.
  
• 
  Уметь дифференцировать сновные клеточные элементы костного мозга.
  
• 
  Изучить стадии созревания клеток крови в костном мозге.
  
• 
  Ознакомиться с основными гемопоэтическими факторами и состояниями, связанными с их недостаточностью.
  

• 
  Уметь интерпретировать результаты миелограмм в норме и при различных заболеваниях системы кроветворения.
  
• 
  Ассоциировать изменения в организме с возможными изменениями в миелограмме и периферической крови.
  

Красный костный мозг состоит из фиброзной ткани (стромы) и собственно кроветворной ткани. В кроветворной ткани костного мозга выделяют несколько ростков гемопоэза, количество которых увеличивается по мере созревания. Зрелых ростков в красном костном мозге пять:

• 
  Эритроцитарный
  
• 
  Гранулоцитарный
  
• 
  Лимфоцитарный
  
• 
  Моноцитарный
  
• 
  Мегакариоцитарный
  

Развитие ростков гемопоэза представляет собой сложный процесс дифференцировки клеток. Родоначальники всех ростков названы полипотентными клетками за их способность дифференцироваться в клетки всех ростков гемопоэза под действием цитокинов. Так же эти клетки называют колониеобразующими элементами (КОЭ) за их локальное расположение в костном мозге или стволовыми клетками крови (СКК). Количество полипотентных стволовых клеток, то есть клеток, которые являются самыми первыми предшественниками в ряду кроветворных клеток, в костном мозге ограничено, и они не могут размножаться, сохраняя полипотентность, и тем самым восстанавливать численность. Ибо при первом же делении полипотентная клетка выбирает путь развития, и её дочерние клетки становятся либо мультипотентными клетками, у которых выбор более ограничен (только в эритроцитарный или лейкоцитарный ростки), либо мегакариобластами и затем мегакариоцитами – клетками, от которых отшнуровываются тромбоциты.

Под действием цитокинов КОЭ начинают специализироваться, переходя на следующий этап – олигопотентные клетки, вариантов дифференцировки у них уже меньше. Второе название этих клеток – колониеобразующие единицы (КОЕ), поскольку они расположены более мелкими группами, чем КОЭ. КОЕ неоднородны между собой: выделяют колониеобразующие единицы гранулоцитарно-эритроцитарно-миелоцитарно-макрофагального (КОЕ-ГЭММ) и колониеобразующие единицы лимфоцитарного (КОЕ-Л) ростков. Дальнейшее развитие КОЕ ещё более специфично.

Под действием цитокинов КОЕ-ГЭММ даёт следующие три типа клеток: колониеобразующая единица гранулоцитов и моноцитов (КОЕ-ГМ), колониеобразующая единица эритроцитов (КОЕ-Э) и колониеобразующая единица мегакариоцитов (КОЕ-МГЦ). Эти переходы инициируются лейкопоэтином, эритропоэтином и тромбопоэтином соответственно. Эти КОЕ – последние, дальнейшие клетки ростков называются бластами, поскольку они уже становятся на один путь дифференцировки в одну конечную клетку. Так, КОЕ-ГМ развивается либо в промонобласт, либо в програнулобласт; КОЕ-Э развивается в эритробласт; КОЕ-МГЦ развивается в мегакариобласт. Таким образом, вкупе с лимфоидным ростков, получаются 5 вышеперечисленных ростков гемопоэза.

Кроветворение регулируется:

• 
  факторами роста, обеспечивающими пролиферацию и дифференцировку СКК и последующих стадий их развития,
  
• 
  факторами транскрипции, влияющими на экспрессию генов, определяющих направление дифференцировки гемопоэтических клеток,
  
• 
  витаминами, гормонами.
  

КСФ действуют на специфические клетки или группы клеток на различных стадиях дифференцировки. Например, фактор роста стволовых клеток влияет на пролиферацию и миграцию СКК в эмбриогенезе. В постнатальном периоде на гемопоэз оказывают влияние несколько КСФ, среди которых наиболее изучены факторы, стимулирующие развитие гранулоцитов и макрофагов (ГМ-КСФ, Г-КСФ, М-КСФ), а также интерлейкины. Большинство указанных факторов выделено и применяется для лечения различных болезней. Для получения их используются биотехнологические методы.

Дифференцировка полипотентных клеток в унипотентные определяется действием ряда специфических факторов, поэтинов – эритропоэтинов (для эритробластов), гранулопоэтинов (для миелобластов), лимфопоэтинов (для лимфобластов), тромбопоэтинов (для мегакариобластов).

Большая часть эритропоэтина образуется в почках. Его образование регулируется содержанием в крови кислорода, которое зависит от количества циркулирующих в крови эритроцитов. Снижение числа эритроцитов и соответственно парциального давления кислорода, является сигналом для увеличения продукции эритропоэтина. Эритропоэтин действует на чувствительные к нему КОЕ-Э, стимулируя их пролиферацию и дифференцировку, что в конечном итоге приводит к повышению содержания в крови эритроцитов. При хронической болезни почек выработка эритропоэтина снижается, поэтому такие пациенты нуждаются в медикаментозном его введении. Тромбопоэтин синтезируется в печени, стимулирует пролиферацию КОЕ-МГЦ, их дифференцировку и образование тромбоцитов.

Ингибирующие факторы дают противоположный эффект, т.е. тормозят гемопоэз; их недостаток может быть одной из причин лейкемии, характеризующейся значительным увеличением числа лейкоцитов в крови. Выделен ингибирующий лейкемию фактор (ЛИФ), который тормозит пролиферацию и дифференцировку моноцитов-макрофагов.

Витамины необходимы для стимуляции пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток. Витамин В12 поступает с пищей и соединяется с внутренним фактором (Касла), который синтезируется париетальными клетками желудка. Образуемый при этом комплекс, в присутствии ионов Са²⁺, соединяется с рецепторами эпителиоцитов подвздошной кишки и всасывается. При всасывании в эпителиоциты поступает лишь витамин В12, а внутренний фактор освобождается. Витамин В12 поступает с кровью в костный мозг, где влияет на гемопоэз, и в печень, где может депонироваться. Нарушение процесса всасывания при различных заболеваниях желудочно-кишечного тракта может служить причиной дефицита витамина В12 и нарушений в гемопоэзе.

В крови взрослого человека лейкоцитов содержится в 1000 раз меньше, чем эритроцитов, и в среднем их количество составляет 4-9×10⁹/л. Содержание лейкоцитов в крови не является постоянным, а динамически изменяется в зависимости от времени суток и функционального состояния организма. По наличию специфических гранул в цитоплазме выделяют две большие группы лейкоцитов периферической крови – гранулоциты (к ним относятся нейтрофилы, эозинофилы и базофилы) и агранулоциты (к ним относят лимфоциты и моноциты).

Зрелые нейтрофилы имеют сегментированное ядро, то есть относятся к полиморфноядерным лейкоцитам. Они являются классическими фагоцитами: имеют адгезивность, подвижность, способность к хемостаксису, а так же способность захватывать частицы (например, бактерии). Нейтрофилы способны к активному амёбоидному движению, к экстравазации (эмиграции за пределы кровеносных сосудов), и к хемотаксису (преимущественному движению в направлении мест воспаления или повреждения тканей). Нейтрофилы способны к фагоцитозу, причём являются микрофагами, то есть способны поглощать лишь относительно небольшие чужеродные частицы или клетки.

Нормальным уровнем для человека считается 120-350 эозинофилов на микролитр. Повышение уровня эозинофилов в крови называют эозинофилией, снижение уровня эозинопенией.

Лимфоциты обеспечивают:

• 
  выработку антител – гуморальный иммунитет;
  
• 
  клеточный иммунитет – тип иммунного ответа, при котором активизируются натуральные киллеры, макрофаги и др.;
  
• 
  регуляцию деятельности других клеток.
  

Существует два типа лимфоцитов, выделяющихся по морфологическим признакам: большие гранулярные и малые. К первому типу относятся NK-клетки, реже это делящиеся лимфобласты и иммунобласты, ко второму типу относятся T и B клетки. Лимфоциты имеют небольшие размеры и округлую форму, у них темное ядро, что связано с конденсацией хроматина, и небольшой ободок базофильной цитоплазмы, в которой содержится небольшое количество митохондрий.

Лимфоциты делятся на 3 группы по выполняемым функциям:

• 
  NK-лимфоциты – контролируют качество клеток в организме;
  
• 
  В-лимфоциты – находят антигены и вырабатывают антитела;
  
• 
  Т-лимфоциты – регулируют иммунитет при помощи Т-хелперов и Т-киллеров.
  

Т-лимфоциты делятся на Т-помощников (Т-хелперов), на их поверхности находятся молекулы CD4 и Т-киллеров, на поверхности которых находятся молекулы CD8. Помимо них существуют Т-регуляторы, Т-амплифайеры, Т-контрсупрессоры, Т-клетки памяти. Т-лимфоциты, в отличие от NK-лимфоцитов, отвечают за приобретенный иммунитет, они уничтожают нехарактерные антигены, усиливают воздействие NK-лимфоцитов, усиливают моноциты. Т-лимфоцитов в общем количестве лимфоцитов в крови человека – 65-80%.

И, наконец, B-лимфоциты, их основная функция – образовывать антитела, эти лимфоциты также отвечают за приобретенный иммунитет.

Увеличение числа лимфоцитов в крови называется лимфоцитозом, уменьшение – лимфопенией.

Микроскопия мазка крови – исследование под микроскопом препарата, приготовленного из капли крови (менее 10 мкл) и окрашенного по методу Романовского-Гимзе. Несмотря на появление современных гематологических анализаторов микроскопия окрашенного мазка крови (лейкоцитарная формула крови) является «золотым стандартом» диагностики. Лейкоцитарная формула включает определение относительного количества (%) нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, а также незрелых форм, если они присутствуют в крови.

Микроскопия окрашенного и высушенного препарата производится с использованием иммерсионного объектива. На препарате выбирается тонкое место, на которое наносится капля иммерсионного масла. Согласно правилам работы с микроскопом, сначала производят настройку изображения на малом увеличении, затем его сменяет иммерсионный объектив, который окунают в нанесенную каплю масла. Необходимо выбрать на препарате участок, где эритроциты образуют монослой, то есть лежат рядом и не наслаиваются друг на друга. Место начала подсчета лейкоформулы следует выбирать недалеко от широкого края мазка, но не на самом краю, так как здесь клетки лежат более кучно, что может исказить результат исследования. Существует несколько алгоритмов просмотра препарата. Наиболее удобный и эффективный из них – движение объектива поперек предметного стекла, затем, не доходя до края препарата, небольшой отступ в сторону (2 или 3 шага) и снова движение поперек стекла в противоположную сторону. При этом подсчитываются все клетки лейкоцитарного ряда, попадающие в поле зрения.

В лабораторной практике применяются специальные счетчики для лейкоформул. Современное устройство имеет вид калькулятора, клавиши которого соответствуют клеткам периферической крови и костного мозга. При попадании определенной клетки в поле зрения необходимо нажать соответствующую клавишу на счетчике. По достижении 100 клеток счетчик дает сигнал к завершению работы. Таким образом, мы получаем процентное соотношение видов лейкоцитов в периферической крови.

Исследование лейкоцитарной формулы имеет большое значение в диагностике гематологических, инфекционных, воспалительных заболеваний, а также оценке тяжести состояния и эффективности проводимой терапии. В то же время, изменения лейкоцитарной формулы не являются специфичными – они могут иметь сходный характер при разных заболеваниях или, напротив, могут встречаться непохожие изменения при одной и той же патологии у разных больных.

Лейкоцитарная формула имеет возрастные особенности, поэтому ее сдвиги должны оцениваться с позиции возрастной нормы (это особенно важно при обследовании детей).

Сдвиг влево (в крови увеличено количество палочкоядерных нейтрофилов, возможно появление метамиелоцитов (юных), миелоцитов) может указывать на:

• 
  острые инфекционные заболевания;
  
• 
  физическое перенапряжение;
  
• 
  ацидоз и коматозные состояния.
  

• 
  мегалобластную анемию;
  
• 
  болезни почек и печени;
  
• 
  состояния после переливания крови.
  
• 
  Значительное омоложение клеток.
  

«Провал» лейкоцитарной формулы – бластные клетки, промиелоциты и зрелые клетки, промежуточных форм нет: характерно для дебюта острого лейкоза.

1. 
   Предмет и области изучения гематологии.
   
2. 
   Костный мозг: виды, локализация, строение, функционирование.
   
3. 
   Стволовая клетка крови и ее дифференцировка.
   
4. 
   Колониеобразующие единицы костного мозга, их дифференцировка и взаимосвязь.
   
5. 
   Принципиальная схема костномозгового кроветворения.
   
6. 
   Способы взятия биологического материала для оценки миелограммы: преимущества и недостатки.
   
7. 
   Миелограмма в норме.
   
8. 
   Миелограмма при остром и хроническом лейкозах.
   
9. 
   Миелограмма при острой лучевой болезни.
   
10. 
    Регуляция гемопоэза: факторы роста.
    
11. 
    Регуляция гемопоэза: факторы транскрипции.
    
12. 
    Регуляция гемопоэза: витамины и гормоны.