Оксибутирата с полиэтиленгликолем для инженерии костной ткани

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова биологический факультет на правах рукописи


ЖАРКОВА ИРИНА ИГОРЕВНА
МАТРИКСЫ ИЗ БИОСИНТЕТИЧЕСКОГО СОПОЛИМЕРА ПОЛИ-3-
ОКСИБУТИРАТА С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководитель к.б.н. А.П. Бонарцев

Москва — 2016

2

Оглавление
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9 1.1. Биоматериалы 9 1.1.1. История применения биоматериалов. Биосовместимость. Типы материалов 9 1.1.2. Металлы 15 1.1.3. Керамика 17 1.1.4. Натуральные полимерные материалы 21 1.1.5. Полимерные материалы искусственного происхождения 25 1.2. Полиоксибутират 28 1.2.1. Строение и синтез ПОБ 30 1.2.2. Синтез сополимеров ПОБ 32 1.2.3. Синтез ПОБ-ПЭГ 34 1.2.4. Деградация ПОБ 35 1.3. Мезенхимальные стволовые клетки 37 1.4. Матриксы для регенерации костной ткани 41 1.4.1. Требования к материалам для инженерии костной ткани 41 1.4..2. Способы изготовления матриксов для тканевой инженерии 45 1.4.3. Модификации методов в комбинации с другими техниками и материалами ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54
2.1. Условия синтеза ПОБ и его сополимеров 54 2.2. Исследования материалов 55 2.2.1. Определение молекулярной массы полимера 55 2.2.2 Ядерно-магнитный резонанс 56
2.2.3. Изготовление полимерных пленок 57 2.2.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 58 2.2.5. Измерение контактных углов 58 2.2.6. Водопоглощение 59

3 2.2.7. Атомно-силовая микроскопия 59
2.2.8. Механические свойства полимерных материалов 61 2.2.9. Биосовместимость in vitro 61 2.3. Получение и первичные исследования матриксов 63 2.3.1. Метод газообразования с использованием бикарбоната аммония
((NH
4
)
2
CO
3
) 63 2.3.2. Метод выщелачивания напористом шаблоне с использованием сахарозы (С
12
Н
22
О
11
) 64 2.3.3. Первичные исследования 64 2.3.3.1. Пористость и размер пор 64 2.3.3.2. Проверка на остаточные соли 65 2.3.3.3. Рост клеток на матриксах 65 2.4. Плоские пористые матриксы, полученные методом выщелачивания с использованием бикарбоната аммония 65 2.4.1. Пористость и размер пор 66 2.4.2 . Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 66 2.4.3. Адсорбция белков 66 2.4.4. Биосовместимость 66
2.4.4.1. Получение мезенхимальных стволовых клеток МСК 66 2.4.4.2. Фенотипирование МСК мыши методом проточной цитометрии 67 2.4.4.3. Цитотоксичность и поддержание роста МСК 67 2.4.4.4. Сканирующая электронная микроскопия 68 2.4.4.5. Конфокальная микроскопия 68 2.4.5. Остеонаправленная дифференцировка МСК 68
2.4.5.1. Окраска ализариновым красным 69 2.4.5.2. Щелочная фосфатаза 69 2.4.6. Импалантация in vivo и тканевая реакция на мелких лабораторных животных 70 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Синтез полимера ПОБ и его сополимеров 72

4 3.2. Исследование физико-химических свойств полимерных материалов 77 3.2.1. Физико-термические свойства полимеров 78 3.2.2. Гидрологические свойства сополимеров 80 3.2.3. Исследование ультратонких пленок из сополимеров 81 3.2.4. Механические свойства полимерных материалов 84 3.2.5. Биосовместимость полученных полимеров in vitro 86
3.3. Получение и первичные исследования матриксов 90 3.3.1. Полученные изделия и их структура 90 3.3.2. Проверка на остаточные соли 91 3.3.3. Биосовместимость in vitro 92 3.4. Плоские пористые матриксы, полученные методом выщелачивания с использованием бикарбоната аммония 94 3.4.1. Структура плоских матриксов из различных материалов 94 3.4.2. Термические свойства плоских матриксов 97 3.4.3. Адсорбция белка 98 3.4.4. Мезенхимальные стволовые клетки 101 3.4.5. Биосовместимость пористых матриксов 102 3.4.6. Направленная остеогенная дифференцировка 107 3.4.6.1. Окраска ализариновым красным 108 3.4.6.2. Сканирующая электронная микроскопия 108 3.4.6.3. Щелочная фосфатаза 110 3.4.6.4. Экспрессия поверхностных маркеров МСК 111 3.4.7. Импалантация in vivo и тканевая реакция на мелких лабораторных животных 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120 ВЫВОДЫ 122 БЛАГОДАРНОСТИ 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125

5
ВВЕДЕНИЕ
За последние годы тканевая инженерия стала одним из перспективных и важных направлений в экспериментальной биомедицине. Одной из наиболее важных областей исследований в тканевой инженерии является заместительная терапия. Клетки могут быть трансплантированы в организм в двух формах - в виде суспензии или прикрепленными к какому-либо твердому носителю. Причем второй тип конструкции является более предпочтительным для терапии твердых соединительных тканей. Широкое применение в данной области медицины получают полимерные материалы и их подбор для реализации тех или иных биологических задач является актуальным. Наиболее широко применяемыми в клинической медицинской практике являются полимерные материалы синтетического происхождения, такие как полимолочная и полигликолевая кислоты, поликапролактон и другие. Из преимуществ этих материалов можно выделить достаточно доступное сырье для производства, возможность производства в промышленных масштабах, низкую токсичность. Но данные материалы имеют некоторые недостатки, основными из которых являются химический способ производства, который приводит к остаточному содержанию неорганических примесей в процессе производства, достаточно быстрая биодергадация и, связанное с этим локальное закисление среды, вызывающее местное хроническое воспаление. В связи с этим полимерные материалы микробиологического происхождения, такие как полиоксиалканоаты постепенно выходят на первый план и их изучение становится более востребовано. Наряду с проблемой выбора самого материала, не менее актуальной является форма полимерного конструкта. Что касается твердой соединительной ткани, то здесь наиболее приоритетными свойствами имплантата являются прочность и пористость. Но, к сожалению, эти

6 характеристики являются взаимоисключающими, те. логично, что чем более пористый матрикс, тем он менее прочный.
Биоматериалы и тканевую инженерию сих использованием можно назвать одними из наиболее широко распространенных направлений изучения как на прикладном, таки на фундаментальном уровне. Одной из наиболее острых проблем биоматериалов и изделий, получаемых на их основе, является неудовлетворительное взаимодействие поверхности имплантата с окружающими тканями. Другими словами, повышение свойств биосовместимости материалов является первоочередной задачей исследователей. Чаще всего стратегией при создании какого-либо медицинского изделия является выбор материала- основы, удовлетворяющий наибольшему количеству параметров исходя из предназначения изделия. Остальные свойства обычно улучшают с помощью различных добавок. Одной из стратегий улучшения свойств биополимеров для их использования в тканевой инженерии является создание новых биоматериалов из сополимеров или композитов полимеров, различающихся по своим свойствам. Наиболее широко распространенным представителем этого семейства полимеров является поли-3-оксибутират. В нашей лаборатории его получают микробиологическим биосинтезом с использованием штамма-продуцента
Azotobacter croococcum Б. Основными свойствами гомополимера ПОБ являются биосовместимость, биодеградация, то, что ПОБ является твердым достаточно прочным веществом и гидрофобность. Одним из популярных методов модификации гидрофобности является использование полиэтиленгликоля (ПЭГ). Он биосовместим, используется в фармацевтике и медицине и является вязким, пластичным материалом с высокой гидрофильностью. В данном исследовании проводилась работа по сравнению свойств материалов, а также изделий на основе ПОБ и ПЭГ. Водном случае это был

7 материал, полученный микробиологическим синтезом, и представляющий собой сополимер поли-3-оксибутират-со-полиэтиленгликоль (ПОБ-ПЭГ), а в другом случае это был композитный материал, полученный механическим смешиванием ПОБ и ПЭГ, и конечно, в качестве контроля использовался чистый гомополимер ПОБ. Таким образом, целью данной работы было Разработка пористых полимерных конструкций на основе сополимера поли-3-оксибутирата-со-полиэтиленгликоля для инженерии костной ткани. В соответствии с целью исследования были сформулированы следующие задачи Биосинтез сополимера поли-3-оксибутирата с полиэтиленгликолем и изучение его физико-химических свойств Разработка методики создания пористых матриксов из полученного полимера Изучение физико-химических свойств и биосовместимости полученных матриксов Исследование роста и дифференцировки МСК в остеогенном направлении in vitro на полученных матриксах Исследование остеокондуктивных способностей матриксов в условиях
in vivo
Научная новизна. В ходе данной работы из нескольких сополимерных материалов, впервые полученных с использованием штамма Azotobacter chroococcum 7B, был выбран ПОБ-ПЭГ как обладающий максимальными параметрами гидрофильности. Впервые на основе этого сополимера была разработана методика получения плоских пористых конструкций со средним диаметром пор 100 мкм для тканевой инженерии. Впервые была показана способность матриксов из сополимера ПОБ-ПЭГ влиять на степень дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток, а также продемонстрирована биосовместимость полученных матриксов с костной тканью и их остеокондуктивные свойства

8
Практическая значимость работы. Полученные полимерные конструкции из биосинтетического ПОБ-ПЭГ обладают хорошей биосовместимостью, поддерживают рост мезенхимальных стволовых клеток, а также показывают высокую совместимость с костной тканью в условиях in vivo и остеокондуктивные свойства. На основании этих результатов, мы можем предложить возможное практическое использование данных конструкций в тканевой инженерии, ив частности, в инженерии костной ткани, с целью разработки новых медицинских изделий для челюстно- лицевой хирургии.
Апробация работы.
Основные положения диссертационной работы были доложены на Первой международной конференции "Неделя клеточных технологий " Украина, Киев, майна Пятой Всероссийской научно-практической конференции "Стволовые клетки и регенеративная медицина" ( Москва, ноябрь 2013), на Второй международной конференции по биоинформатике и биомедицинской инженерии (Испания, Гранада, апрель 2014), на Международной конференция Клеточные технологии на рубеже Исследования и практика ( Санкт-Петербург, апрель 2016), на одиннадцатом симпозиуме Поликонденсация 2016» 9 Москва, сентябрь 2016.

9

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1. Биоматериалы.
1.1.1. История применения биоматериалов. Биосовместимость.
Типы материалов.
Биоматериалами обычно называют синтетические и природные материалы, которые используются в контакте с биологическими системами. Интерес к этому предмету росс каждым годом и почти за полвека его существования стал одним из ключевых в области хирургии, тканевой инженерии и имплантологии. Он включает в себя аспекты медицины, биологии, химии и материаловедения. История протезирования и использования биоматериалов берет начало с древних времен. На рисунке 1 мы видим фотографию протеза, выполненного из дерева и обтянутого лоскутами кожи для фиксации. Данная находка датируется 1065-740 г. до н.э.[ Nerlich A.G., 2000]
Рисунок Протез 1065-740 г. до н.э.[ Nerlich A.G., 2000]

Начало развития биоматериалов связано, прежде всего, сих использованием в кровеносно-сосудистой системе для закрытия поврежденных сосудов и остановки кровотечения. Природные и синтетические нити и волокна сих пор используются для восстановления раневых участков. Нос древнейших времен только коллагеновые материалы, такие как кетгут нашли в наше время большое распространение в качестве рассасывающихся швов, хотя множество других материалов было

10 опробовано за столь долгое время. Sushruta, индийский хирург, описывал рассасывающиеся швы, полученные из животных жил в 600 до н.э. В 1759 году хирург из Ньюкасла в Англии Ричард Ламберт писало своем предложении коллеге Самюэлю Хэллоуэллу о способе закрытия сосудов
Хэллоуэлл выполнил процедуру успешно, используя деревянный штифт и лигатуру для репарации плечевой артерии. В х годах для этих целей также использовались зажимы из слоновой кости и нити из шелка. Первый рассасывающиеся синтетический материал, поли (гликолевая кислота, был разработан американской компанией Cyanamid в е годы этот материал по-прежнему используется в качестве шовного и для изготовления матриксов для тканевой инженерии. Полимеры используются в качестве биоматериалов в стоматологии более 100 лет. Вулканизированный каучук впервые был применен в 1854, а в 1868 году был использован целлулоид (пластик из нитроцеллюлозы, а полиметилметакрилат) используется с 1930 года как материал для зубных протезов, пломб и пр. Многие новые полимеры появились в х годах, в том числе полиамид, сложные полиэфиры, и полиэтилен. В 1947 году первым имплантированным синтетическим полимерным биоматериалом был, по- видимому, полиметилметакрилат, который был использован в качестве протеза тазобедренного сустава. Полиэтилен и другие полимеры были использованы в качестве имплантатов в среднем ухе вначале х годов, показывая хорошие начальные результаты, но местное воспаление ограничило их использование. Также полимерные материалы применяли для изготовления катетеров.
Fritz
Bleichroeder стал первым человеком, выполнившим катетеризацию - он вставил катетер в собственную бедренную артерию
[Hamilton E.,2009]. Молодым врачом совершим первую катетеризацию сердца в 1929 году был Вернер Форсманн, который будучи летним студентом - урологом, ввёл уретральный катетер через локтевую вену в сердце. Сообщается, что с этим катетером Форсманн поднялся по лестнице в

11 рентгеновский кабинет, где он документально запечатлел этот эксперимент, который, в конечном счете, принёс ему Нобелевскую премию [Altman L. K.,
1987]. Хотя, биоматериалы, прежде всего, используются для изготовления предметов медицинского назначения, они также применяются, например, в молекулярной биологии при создании биочипов [ Park J. K., 2002] или в ветеринарии, для контроля рождаемости крупного рогатого скота [Rathbone
M. J.,1998]. В медицинских целях биоматериалы редко используются обособленно и чаще интегрированы в какие-либо медицинские устройства или имплантаты. На благоприятное поведение имплантируемого устройства влияют как материал, из которого оно сделано, таки конструкция самого устройства. Кроме того, биоматериал всегда должен рассматриваться в виде окончательно сфабрикованной, стерилизованной формы. Например, когда имплантат сердечного клапана из полиуретанового эластомера отливается из раствора, он может вызвать иную реакцию организма, чем когда он же изготавливается методом литья под давлением [Akutsu T., 1959]. Определение понятия "биоматериал", данное около 30 лет назад, но до сих пор применяемое экспертами в данной области звучит как
Биоматериал - это нежизнеспособный материал, используемый в
медицинском
изделии,
предназначенный
для
взаимодействия
с
биологическими системами [Williams D. F., 1999].
Если убрать слово "медицинское, это определение охватывает более широкий спектр применения, описанный выше. Если убрать слово "нежизнеспособный, определение начинает нести еще более общий характер и может включать также многие тканеинженерные и гибридные конструкции, где используются живые клетки.

12 Область науки, занимающаяся изучением биоматериалов, включает их физические и биологические исследования, а также взаимодействие с окружающей средой. В настоящее время наиболее интенсивное развитие получают такие направления исследования биоматериалов как синтез, оптимизация их качеств, тестирование и исследования их взаимодействия с живым организмом. Большинство биоматериалов вызывают стандартную неспецифичную биологическую реакцию. Значительное количество текущих исследований направлены на оптимизацию поверхности биоматериалов, для более быстрого и точного взаимодействия с белками и клетками, в зависимости от предназначения того или иного материала. Важным определением, необходимым для более полного понимания цели (особенности и применения) науки о биоматериалах, является понятие "биосовместимость."
Биологическая
совместимость-
способность
материала
при
конкретном применении выполнять свои функции, вызывая при этом
адекватный ответ со стороны живого организма [Williams D. F.,1999].
Под" адекватным ответом "понимают отсутствие нарушений в процессе свертывания крови, отсутствие бактериальной контаминации, и нормальное заживление без осложнений. Примерами конкретных изделий могут служить мембрана для гемодиализа, мочевой катетер, протез тазобедренного сустава. Это общее понятие биосовместимости был расширено в контексте "тканевой инженерии" в которой in-vitro и in-vivo патофизиологические процессы сопряжены с тщательным отбором клеток, материалов и подбором метаболических и биомеханических условий для восстановления функций тканей.

13 Таким образом, этими определениями и рассуждениями мы вводим параметры, которые отграничивают семейство биоматериалов от большинства материалов в материаловедении.
В таблице 1 представлены некоторые биоматериалы и области их применения. Применение Материал
Опорно-двигательная система восстановление суставов тазобедренный, коленный) костная пластика при переломах костный цемент восстановление кости искусственные сухожилия и связки дентальный имплантат для зубной фиксации
Сердечно-сосудистая система протезирование сосудов сердечные клапаны катетеры Внутренние органы искусственное сердце восстановление кожи
- искусственная почка аппарат искусственного кровообращения Органы чувств восстановление ушной улитки искусственный хрусталик
- контактные линзы бандаж для роговицы Титан, сплав Ti–Al–V, нержавеющая сталь, полиэтилен Нержавеющая сталь, сплав Co-Cr Полиметилметакрилат
Гидроксиаппатит Тефлон, дакрон Титан, алюминий, фосфат кальция
Дакрон, тефлон, полиуретан Обработанная нативная ткань, нержавеющая сталь, карбон Тефлон, полиуретан, силоксановый каучук Полиуретан
Силикон-коллагеновые композиты Целлюлоза, полиакрилонитрил
Силоксановый каучук Платиновый электрод Полиметилметакрилат, силоксановый каучук, гидрогель
Силиконакрилат, гидрогель Коллаген, гидрогель

Таблица 1. Некоторые биоматериалы и области их применения.
Биоматериалы можно разделить на четыре основных класса полимерные материалы, металлы, керамика (включая углеволокно, стеклокерамику истекло) и натуральные материалы (растительного и животного происхождения. Иногда два различных класса материалов объединяются в композиционный материал, например, кремниевая резина или углеродное волокно, армированное полимолочной кислотой. Такие композиты составляют пятый класс биоматериалов.

14 Со времен окончания второй мировой войны до началах годов относительно небольшое число хирургов использовали коммерчески доступные полимеры и металлы для изготовления из них имплантатов и компонентов медицинских изделий, а также применяли их в клинической практике. Некоторые из этих изделий имели успех, но также имели место и довольно серьезные неудачи. Это подтолкнуло хирургов обратиться за содействием к ученым – физикам, биологам, материаловедами инженерами так произошло образование новой междисциплинарной области биоинженерия. Ученые не только осознавали необходимость контролировать состав, чистоту, и физические свойства материалов, которые они использовали, но они также признавали необходимость разработки новых материалов с новыми свойствами. Это стимулировало получение и исследование многих новых материалов в х годах. Новые материалы разрабатывались специально для медицинского применения, например, биоразлагаемые полимеры и биологически активная керамика. Некоторые из них были получены из существующих материалов с использованием новых технологий, например, полиэфирные волокна в виде трубочек для использования в качестве сосудистых трансплантатов, или ацетат целлюлозы из которого изготавливают пучки полых волокон для использования в искусственной почке. Некоторые материалы были "заимствованы" из неожиданных источников, например, пиролитический углерод или сплавы титана, которые используются в авиационной и космической технике. Такие материалы подверглись некоторым изменениям, чтобы обеспечить особые биологические свойства, такие как, например, отсутствие эффекта повышения свертываемости крови при контакте. Последнее время в области науки о биоматериалах повышается интерес к использованию естественных тканей и полимеров в комбинации с живыми клетками. Это особенно заметно в области тканевой инженерии, которая фокусируется на репарации или восстановлении тканей и органов.

15

1.1.2. Металлы
Металлические материалы – это неорганические вещества, которые редко используются в виде чистого элемента, а смешиваются с другими элементами и образуют сплав. Это, как правило, сочетания металлических элементов (железа, титана, алюминия, золота, которые могут также содержать небольшие количества неметаллических элементов (углерода, азота и кислорода. В ортопедии широко используются три следующих класса металлов нержавеющая сталь, сплавы кобальта-хрома (Co–Cr) и титановые сплавы Таблица 2) Нержавеющая сталь 316L устойчива к коррозии в богатых солью жидкостях организма благодаря высокому содержанию хрома (17–
20% повесу) и низкому содержанию углерода (менее 0,03%). Добавление молибдена (Mo) к сплаву улучшает устойчивость к питтинговой коррозии ведущей к образованию язв, полостей в металле, начинающихся сего поверхности никель добавляется для стабилизации аустенитической фазы железа при комнатной температуре и для усиления устойчивости к коррозии. Механические свойства 316L в значительной степени зависят от отжига или холодной обработки. Холоднообработанный (кованый) металл значительно прочнее. Хотя существуют менее дорогие металлы нержавеющие стали, как правило, используются для временных имплантатов из-за чувствительности к локальной коррозии, где происходят концентрации напряжений и кислородное истощение, как это имеет место под винтами пластины, используемой для фиксации перелома. В ортопедии используются два типа кобальтохромовых сплавов один сплав для изготовления продукции посредством литья (Co–Cr–Mo: F75) и другой – кованых устройств (Co–Cr–W–Ni: F90) [Hench L.,2007]. Материал Свойства Применение Нержавеющая сталь Низкая стоимость изготовления Хирургическая проволока, шпилька, пластина, винты, интрамедуллярные гвозди

16 Сплавы кобальта- хрома Высокая стоимость, высокая плотность и модуль, трудны для изготовления Хирургическая проволока, интрамедуллярные гвозди Сплавы титана Высокая стоимость, низкая плотность и модуль, хорошая костная интеграция Хирургическая проволока, шпилька, пластина, винты, интрамедуллярные гвозди
Таблица Основные металлические биоматериалы, используемые в тканевой инженерии.
Металлические биоматериалы широко используются в качестве имплантатов, подвергающихся сильной нагрузке и устройств для внутренней фиксации из-за их отличной механической прочности и устойчивости, например, ортопедические, стоматологические имплантаты, и даже сосудистые и внесосудистые стенты.Несмотря на прогресс в исследовании и разработке металлических имплантатов с хорошей весовой нагрузкой, фиксация имплантатов в живом организме остается проблемой. Несоответствие между модулем упругости материала имплантата и кости, а также низкая биологическая активность материала, часто приводит к плохому контакту поверхностей между имплантатом и биологическими тканями [Jung H. D., 2015].

Каталог: res -> Dissertation
res -> Резолюция IV съезда токсикологов россии с международным участием
res -> Поиск «иван-чай» / 24. 10. 08 нашлось 2 млн страниц, 1200 картинок
res -> Средства физического воспитания
Dissertation -> Стимуляции системы врожденного иммунитета в условиях гипергликемии
Dissertation -> Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук