Стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии

1
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Центр «Биоинженерия» Российской академии наук

На правах рукописи
ЧИСТЯКОВ ДМИТРИЙ ВИКТОРОВИЧ


РЕГУЛЯЦИЯ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ PPARα, -β, -γ ПРИ
СТИМУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
В УСЛОВИЯХ ГИПЕРГЛИКЕМИИ.



03.01.03 – Молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель
Академик РАН, К.Г. Скрябин


Москва – 2014

2
Оглавление
Список сокращений
5
Введение
6 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
8 1.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма
8 1.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета
9 1.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма
11 1.2.Толл-подобные рецепторы (TLR) как часть системы врожденного иммунитета на молекулярном уровне
12 1.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов
12 1.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов
14 1.2.3. Экзогенные и эндогенные лиганды толл-подобных рецепторов
16 1.2.4. Толл-подобные рецепторы в головном мозге
18 1.3. Ядерные рецепторы PPAR на перекрестке метаболических и регуляторных сигнальных путей.
21 1.3.1. Структурные свойства PPAR и механизмы регуляции ими экспрессии генов
22 1.3.2. Экзогенные и эндогенные лиганды PPAR
24 1.3.3. Роль PPAR в регуляции генов липидного метаболизма
25 1.3.4. Регуляция PPAR на молекулярном уровне
30 1.4. Анализ подходов к изучению регуляции ядерных рецепторов PPARα, β, γ при стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии.
31 1.4.1. Клеточные модели гипергликемии
33 1.4.2. Астроциты как объект исследования врожденного иммунитета в центральной нервной системе
33 1.4.3. Изучение регуляции экспрессии генов с помощью ингибиторов белкового синтеза. Явление супериндукции.
36 1.4.4. Деградация мРНК как один из механизмов регуляции экспрессии
40 1.5. Постановка целей и задач исследования
41 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
43

3 2.1. Приборы
43 2.2. Реактивы и препараты
43 2.3. Выделение и культивирование клеточных линий
46 2.3.1. Первичные астроциты крысы
46 2.3.2. Клеточная культура HeLa
47 2.3.3. Клеточная культура С6 48 2.3.4. Оценка пролиферации клеток
48 2.4. Выделение тотальной РНК
49 2.5. Определение экспрессии генов
51 2.6. Иммуноблотинг и электрофорез
53 2.7. Измерение концентрации простагландина (PG) Е
2 54 2.8. Измерение ДНК-связывающей активности PPAR
55 2.9. Статистический анализ
57 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
58 3.1. Характеристика воспалительного процесса в условиях гипергликемии на клетках линии HeLa.
58 3.1.1. Влияние LPS на экспрессию генов COX-1 и COX-2 в клетках, культивируемых с высокой концентрацией глюкозы
59 3.1.2. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов COX-1 и COX-261 3.1.3. Влияние LPS на уровень экспрессии генов PPARα, PPARβ и PPARγ 63 3.1.4. Влияние росиглитазона на уровень экспрессии генов PPARα, -β и -γ. 64 3.2. Характеристика TLR-стимулированных ответов астроцитов в условиях гипергликемии
69 3.2.1. Морфология и иммуноцитохимия по GFAP для астроцитов культивируемых при разной концентрации глюкозы.
69 3.2.2. Влияние глюкозы на выброс PGE
2
и TNFα в астроцитах при активации системы врожденного иммунитета.
71 3.2.3. Изменение экспрессии и ДНК-связывающей активности PPARα, -β, -γ при культивировании астроцитов в условиях гипергликемии.
72

4 3.2.4. Влияние глюкозы на экспрессию трех изоформ PPAR в условиях активации системы врожденного иммунитета.
74 3.2.5. Модуляция LPS-стимулированного воспалительного ответа в астроцитах с помощью MAPK ингибиторов в условиях повышенной концентрации глюкозы в среде культивирования.
77 3.3. Исследование механизма регуляции ядерных рецепторов PPAR при активации TLR на астроцитах.
81 3.3.1. TLR-агонисты подавляют уровень экспрессии PPARα и PPARγ, но увеличивают экспрессию PPARβ
81 3.3.2.Характеристика LPS-стимулированной экспрессии мРНК и белка
PPARα, -β, -γ.
86 3.3.3. Скорость распада мРНК PPARα, -β, -γ. замедляется при активации
TLR4.
91 3.3.4. Активация p38 и скорость деградации мРНК
93 3.3.5. Модуляция экспрессии и активности PPARα, -β, -γ различными ингибиторами MAPK
94 3.3.6. Роль p38 в регуляции экспрессии PPARα, -β, -γ.
103 3.3.7. Роль циклогексимида в регуляции экспрессии мРНК PPARα, -β, -γ. 104 3.3.8. Регуляция СОХ-2 в астроцитах при стимуляции TLR
107 3.3.9. Обобщенная схема регуляции изоформ PPAR в LPS-стимулированных астроцитах.
114 4. ВЫВОДЫ
118 5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
119

5
Список сокращений
LPS – Липополисахарид клеточной стенки бактерий
MAPK - митоген-активируемая протеинкиназа
ERK - киназа, регулируемая внеклеточными сигналами
JNK - c-Jun-N-терминальная киназа
FGL - флагеллин
PGN - пептидогликан
PPAR – рецеторы активаторов пролиферации пероксисом
TLR – Толл-подобный рецептор
PG – простагландин
TNFα, - фактор некроза опухоли
IL – интерлейкин
DAMP - Молекулярный паттерн , ассоциированная с повреждениями
PAMP - патоген-ассоциированный молекулярный паттерн
GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок
COX - циклооксигеназа

6
Введение
В последнее десятилетие значительно повысился интерес к исследованиям системы врожденного иммунитета, поскольку стало понятно, что нарушения механизмов неспецифической защиты организма имеют отношение не только к клеткам иммунной системы, но и ко всем другим клеткам организма. Активация врожденного иммунитета сопровождается развитием воспалительных процессов и, как следствие, участвует в патогенезе системных заболеваний с воспалительной компонентой. К таким заболеваниям относят диабет 2 типа, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания и другие. Более того, у пациентов с гипергликемией и гиперлипидемией наблюдаются нарушения в протекании воспалительных процессов, что указывает на взаимосвязь метаболизма, потребления энергии и системы врожденного иммунитета.
Ядерные рецепторы PPAR (дословный перевод «рецепторы активации пролиферации пероксисом») относят к факторам транскрипции, которые регулируют пересечение воспалительных процессов и энергетического метаболизма. Существует три изоформы этих рецепторов α, β, γ, которые имеют структурное сходство, ряд общих агонистов, но кодируются разными генами. Синтетические специфические агонисты PPARα и PPARγ используют для лечения гипергликемии и гиперлипидемии, а также исследуются как потециальные противовоспалительные препараты. Агонисты
PPARβ считаются перспективными для лечения ожирения и нарушений механизмов восстановления и регенерации тканей. Терапевтическая привлекательность использования агонистов привела к значительному количеству исследований
PPAR на молекулярном уровне. Однако, основное внимание уделено характеристике действия агонистов и активируемых ими рецепторов на различные клеточные ответы, в то время как регуляция самих рецепторов
PPAR изучена относительно мало. В то же время, понимание молекулярных механизмов регуляции этих рецепторов может дать ключ к управлению

7 процессов на пересечении метаболических, энергетических и воспалительных процессов.
Традиционно изучают изоформы PPAR на разных клеточных объектах.
Однако в исследованиях последних лет было показано, что при разворачивании клеточных ответов на различные стимулы изоформы PPAR вступают на регуляторном уровне во взаимодействие между собой. Поэтому в данной работе выбраны для исследования типы клеток, на которых экспрессированы все три изоформы (линии клеток человека HeLa, глиомы крысы С6, первичные астроциты крысы).
Изучение воспалительных процессов в центральной нервной системе, которая защищена от проникновения «чужеродных» стимулов представляет особый интерес. Исследования последних десятилетий показывают, что на клеточном уровне воспалительные процессы характерны для различных заболевания мозга, в том числе рассеянный склероз, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Важную роль при этом играют глиальные клетки мозга - астроциты и микроглия. Если микроглию по своим основным функциям можно отнести к клеткам иммунной системы, то основная роль астроцитов заключается в энергетическом, метаболическом и сигнальном сопровождении функций нейронов. Понимание молекулярного механизма регуляции PPAR на астроцитах при активации врожденного иммунитета является актуальной задачей современных исследований в нейробиологии.
Активация системы врожденного иммунитета происходит через рецепторы различных классов, наиболее изученным из которых являются толл-подобные рецепторы (TLR), расположенные на плазматической и внутриклеточных мембранах большинства клеток. В данной работе фокус исследований на взаимосвязи TLR, локализованных на плазматических мембранах (типы TLR2, TLR4, TLR5) и трех изоформ PPAR – PPARα, PPARβ,
PPARγ. Целью работы являлось установление механизмов регуляции ядерных рецепторов трех изоформ при стимуляции указанных TLR. Исследования

8 молекулярных процессов проводили на клеточных моделях. Условия гипергликемии создавали адаптацией клеток к повышенному содержанию глюкозы, т.е на клеточном уровне. Такой подход позволил построить общую схему регуляции PPAR с учетом регуляции на пост-транскрипционном уровне и оценить возможность направленного управления процессом с использованием ингибиторов митогенактивированных протеинкиназ (MAPK).
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Врожденный иммунитет как защитная система организма
В классическом представлении иммунитет — это сопротивляемость организма к инфекциям и инвазиям чужеродных организмов, обладающих антигенными свойствами. Традиционно в иммунной системе выделяют врожденную и приобретенную компоненту. Приобретенный специфический иммунитет реализуется В и Т лимфоцитами. Эти клетки снабжены специальными рецепторами, распознающими антигены, с помощью которых осуществляется процесс распознавания, своего антигена от чужого. Затем, при необходимости, включаются механизмы продукции антител
— иммуноглобулинов.
После этого ответа остается специфическая иммунологическая память, которая позволяет намного быстрее среагировать при повторном попадании в организм уже ―знакомого‖ антигена.
Хотя приобретенный иммунитет обладает крайне высокой специфичностью и эффективностью в борьбе с чужеродными организмами, с момента поражения организма проходит от трех до пяти дней до момента эффективного включения иммунного ответа. В связи с этим, особую актуальность приобретают механизмы врожденного иммунитета, которые активизируются сразу после инфицирования, и запускают процессы подавления болезнетворных агентов. Эти защитные механизмы включают различные

9 антимикробные пептиды, фагоциты, альтернативный путь комплемента и многие другие [1].
На уровне клетки до недавнего времени врожденный иммунитет рассматривался как неспецифические иммунные реакции, вызванные клетками-фагоцитами (макрофаги, нейтрофилы), которые захватывают и лизируют микробиологические патогены. Однако, в настоящее время показано, что на молекулярном уровне система врожденного иммунитета существует во всех типах клеток, она играет роль не только при попадании чужеродного организма, но и при нарушениях нормального функционирования организма по «внутренним» причинам, такими как тепловой шок, гибель клеток, воздействие различных химических веществ и другими стимулами, не связанными с иммунной системой в еѐ
«классическом» описании. Нарушения системы врожденного иммунитета сопровождают ряд патологических состояний.
В настоящее время исследования системы врожденного иммунитета стали фокусом многих исследований (см, например, обзоры [1,2]). Понимание молекулярного механизма функционирования этой системы связывают с лечением, так называемых системных заболеваний, таких как атеросклероз, диабет 2 типа, инсульт, хронические респираторные заболевания, некоторые формы рака и другие [3–5]. Для всех этих заболеваний характерны протекание воспалительных процессов, которые на молекулярном уровне являются проявлениями изменений в системе врожденного иммунитета.

1.1.1. Воспаление как ответ системы врожденного иммунитета
Врожденный иммунитет проявляется при развитии воспаления. На уровне ткани, острое воспаление характеризуется покраснением, увеличением температуры, болью и отеком, что является результатом местной иммунной реакции. Воспалительный процесс сам по себе является эволюционно выработанной защитной реакцией организма. Активируются процессы, удаляющие воздействие на стимул. Включаются процессы, восстанавливающие

10 поврежденные ткани. На молекулярном уровне выделяют стадию инициации, развития и завершения воспалительного ответа (Рис. 1.1.).
Рис.1.1. Развитие воспалительного ответа во времени
На стадии инициации стимул связывается с рецептором и запускает внутриклеточные сигнальные процессы, которые приводят к высвобождению провоспалительных молекул различного типа. Эти молекулы – цитокины, хемокины, другие белки, а также низкомолекулярные вещества, в первую очередь, простагландины (PG) и NO [6,7]. Задача этой стадии – усилить ответ, мобилизовать защитные ресурсы организма. Одновременно или через некоторое время (это остается нерешенным вопросом в настоящее время) появляются и антивоспалительные вещества, которые уменьшают интенсивность ответа и ограничивают продолжительность стадии инициации [8,9]. Восстановление системы до исходного состояния происходит на стадии разрешения ответа.
Раньше представляли, что завершение воспаления – это пассивный процесс, однако в настоящее время регуляцию этой стадии считают ключом к терапии системных заболеваний [8,10]. Избыточная реакция организма (клетки) на стадии инициации приводит к гибели организма (например, сепсис), нарушения стадии восстановления приводит к возникновению хронических воспалительных

11 процессов, которые и составляют «воспалительную компоненту» многих системных заболеваний.
Особый интерес представляет воспаление в центральной нервной системе
(ЦНС). Ранее этому вопросу уделялось недостаточно внимания, поскольку ЦНС хорошо защищена от проникновения «чужеродных» стимулов. В исследованиях последних десятилетий показано, что воспалительные процессы характерны для различных заболеваний мозга, таких как рассеянный склероз, вирус- ассоциированная деменция иммунодефицита человека, вторичные травмы, болезни Альцгеймера и Паркинсона (смотри обзоры [10,11]. Исследования показывает, что ингибирование воспалительных процессов является одним из наиболее важных механизмов в предотвращении повреждения мозга в ходе развития нейродегенеративных процессов [10,12].
1.1.2. Взаимосвязь воспаления и нарушений метаболизма
Из того факта, что система врожденного иммунитета отвечает на различные изменения в окружающей среде (как внешней, так и внутренней, как относительно организма, так и относительно отдельных клеток), логично вытекает предположение, что изменения в метаболизме, структурном или энергетическом, тоже должны быть связаны с системой врожденного иммунитета. Действительно, в настоящее время возникло ясное понимание, что болезни с нарушением метаболизма, такие как диабет 2 типа, ожирение, гипергликемия, вызывают нарушение воспалительного ответа [4,13]. Известно, что ожирение приводит к слабой активации систем воспалительного ответа, и развитию хронических воспалительных процессов в организме, и в первую очередь это связывают с нарушениями в регуляции системы TLR, как на уровне организма, так и на уровне клеток. [14–16].
Гипергликемия, т.е. повышение уровня глюкозы в крови, характерно для многих нарушений гомеостаза, в первую очередь, для диабета 2 типа [3].
Поэтому взаимосвязь гипергликемии и системы врожденного иммунитета изучается на разных тканях и клетках. Но особый интерес представляет нервная

12 система. Клетки мозга чрезвычайно чувствительны к изменению содержания глюкозы в крови [17]. Длительное изменение уровня глюкозы при гипергликемии вызывает изменения в функциях клеток нервной системы
(нейронов и клеток глии) [18]. Увеличивается риск появления когнитивных нарушений, деменции, депрессии и инсульта [19,20]. На клеточном уровне показано, что гипергликемия сопровождается увеличением гибели нейронов и активацией астроцитов, вызывая глиозис [21,22].
Таким образом, понимание на молекулярном уровне регуляции системы врожденного иммунитета и ее взаимосвязи с различными метаболическими нарушениями в организме является актуальной задачей современных исследований.
1.2.Толл-подобные рецепторы (TLR) как часть системы врожденного
иммунитета на молекулярном уровне

В общем случае клетки млекопитающих узнают о присутствии патогенов с помощью группы рецепторов, называемых паттерн узнающие рецепторы
(PRRs, pattern recognition receptors). Эти рецепторы специализируются на распознавании консервативных молекулярных структур патогенов. Эти структуры называют патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP)
[23,24]. В этой группе выделяют семейства Толл-подобных, RIG-I подобных,
Нод-подобных и цитозольных ДНК рецепторов [1]. Наиболее изученными на молекулярной уровне являются Толл-подобные рецепторы. Рассмотрим их подробнее.
1.2.1. Строение и локализация Толл-подобных рецепторов
В 1985 году биолог Кристиана Нюсляйн-Фольхард в ходе работы над дрозофилами идентифицировала ген названный Толл, ответственный за эмбриональное развитие дрозофилы (цит. по [23]). В 1997 году Руслан
Меджитов с соавторами клонировали человеческий гомолог Толл-белка дрозофилы, который теперь известен как TLR4, и показали, что активация этого

13 белка приводит к развитию врожденного иммунного ответа [25]. Было показано, что TLR4 участвует в воспалительном ответе при обработке мышей липополисахаридом (LPS) [26]. Эти открытия стимулировали исследования вызванной патогенами внутриклеточной передачи сигналов, которые имеют решающее значение для понимания механизмов, регулирующих врожденный иммунитет [27].
Толл-подобные рецепторы, характеризуются тремя основными доменами:
1) богатый лейцином внеклеточный домен, 2) трансмембранный домен, 3) цитоплазматический TIR домен, гомологичный подобному в IL-1 рецепторе, называемый Toll/IL-1 рецептор (TIR) домен [28]. Узнавание TLR лиганда обусловлено внеклеточным доменом, который содержит лейцин-богатые повторы (LRR) содержащие 19-25 копий [29] (Рис. 1.2). Внутриклеточный домен отвечает за образование гомо- и гетеромеров между TLR, т.е. с аналогичными белками или белками других TLR рецепторов. При образовании гетеродимеров их обозначают таким образом: TLR1/2 (гетеродимер TLR1 и TLR2). Также внутриклеточный домен отвечает за взаимодействие с адапторами, содержащими TIR домены [30]. Образование таких белковых комплексов приводит к активации TLR-сигнальных путей.
Рис.1.2. Строение Толл-подобного рецептора.

14

На данный момент обнаружено 10 различных TLR рецепторов у человека и 13 TLR рецепторов у мышей [24,31]. Среди них TLR1-10 общие у людей и мышей, хотя TLR10 не функционален у мышей из-за ретровирусной вставки, в то время как TLR11-13 у людей не обнаружены (цит. по [23]).
TLR рецепторы можно разделить на 2 большие группы, в зависимости от их локализации в клетке. Первая группа включает в себя TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 и TLR11, которые расположены на плазматической клеточной мембране, и отвечают за распознавание фрагментов клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий, липопротеинов и белков. Вторая группа рецепторов включает в себя TLR3, TLR7, TLR8 и TLR9. Эти рецепторы расположены на мембранах внутри клеток, в эндоплазматическом ретикулуме, эндосомах и лизосомах. и отвечают за распознавание бактериальных и вирусных нуклеиновых кислот [23].
Толл-подобные рецепторы характерны не только для иммунных клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, B и Т-лимфоциты, но и для не- иммунных клеток, включая фибробласты и эпителиальные клетки, а также клетки нервной системы [12].

1.2.2. Внутриклеточная сигнализация Толл-подобных рецепторов
Стимуляция
TLR приводит к активации сложной системы внутриклеточных ответов, который включает в себя различные адапторные белки, киназы, факторы транскрипции (Рис. 1.3). После связывания лиганда рецепторы TLR образуют гомодимеры или гетеродимеры [1,23], и запускают сигнальный каскад к ядру клетки через так называемые MyD88-зависимый и
MyD88-независимый пути [23,24]. MyD88 это цитозольный адаптерный белок, участвующий в передаче сигнала всех TLR, кроме TLR3. TLR1-2 и TLR5-13 действуют только через MyD88-зависимый путь. Толл-подобные рецепторы использующие этот путь могут активировать транскрипционный фактор АР-1 [2] через так называемый МАРК сигнальный путь (МАРК – митогенактивируемые протеинкиназы) [23], NF-κB [32] или регуляторный фактор интерферона 5 [7].

15

Рис.1.3.
Схема
внутриклеточных
сигнальных
путей
для
плазматических TLR

TLR4 реализует свой сигнал как через MyD88-зависимый, так и MyD88-- независимый путь (Рис. 1.3). MyD88-зависимый путь в TLR4 сигнальном пути требует взаимодействия MyD88 с адаптерным белком TIRAP (адаптерный белок содержащий TIR домен) для инициации сигнального каскада, приводящего к транслокации ядерного фактора NF-κB и активации MAPK сигнального пути [1].
Различают такие МАРК пути как ERK-CREB, JNK-AP1 и p38 пути (Рис. 1.3.).
Это приводит к стимуляции экспрессии и быстрому синтезу различных цитокинов, хемокинов и их рецепторов, включая TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-1ra, IL-6,
IL-8, IL-10, IL-12p40, IL-23 [33]. А также экспрессии индуцибельной NO синтетазы и циклооксигеназы 2 (COX-2), ферментов, принимающих участие в

16 синтезе NO и простагландинов, важных маркѐров воспаления [34,35]. Таким образом, нисходящий каскад передачи сигнала вызванного активацией TLR завершается регуляцией множества целевых генов, кодирующих цитокины, хемокины, факторы роста, различные ферменты и другие медиаторы воспаления
[34,35]. Чрезмерное и/или слишком длительное действие медиаторов воспаления может быть вредно для клеток и ткани. Поэтому TLR-сигнальный путь контролируется с помощью различных механизмов обратной связи [36,37].
С другой стороны, MyD88-независимый сигнальный путь контролируется другими адаптерными белками (Рис. 1.3). Среди них TICAM-1 (TLR адаптерный белок 1), TICAM-2, TRIF (содержащий TIR-домен), TRAM (TRIF-related adaptor molecule). Адапторные белки активируют транскрипционный фактор IRF3 (IFN регуляторный фактор 3) и последующий синтез IFN-β и хемокина RANTES
(Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted) [23].
Таким образом, между сигналами с разных типов TLR существует как сходство, так и различие. Если первоначальные исследования фокусировались обычно на одном типе рецепторов, то последнее время стало актуальным изучение взаимодействия между сигнальными путями TLR [36,38]. Это особенно существенно в контексте изучения патологий, когда изменения в активности одних рецепторов влияют на другие. Такие изменения могут происходить при развитии хронических воспалений [39], метаболических нарушениях
[4,13], т.е. во всех случаях включения механизмов обратных связей и взаимодействия между отдельными путями на системном уровне.

Каталог: res -> Dissertation
res -> Резолюция IV съезда токсикологов россии с международным участием
res -> Поиск «иван-чай» / 24. 10. 08 нашлось 2 млн страниц, 1200 картинок
res -> Средства физического воспитания
Dissertation -> Оксибутирата с полиэтиленгликолем для инженерии костной ткани
Dissertation -> Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук