Романовская Валентина Валерьевна

Научные руководители:

заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор О.В. Макаров

доктор медицинских наук, профессор В.Н. Кузьмин

Московский Государственный медико-стоматологический университет
доктор медицинских наук, профессор М.А. Ботвин

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Ведущее учреждение:

Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Автореферат разослан «18» декабря 2008г.

доктор медицинских наук, профессор А.З. Хашукоева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Внутриутробная инфекция (ВУИ) является важной и нерешенной проблемой акушерства и перинатологии [Серов В.Н. и др., 2002; Володин Н.Н., 2002; Кулаков В.И. и др. 2004]. ВУИ развивается у 27,4 - 36,6% детей, рожденных живыми, а в структуре смертности новорожденных инфекционная патология занимает ведущее положение, обусловливая от 11% до 45% потерь [Гриноу А. и др., 2002; Безнощенко Г.Б. и др., 2003; Goldenberg R.L. et al, 2003]. ВУИ является причиной широкого спектра патологии: невынашивания беременности, плацентарной недостаточности, инфекционных заболеваний плода, хронической гипоксии, мертворождений, пороков развития плода, синдрома задержки роста плода. Увеличение частоты данной патологии среди заболеваний новорожденных обусловлено увеличением количества женщин фертильного возраста с наличием той или иной урогенитальной инфекции [Кулаков В.И. и др., 2004].

Сложности антенатальной диагностики ВУИ связаны с полиэтиологичностью патологии, отсутствием четкой взаимосвязи между выраженностью клинических проявлений у матери и степенью поражения плода, многофакторным влиянием инфекционного агента на плод. Из-за неспецифичности клинических проявлений ВУИ диагностика ее во время беременности затруднена и возможна лишь при сочетанном использовании клинических и лабораторно – инструментальных методов исследования [Сидорова И.С., 2000; Кан Н.Е., 2005].

В возникновении ВУИ важную роль играют ограниченные возможности иммунной системы беременной к своевременному распознаванию и уничтожению этиологического агента инфекции. Иммунологическая защита против различных патогенов осуществляется в результате скоординированной работы врожденной и адаптивной систем иммунитета [Сухих Г.Т, Ванько Л.В., 2003; Moffett A. et al., 2004]. Нарушение взаимодействия в гисто-иммунологических эпителиальных и плацентарных барьерах с различными инфекционными агентами сопровождается развитием инфекционного процесса у плода.

В последние годы появляются первые работы о роли механизмов врожденного иммунитета в репродуктивной функции человека [Gurelia I., 2000; Wira C.R., 2004; Schafer T.M., 2004; Romero R., 2005; Fazelil A., 2005]. Важное значение в развитии ряда патологических процессов, в том числе воспаления, имеют распознающие рецепторы врожденной иммунной системы: Toll-подобные рецепторы (TLRs) [Ковальчук Л.В. и др., 2005; Ганковская Л.В. и др., 2007; Мedzhitov R., Janeway JrC. A., 2000; Young S.L. et al, 2004]. Они обеспечивают интегрирующую и регулирующую роль в активации и реализации врожденного иммунного ответа на микробные патогены. TLRs, распознавая консервативные молекулярные образцы различных патогенов, включая вирусы, бактерии, грибы, увеличивают локальный синтез цитокинов, простагландинов, хемокинов и противомикробных пептидов, что запускает механизм реализации воспалительного ответа [Zhang D. et al, 2004; Abrahams V.M. et al, 2005]. Первым TLR, идентифицированным у человека, был TLR4. Этот рецептор распознает ЛПС клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Наиболее широким спектром специфичности из всех идентифицированных TLRs обладает TLR2. TLR2 связывается с липопротеинами грамположительных и грамотрицательных бактерий, пептидогликаном и липотейхоевой кислотой грамположительных бактерий, грибковым зимозаном.

Экспрессия TLRs доказана в эпителии эндометрия и цервикального канала [Shaefer T.M. et al, 2004; Young S.L. et al, 2004]. Под влиянием различных микроорганизмов, инфицирующих эпителий цервикального канала, TLRs увеличивают локальный синтез провоспалительных цитокинов. Плацентарная ткань при нормальной доношенной беременности также экспрессирует ТLRs 1-10 на уровне генов [Abrahams V.M., Mor G., 2005]. Определенные внутриутробные инфекции во время беременности оказывают как прямое, так и непрямое влияние на выживание клеток трофобласта, что зависит от активации различных TLR.

В связи с этим особый интерес представляет изучение TLRs, как маркеров прогнозирования осложнений беременности.

Таким образом, в проблеме ВУИ вопросы ее диагностики и прогнозирования являются наиболее актуальными в настоящее время. Имеются основания предполагать, что применение современных технологий для выявления доклинических признаков ВУИ может обеспечить раннюю диагностику данной патологии и возможность новых подходов к разработке комплексных мер профилактики и лечения.

Оценить прогностическую значимость комплексного исследования уровня экспрессии генов Тoll-подобного рецептора 2, Тoll-подобного рецептора 4 и противомикробного пептида HBD1 эпителием слизистой цервикального канала, клетками плаценты, мононуклеарными клетками крови при внутриутробной инфекции.

Задачи исследования

1. 
   Провести комплексное клинико-лабораторное обследование беременных с урогенитальной инфекцией для выявления группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции.
   
2. 
   Исследовать уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 у здоровых беременных в эпителиальных клетках цервикального канала, мононуклеарных клетках периферической крови и клетках плаценты.
   
3. 
   Исследовать уровень экспрессии генов TLR2, TLR4 у беременных группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции в эпителиальных клетках цервикального канала, мононуклеарных клетках периферической крови и клетках плаценты.
   
4. 
   Оценить уровень экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 у здоровых беременных и беременных группы высокого риска реализации внутриутробной инфекции.
   
5. 
   Определить роль параметров врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и HBD1, как возможных маркеров невынашивания беременности и реализации внутриутробной инфекции.
   

Научная новизна

Впервые в России проведена оценка экспрессии генов, распознающих рецепторов врожденного иммунитета (TLRs) и противомикробного пептида (HBD1) на системном и локальном уровнях при невынашивании беременности инфекционного генеза и внутриутробной инфекции.

Проведен анализ клинических проявлений ВУИ новорожденных и показана корреляция между повышением экспрессии гена TLR2 и снижением экспрессии противомикробного пептида HBD1 клетками плаценты и эпителиальными клетками цервикального канала при реализации ВУИ, что говорит о дисбалансе в системе врожденного иммунитета.

Полученные данные об изменении экспрессии генов TLRs у беременных с урогенитальной инфекцией помогли расширить представление о роли механизмов врожденного иммунитета в патогенезе невынашивания беременности.

Современные методы изучения компонентов врожденного иммунитета во время беременности открывают новые возможности в лечении и профилактике осложнений.

Получен патент на изобретение №2334233 «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции».
Практическая значимость

Изучение социально – возрастного состава, а также соматического, и гинекологического статуса беременных позволяет определить факторы риска для развития ВУИ плода у женщин в период беременности. Формирование групп повышенного риска среди женщин во время беременности способствует своевременной диагностике и проведению профилактического лечения ВУИ плода на ранних стадиях его развития. Определение факторов риска развития ВУИ позволяет выделить когорту беременных для проведения динамического клинико-лабораторного контроля за состоянием будущей матери и плода с применением современных технологий.

Диагностика нарушений врожденного иммунитета дает возможность своевременно прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммунокорригирующей терапии у новорожденных.

Выявленные изменения в экспрессии гена TLR2, проявляющиеся в ее увеличении и, напротив, снижении экспрессии противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала могут быть рекомендованы в качестве маркеров ВУИ.

Результаты работы внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов кафедр акушерства и гинекологии, иммунологии Российского государственного медицинского университета.

Применение исследования экспрессии генa TLR2 эпителиальными клетками у беременных подтверждено патентом на изобретение «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции» № 2334233 20.09.2008г.
Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, содержащего ___ отечественных и ___ зарубежных источников. Работа выполнена на ___ страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами и диаграммами.

Апробация диссертации состоялась на объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры акушерства и гинекологии Российского государственного медицинского университета, сотрудников городской клинической больницы №55, городской клинической больницы №8 и медицинско-санитарной части №33 17 июня 2008 года.

Материалы диссертационной работы доложены на VI съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии, Москва, Россия, 11-13 сентября 2006г.; Х Всероссийском научном форуме 28 мая – 2 июня 2006г., «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»; V конференции иммунологов Урала, Оренбург, октябрь 2006г.; II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, 2007г.; конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и гинекологии», Москва, 20 апреля 2007г.; II Ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины памяти академика РАМН В.А.Таболина «Новые технологии в перинатологии», Москва, 1-2 октября 2007 г.
Публикации

По теме диссертации опубликовано 27 печатных работ, из них 4 статьи в центральной печати.

Положения, выносимые на защиту

1. 
   Наличие урогенитальной инфекции (УГИ) у беременной является фактором риска развития акушерских осложнений во время беременности и родов, выраженность которых зависит от вида инфекционного агента, фазы и длительности инфекционного процесса, активности врожденного иммунитета.
   
2. 
   Исследование компонентов врожденного иммунитета TLR2, TLR4 и HBD1 на локальном уровне (эпителиальные клетки цервикального канала и клетки плаценты) имеет важное значение в прогнозировании исходов беременности.
   
3. 
   Маркером реализации ВУИ является достоверное увеличение экспрессии гена TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала и клетках плаценты по сравнению со здоровыми беременными.
   
4. 
   При беременности и наличии урогенитальной инфекции маркером невынашивания беременности является дисбаланс компонентов врожденного иммунитета: повышение экспрессии генов TLR2 и снижение экспрессии гена противомикробного пептида HBD1 эпителиальными клетками цервикального канала и клетками плаценты.
   

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование проводили на клинической базе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ (заведующий кафедрой профессор, д.м.н., заслуженный врач РФ О.В. Макаров) в родильном отделении городской больницы №8 ДЗ г.Москвы (главный врач А.Б. Дуленков) совместно с кафедрой иммунологии РГМУ (заведующий кафедрой академик РАЕН, профессор, д.м.н., Л.В. Ковальчук). Проведено клинико-лабораторное обследование 120 пациенток во время беременности и родов, а также их новорожденных в раннем неонатальном периоде. Основную группу составили 65 женщин с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась преждевременными родами. Часть из них поступала с дородовым излитием околоплодных вод. Данные больные представляли собой группу риска по реализации внутриутробной инфекции. Пациентки основной группы были разделены на две подгруппы для изучения с одной стороны, роли факторов врожденного иммунитета в патогенезе поздних прерываний беременности и преждевременных родов, с другой - в реализации внутриутробной инфекции. Недоношенные дети от 20 матерей 1а подгруппы имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции. 1б подгруппу составили 45 женщин, у их недоношенных новорожденных отсутствовали клинические признаки внутриутробной инфекции. Больные обеих подгрупп не получали иммуносупрессивную и антибактериальную терапию в качестве подготовки к беременности, в том числе и при первом исследовании эпителия цервикального канала и крови. Группу сравнения составили 25 беременных с УГИ, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации ВУИ в группе сравнения не было. Контрольную группу составили 30 женщин с физиологически протекающей беременностью, которая завершилась своевременными родами. У всех женщин контрольной группы была исключена УГИ. Критериями отбора в основную группу являлись: срок беременности 26-36 недель, невынашивание беременности инфекционного генеза, исключение генетических, анатомических и гормональных причин невынашивания беременности; отсутствие системных аутоиммунных заболеваний и гестоза; исключение оперативного родоразрешения; данная беременность у всех пациенток наступила без стимуляции овуляции.

В исследуемых группах изучали: данные анамнеза, течение настоящей беременности по триместрам, особенности родового акта, оценивали состояние новорожденных. Микробиологические методы исследования включали исследование отделяемого цервикального канала на следующие группы микроорганизмов: аэробы, факультативные анаэробы, облигатные анаэробы, дрожжевые грибы. Видовая идентификация условно-патогенных микроорганизмов проводилась по общепринятым методикам, в соответствии с номенклатурой Берги. У всех выделенных культур определяли чувствительность к 10 антибиотикам диско-диффузионным методом. Вирусологические методы исследования - выявление ДНК HSVII, CMV, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum в соскобах эпителиальных клеток цервикального канала проводили методом полимеразной цепной реакции. Исследование системы гемостаза: проводили тромбоэластографическое исследование крови на тромбоэластографе фирмы Hellige (Германия). Агрегацию тромбоцитов определяли по методу J.U.Born, концентрацию фибриногена по методу Рутберг, продукты деградации фибрина и фибриногена с помощью полуколичественного латекс-теста, растворимые комплексы мономеров фибрина (РКМФ) с помощью протаминсульфатного теста по S. Niewiarowski, и этанолового теста по V. Gurevich H.I. Godal, U. Abilgaard. Гормональное исследование: 17-гидроксипрогестерона и гормонов щитовидной железы: тиреотропного гормона, свободного тироксина, свободного трийодтиронина осуществляли методом ИФА наборами фирмы DRG (США). Ультразвуковое исследование проводили при помощи аппарата Aloкa 4000 (Япония) с использованием трансабдоминальных и эндовагинальных датчиков. Допплерометрическое исследование кровотока в сосудах плода, плаценты и пуповины осуществляли при помощи ультразвуковых приборов Aloкa 4000 с доплеровской приставкой (Япония). Кардиотокографию проводили с 30 недель беременности при помощи кардиотокографа Corometrics 170 Series фирмы Н (Индия).

Патоморфологическое исследование плацент проводили в патологоанатомическом отделении Морозовской детской городской клинической больницы №1. Макроскопически изучали особенности последа, у плодовых оболочек определяли нарушения целостности, цвет, вид поверхности. Микроскопическое исследование плаценты проводили по определенной схеме с изучением морфологической картины хориальной пластинки, ворсинчатого хориона, состояния межворсинчатого пространства и базальной мембраны.

Иммунологические исследования были проведены на кафедре иммунологии РГМУ и в лаборатории диагностики вирусных инфекций ГУ «НИИ вирусных препаратов им. О.Г.Анджапаридзе РАМН» со с.н.с., к.м.н. Ганковской О.А. К иммунологическим и молекулярно-генетическим методам исследования относились методы определения уровня экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD1 в различных биологических средах: клетками слизистой цервикального канала и плаценты, мононуклеарными клетками крови. Для изучения экспрессии генов были использованы следующие методы: выделение общей РНК, реакция обратной транскрипции и полимеразная реакция в реальном времени. Клинические образцы (клетки слизистой цервикального канала, гомогенизат плаценты, мононуклеарные клетки) подвергали лизису и из лизата выделяли РНК. Олигонуклеотиды, используемые в качестве праймеров для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, были моделированы с помощью программы VectorNTI 8,0.

Результаты и их обсуждение

Как указывалось выше, в данное исследование было включено 120 пациенток. В основную группу входили женщины с наличием УГИ и невынашиванием беременности инфекционного генеза (в 1а подгруппе - недоношенные дети имели разнообразные локальные и системные проявления внутриутробной инфекции; в 1б подгруппе - клинические признаки внутриутробной инфекции отсутствовали). Группу сравнения составили пациентки с УГИ, беременность которых закончилась своевременными родами, реализации внутриутробной инфекции не было (3). Контрольную группу составили здоровые женщины с физиологически протекающей беременностью, которая завершилась своевременными родами (2). Средний возраст в исследуемых группах составил 25,7±0,26 лет, с индивидуальными колебаниями от 19 до 42 лет. При клиническом анализе было выяснено, что пациентки I, II, III групп достоверно не отличались по возрасту, наследственности, характеру менструальной функции.

Большинство пациенток 1-ой группы вступило в беременность с отягощенным инфекционным и соматическим анамнезом. При изучении данных инфекционного анамнеза было выявлено, что 64,6% пациенток 1-ой группы ранее перенесли детские инфекции, 57% женщин - ОРВИ. Во 2-ой группе их количество было меньшим (30% и 20% соответственно). Большая часть женщин 1-ой группы вступило в беременность с наличием отягощенного гинекологического анамнеза. У 29,4% пациенток 1-ой группы в анамнезе имели место медицинские аборты и самопроизвольные выкидыши.

В структуре гинекологической патологии обеих групп превалировали заболевания воспалительного генеза. Наиболее частыми заболеваниями в структуре гинекологической патологии являлись воспалительные заболевания матки и придатков, а также различная патология шейки матки.

В структуре бактериальной инфекции у пациенток 1-ой группы наиболее часто во время беременности выявлялись: Ureaplasma urealyticum (29,2%) и Chlamydia trachomatis. На втором месте по частоте встречаемости – Candida 27,7%. На третьем месте – вирусная инфекция: HSVII в 16,9%, CMV 13,9% (рис.1). Данные лабораторного обследования подтвердили инфекционный генез невынашивания у беременных основной группы.