Особенности окислительного стресса, ассоциированного с изменением содержания катехоламинов и серотонина у вич-инфицированных лиц с алкогольным делирием 03. 01. 04 биохимия

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Цейликман Ольга Борисовна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится 26 декабря 2013 г. в 13⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория № 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского по адресу 420008, ул. Кремлевская, д.35.

Автореферат разослан «____» ____________ 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

З.И.Абрамова

Тяжесть алкогольного делирия во многом определяется степенью активации симпатоадреналовой системы, а ослабление симптоматики у пациентов коррелирует с нормализацией содержания катехоламинов в биологических жидкостях (Анохина И. П. Клиника, диагностика и лечение основных нервных и психических заболеваний. Тбилиси, 1987. 590 с.). В свою очередь катехоламины активно включаются в свободно-радикальные реакции, их интенсивное аутоокисление приводит к дополнительной генерации радикальных продуктов и может усугублять повреждения органов и тканей. (Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. С-Пт.: Медицинская пресса. 2006. 400 с.). Кроме того, индуктором окислительного стресса, особенно в головном мозге, является пероксид водорода, продуцируемый при утилизации биогенных аминов моноаминоксидазами (Коган Б.М., Дроздов А.З. Системная психология и социология. М: Ин-Кварто, 2010. Т. №1. 149 с.). У больных алкоголизмом в качестве маркера активности моноаминоксидаз в ЦНС рассматривают МАО-Б тромбоцитов (Harro J., Oreland L. Depression as a spreading adjustment disorder of monoaminergic neurons: a case for primary implications of the locus coeruleus. Brain Res. Rev. 2001. № 38. Р. 79-­128). Следует отметить, что данные об активности тромбоцитарной МАО-Б при развившемся алкогольном делирии противоречивы (Галанкин Л.Н. и соавт. Алкогольный делириозный шок. С-Пт, 2004. 215 с.), однако известно, что наиболее значимыми эндогенными регуляторами активности моноаминоксидаз являются кортизол и компоненты трибулина (Таганович А.Д. и соав. Патологическая биохимия. М: Бином, 2013. 447 с. ; Медведев А.Е. Трибулин – эндогенный ингибитор моноаминоксидаз. Вопр. мед. хим. 1996. Т.42, № 2. С. 92-103; Chen K. Transcription factor E2F-associated phosphoprotein (EAPP), RAM2/CDCA7L/JPO2 (R1), and simian virus 40 promoter factor 1 (Sp1) cooperatively regulate glucocorticoid activation of monoamine oxidase B. Molecular pharmacology. 2011. Т. 79, №. 2. Р. 308-317; Slotkin TA. Effects of aging and glucocorticoidtreatment on monoamine oxidase subtypes in rat cerebral cortex: therapeutic implications. Brain Res. Bull. 1998. Vol. 47. P. 345–348).

В последние годы интенсивно проводятся исследования влияния алкоголизма и окислительного стресса на течение ВИЧ-инфекции. Однако до сих пор мало изучены особенности свободно-радикального окисления у ВИЧ-инфицированных пациентов находящихся в тяжелом состоянии алкогольного делирия.

Цель исследования

Установить особенности свободнорадикального окисления при дисфункции симпатоадреналовой системы и провести клинико-лабораторную оценку функционального состояния печени у ВИЧ-инфицированных лиц с алкогольным делирием.

1. 
   Определить направленность изменений содержания молекулярных продуктов ПОЛ в плазме крови у ВИЧ-инфицированных пациентов при развитии алкогольного делирия.
   
2. 
   Изучить изменения показателей окислительной модификации белка в плазме крови у носителей ВИЧ в условиях алкогольного делирия.
   
3. 
   Оценить степень активации симпатоадреналовой системы и уровень серотонина крови при алкогольном делирии у ВИЧ-инфицированных пациентов.
   
4. 
   Определить активность МАО-Б тромбоцитов и уровень церулоплазмина крови у носителей ВИЧ с алкогольным делирием.
   
5. 
   Исследовать изменения показателей эндогенной регуляции активности МАО (кортизола и трибулина) у ВИЧ-инфицированных больных с алкогольным делирием.
   
6. 
   Изучить активность сывороточных ферментов АсАТ, АлАТ, ГГТ, ЩФ и показатели тимоловой пробы для оценки функционального состояния печени у носителей ВИЧ в сравнении с неинфицированными больными при алкогольном делирии.
   

В исследовании впервые комплексно изучены свободно-радикальные процессы, протекающие на фоне дисфункции симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной систем у ВИЧ-инфицированных пациентов, находящихся в состоянии алкогольного делирия.

Впервые изучена модификация показателей свободнорадикального окисления в плазме/сыворотке крови у ВИЧ-инфицированных пациентов при алкогольном делирии. Относительно зараженных ВИЧ, не злоупотребляющих алкоголем, установленные изменения характеризуются:

• 
  увеличением уровня ПОЛ (диеновые конъюгаты – на 10,0%, вторичные продукты – на 18,7%);
  
• 
  увеличением содержания оснований Шиффа (на 620,0%);
  
• 
  снижением уровня вторичных продуктов ПОЛ (на 15,2%) при интегральной оценке окисляемости полярных липидов и эффективности антиоксидантных систем методом инициации ПОЛ в системе Fe²⁺/аскорбат;
  
• 
  снижением уровня альдегидных продуктов ОМБ (на 71,2%);
  
• 
  увеличением содержания токсичных кетоновых производных ОМБ (основные- на 42,0%, нейтральные – 26,7%) и битирозина (31,5%).
  

Методом корреляционного анализа (Spearman's и Kendall tau rank correlation coefficient) установлено модулирующее влияние катехоламинов на свободнорадикальные процессы в плазме крови у ВИЧ-инфицированных пациентов, находящихся в состоянии алкогольного делирия. Обнаружено ограничивающее влияние адреналина и норадреналина на реакции перекисного окисления липидов и эффект катехоламинов (адреналина, норадреналина и дофамина) связанный с усилением процессов окислительной модификации белков.

У ВИЧ-инфицированных больных с алкогольным делирием впервые установлена высокая активность прооксидантного фермента - МАО-Б тромбоцитов, которая в 3,2 раза превышает показатели у не инфицированных пациентов. Уточнен один из механизмов высокой активности моноаминоксидаз, а именно: активность фермента сопряжена с критическим снижением уровня кортизола и активности трибулина мочи.

В ходе исследования впервые выявлено изменение эндокринного статуса ВИЧ-инфицированных пациентов. Это проявляется развитием у зараженных ВИЧ опасного состояния – гипокортизолемии, при возникновении алкогольного делирия. В то же время в крови у серопозитивных лиц без аддикции выявлена гиперкортизолемия, согласующаяся с обозначенными в литературе фактами (Kumar S., et al. Alcohol consumption effect onantiretroviral therapy and HIV-1pathogenesis: role of cytochrome P₄₅₀ isozyme. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2012. Vol. 8, № 11. P. 1363-1375.)

Установлено компенсаторное увеличение (до значений сопоставимых с контролем) уровня церулоплазмина в сыворотке крови у ВИЧ-инфицированных пациентов с алкогольным делирием, что связано с ограничением содержания альдегидных продуктов ОМБ в плазме крови.

Установлено, что развитие алкогольного делирия у ВИЧ-инфицированных пациентов ассоциировано с нарастанием гиперферментемии. Относительно неинфицированных больных показатели АсАТ дополнительно увеличиваются на 91%, АлАт – на 8%. Рост активности аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ) и ɣ-глутамил транспептидазы (ГГТ) сопряжен с увеличением содержания шиффовых оснований и кетоновых производных ОМБ в плазме крови.

Полученные данные необходимы для разработки новых подходов в лечении алкогольного делирия с учетом коморбидной ВИЧ-инфекции. Это связано с оптимизацией терапевтических мер, повышением эффективности лечения и снижением риска инвалидизации ВИЧ-инфицированных пациентов. Полученные данные полезны в теории и практики клинической биохимии, расширяют теоретическую базу знаний биохимии человека.

Результаты диссертационной работы могут быть использованы для дальнейших исследований по изучению влияний развившегося психоза на патогенез ВИЧ-инфекции. Результаты работы применимы в областях: «Профилактика и борьба с ВИЧ/СПИД», «Наркология».

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14.B37.21.0578  от 10.08.2012.

Методология и методы исследования

Проведено обследование 155 человек: 124 пациентов отделения неотложной наркологической помощи Челябинской областной наркологической больницы, 20 пациентов «Городского центра по профилактике и борьбе со СПИД» , 11 - условно здоровых лиц. Результаты биохимических исследований сопоставлены по четырем группам:

• 
  «Алкогольный делирий (АД)» - включено 99 пациентов больных алкоголизмом II-III стадии с явлениями алкогольного делирия;
  
• 
  «Алкогольный делирий на фоне ВИЧ-инфекции (АД+ВИЧ)» - 25 больных алкоголизмом II-III стадии с явлениями алкогольного делирия и подтвержденным диагнозом ВИЧ-инфицирования (диагноз подтвержден методом иммуноблотинга (Western Blot);
  
• 
  «ВИЧ»- включено 20 ВИЧ-инфицированных пациентов без аддикции (не злоупотребляющих алкоголем и другими психотропными веществами);
  
• 
  «Контроль (К)» - 11 условно здоровых лиц контрольной группы не страдающих алкоголизмом.
  

Взятие крови на исследование производилось пункцией кубитальной вены с 7⁰⁰ до 9⁰⁰. Исследование одобрено этическим комитетом ГБОУ ВПО «ЮУГМУ» как соответствующее этическим нормам.

Включение пациентов в когортное исследование, поступавших в клинику в состоянии алкогольного психоза, производилось до 48 часов госпитализации после верификации диагноза: «алкоголизм IIб - IIIа стадии с явлениями алкогольного делирия». ВИЧ-инфицирование подтверждалось методом иммуноблотинга с выявлением антител не менее чем к трем антигенам.

Порционную и суточную мочу собирали с соблюдением условий преаналитического этапа исследования. Материал хранили при температуре -20^оС – -70^оС до осуществления анализа. Содержание катехоламинов определяли непосредственно после взятия биологического материала с соблюдением температурного режима и условий стабилизации.

На биохимическом анализаторе OLYMPUS AU 400 определяли содержание общего белка, активность сывороточных ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АаАТ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ).

Постановка тимоловой пробы осуществлялась согласно приказу № 290 от 11.04.1972 МЗ СРСР “Об унификации клинических лабораторных методов исследований”.

В плазме крови по методике И.А. Волчегорского и соавторов определяли содержание первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (кетодиены и сопряжённые триены) молекулярных продуктов перекисного окисления липидов (Волчегорский, И.А. Вопр. мед. химии. 1989. № 1. С. 127-131.)

Содержание конечных продуктов ПОЛ - шиффовых оснований и уровень Fe⁺² / аскорбат - индуцированного ПОЛ определяли с использованием методик Е.И.Львовской и соавторов (Львовская, Е.И. Вопр. мед. химии. 1991. № 4. С 92 -94). Для выражения содержания первичных (Е₂₃₂/Е₂₂₀), вторичных (Е₂₇₈/Е₂₂₀) и конечных продуктов (Е₄₀₀/Е₂₂₀) ПОЛ использовались условные единицы окисления (у.е.о.).

Содержание катехоламинов (адреналин, норадреналин, дофамин и ДОФА) в крови, порционной и суточной моче определяли на анализаторе биожидкостей «ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т» с предварительной адсорбцией на окиси алюминия и детектированием флуоресценции продуктов окисления при рН 4,2 и 6,2 с использованием набора светофильтров I – 410-520 нм; II – 360-520 нм; III – 360-410 нм.

Содержание серотонина оценивали флюориметрическим методом по реакции с о-фталевым диальдегидом на анализаторе биожидкостей «ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т» при длинах волн 360 и 480 нм.

Уровень церулоплазмина в сыворотке крови определяли методом Равина по окислению р-фенилендиамина. (Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М.: МЕДпресс-информ. 2009. 896 с.).

Содержание кортизола определяли на анализаторе биожидкостей «ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т» флуоресцентным модифицированным методом Балашова Ю.Г. (Балашов Ю.Г. Физиологический журнал СССР. 1987. №12. С. 268-272).

Трибулиновую активность мочи определяли по степени угнетения МАО-активности стандартизованного препарата митохондрий печени крыс. (Волчегорский И.А. Физиология человека. 1998. №4 С. 126-129)

Содержание битирозина в плазме крови оценивали по методу K.J. Davies (1987) в модификации Э.М. Бекман и соавторов (2006) с индукцией окислительной модификации белков в 1мМ растворе CuSO₄ и детекцией флуоресценции при наборе светофильтров 325/415 нм (Бекман Э.М. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т.142, № 9. С. 268-272).

Статистический анализ данных проведен с помощью пакета прикладных программ STATISTICA-8. Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). Применялись критерии непараметрической статистики : Манна-Уитни (U) и Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (rs) и Кенделлу (rk).

1. 
   Развитие алкогольного делирия сопровождается модификацией параметров окислительного стресса у ВИЧ-инфицированных лиц: увеличением уровня ПОЛ, содержания кетоновых производных ОМБ и битирозина, многократным увеличением содержания оснований Шиффа и снижением уровня альдегидных продуктов ОМБ.
   
2. 
   Носительство ВИЧ приводит к дополнительной активации симпатоадреналовой системы при алкогольном делирии, что сопровождается повышением активности тромбоцитарной МАО-Б на фоне критического снижения показателей эндогенной регуляции активности фермента - уровня кортизола и активности трибулина мочи.
   
3. 
   Алкогольный делирий ВИЧ-инфицированных лиц характеризуется более выраженными нарушениями функции печени, связанными с повышением содержания конечных продуктов ПОЛ и уровня ОМБ.
   

Степень достоверности полученных результатов подтверждается их теоретическим анализом с использованием полного и широкого списка отечественных и зарубежных литературных источников, личным участием автора в разработке модели исследования, использованием современных и традиционных биохимических методов, современного сертифицированного оборудования и сертифицированных реактивов, актом проверки первичной документации и актами внедрения результатов исследования в практику.

Автор работы самостоятельно выполнял определение содержания биогенных аминов, кортизола, молекулярных продуктов ПОЛ и ОМБ, активности МАО-Б тромбоцитов, уровня церулоплазмина, содержания битирозина, трибулиновой активности мочи. Все биохимические исследования, обзор литературы, анализ и интерпретация данных, статистическая обработка результатов выполнены при значительном участии автора.

Основные положения работы изложены на V-й Российской научно-практической конференции «Здоровье человека в ХХI веке» (Казань, 2013); IV международной научно-практической конференции молодых ученых (Челябинск, 2013); Научно-практической конференции посвященной 15-летию биологического факультета ФГБОУ ВПО «ЧелГУ» (Челябинск, 2013); IV международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2013).

По теме диссертации опубликовано 7 научных статьей, из них 4 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций.

Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка основных сокращений и терминов, списка использованной литературы. Работа содержит 4 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 218 источников, в том числе 127 – зарубежных авторов.

Результаты исследования внедрены в практику отделения неотложной наркологической помощи Челябинской областной наркологической больницы. Материалы исследования используются в лекционном курсе кафедры биохимии «Южно-Уральского медицинского университета» и кафедры биохимии «Уральского государственного университета физической культуры».
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Особенности свободно-радикального окисления у ВИЧ-инфицированных лиц с алкогольным делирием

У носителей ВИЧ, не больных алкоголизмом, выявлены следующие признаки оксидативного стресса: значительно повышено содержание альдегидных продуктов окислительной модификации белка (таблица 1). Это согласуется с литературными данными о наличии «карбонильного стресса» у инфицированных ВИЧ (Mahbub E. Sobhani. Biomolecular basis of the role of chronic psychological stress in the susceptibility of HIV infection and progression of AIDS. International Journal of Medicine and Medical Sciences, 2013. Vol. 3 (1). pp. 307-316). Снижено содержание вторичных полярных продуктов ПОЛ, а так же шиффовых оснований. Статистически значимо увеличено только содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Полученные данные в целом свидетельствуют об ограничении перекисного окисления липидов относительно контроля.

У пациентов с алкогольным делирием наблюдались сходные изменения свободно-радикального окисления: ограничение липопероксидации на фоне усиления окислительной модификации белков, что дополнительно сопровождалось приростом содержания битирозина (таблица 1).

У ВИЧ-инфицированных пациентов с алкогольным делирием наблюдалось увеличение содержание конечных продуктов липопероксидации (оснований Шиффа) до контрольных значений (таблица 1). Относительно групп «ВИЧ» и «АД» снизилось содержание альдегид-динитрофенилгидразонов, полученные значения все же превышали контрольные в два раза. Уровень металл катализируемой ОМБ выше соответствующих показателей в группах «ВИЧ» и «АД». Это может говорить об истощении резервно-адаптационных возможностей организма при алкогольном делирии у ВИЧ-инфицированных (Губский Ю.И. и др. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях: обзор литературы. Совр. пробл. токсикол. 2005. № 3. С. 20-26).

Таким образом, в трех обследованных группах («ВИЧ», «АД», «АД+ВИЧ») наблюдаются сходные изменения свободнорадикального окисления: патологическое снижение липопероксидации (ограничение липопероксидации ниже контрольного уровня) и усиление окислительной модификации белка.

Выявленные особенности свободнорадикального окисления у ВИЧ-инфицированных лиц с алкогольным делирием можно охарактеризовать:

• 
  усилением процессов ПОЛ, относительно группы «ВИЧ»;
  

• 
  увеличивается содержание первичных продуктов гептановой фазы (триацилглицериды, этерифицированный холестерин, ацильные радикалы)
  
• 
  повышается содержание вторичных продуктов изопропанольной фазы (фосфолипиды)
  
• 
  патологически «нормализуется» содержание оснований Шиффа
  

• 
  модификацией показателей ОМБ, относительно группы «ВИЧ»;
  

• 
  снижается уровень альдегид-динитрофенилгидразонов
  
• 
  увеличивается содержание токсичных кетондинитрофенил-гидразонов и битирозина
  

• 
  увеличением чувствительности белковых молекул к воздействиям радикалов (по показателям индукции ОМБ).
  

Таблица 1 - Показатели свободно-радикального окисления в крови ВИЧ -инфицированных лиц с алкогольным делирием (M±m)