Москва регенерация органов и тканей: иерархическая и стохастическая модели

ТЕЗИСЫ

Ежегодной Всероссийской и международной научной конференция

«Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении»

30-31 мая 2007

МОСКВА
Регенерация органов и тканей: иерархическая и стохастическая модели.
К.Н.Ярыгин

Российский государственный медицинский университет и

НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН,

Москва
Тканевой гомеостаз включает поддержание оптимального клеточного состава путем скоординированных во времени процессов гибели части клеток и замещения их новыми. После открытия стволовых клеток (СК) общепринятой стала иерархическая модель регенерации органов и тканей как для поддержания гомеостаза, так и при восстановлении после повреждений, согласно которой все новые клетки образуются из резидентных или циркулирующих СК через стадию прогениторных, активно размножающихся клеток. Вместе с тем, анализ регенерации печени показывает, что это не всегда так. Восстановление печени может идти за счет СК, но чаще происходит за счет дифференцированных клеток после их дедифференцировки. В последнем случае реализуется стохастическая модель регенерации, при которой образовании е новых клеток происходит не из специальных, а из любых клеток ткани.

Тканеспецифические соматические СК были первоначально обнаружены в гемопоэтической системе. Эти недифференцированные клетки способны вступать в асимметричный митоз, дающий одну клетку-реплику, идентичную материнской, и одну коммитированную клетку, дифференцирующуюся в один из типов клеток крови. Каждая резидентная гемопоэтическая СК мультипотентна, т.е. способна превращаться в любую клетку крови.

В настоящее время СК в гемопоэтической системе изучены лучше, чем другие соматические СК и могут служить моделью для того, чтобы планировать исследования других региональных СК. В костном мозге существует определенная иерархия клеток, которую можно представить в виде пирамиды. Находящиеся на вершине этой пирамиды наименее дифференцированные клетки носят названия долгосрочно и краткосрочно репопулирующих гемопоэтических СК (ГСК). Вступая на путь дифференцировки, они дают начало прогениторным клеткам-предшественницам, соответственно, всего миелоидного и всего лимфоидного ростка, из которых после серии делений и образуются все зрелые клетки крови. Прогениторные клетки, в отличие от ГСК, не способны к самовоспроизведению через асимметричный митоз. Необходимым и достаточным условием восстановления гемопоэтической системы после ее полного разрушения является просто трансплантация ГСК.

Гемопоэтическая система – это быстро обновляющаяся ткань мезодермального происхождения. Регенерация быстро обновляющихся эпителиев, таких как эпителий слизистой желудочно-кишечного тракта или эпидермис также происходит за счет резидентных СК. В этих тканях также существует иерархия клеток, подобная той, которая характерна для гемопоэтической системы.

До недавнего времени общепринятым было мнение, что регенерация печеночной паренхимы происходит за счет дифференцированных клеток, в основном гепатоцитов, при некотором участии других клеточных типов, таких как купферовские клетки, эндотелий и эпителий желчных протоков. Было, в частности, показано, что в норме и в процессе регенерации после повреждения как размножение клеток, так и их гипертрофия. Некоторые гепатоциты увеличиваются в размерах и в них происходит эндоредупликация геномной ДНК, но без митоза. Постепенно, однако, накапливаются данные, показывающие, что принекоторых видах повреждения в регенерации печени участвуют не только дифференцированные клетки, но и резидентные и циркулирующие СК. Фактически, механизм восстановления печеночной паренхимы зависит от обстоятельств, при которых оно происходит – норма, частичная гепатэктомия, отравление химическими агентами и т.п. Более того, существенно различаются пути восстановления за счет собственных ресурсов и за счет трансплантированных клеток.

У млекопитающих, в том числе у человека, может быть восстановлено до 75% утраченной ткани печени. В экспериментах на лабораторных грызунах частичная гепатэктомия достигается путем экстирпации определенных долей печени. После удаления таким способом 75% ткани печени количество клеток в органе нормализуется в течение нескольких дней, а первоначальная масса достигается за несколько недель. Классические эксперименты с мечением клеток мышей 3Н-тимидином показали, что в течение этого периода практически каждый оставшийся после операции гепатоцит претерпевает по крайней мере одно деление. Интересно, что после удаления 15% ткани печени пролиферируют лишь перипортальные гепатоциты. Вслед за гепатоцитами в митоз вступают и другие эффекторные клетки печени, которые таким образом участвуют в восстановлении массы органа. Остается неясным, почему после восстановления массы печени размножение клеток и регенерация ткани останавливаются. Есть лишь некоторые данные о том, что определенная роль в этом принадлежит трансформирующему фактору роста бета 1 (TGF-1).

Как регенерация после частичной гепатэктомии, так и поддержание массы ткани и нужного количества клеток печени в норме обеспечиваются пролиферацией дифференцированных клеток и, по всей видимости, не зависят от СК. С другой стороны, восстановление печени после отравления некоторыми химикатами СК-зависимо. В этом случае в перипортальных зонах печеночных долек появляются мелкие клетки с овальными ядрами, которые носят название «овальные клетки». Эти клетки активно размножаются, мигрируют по направлению к центральным венам и дифференцируются в гепатоциты, обеспечивая восстановление ткани. Овальные клетки происходят от недифференцированных клеток зоны канала Херинга, которые многие авторы считают печеночными СК. Сами овальные клетки рассматриваются как прогениторные, т.е. уже вступившие на путь дифференцировки. Многие соединения, индуцирующие пролиферацию овальных клеток, способны повреждать ДНК или обладают канцерогенной активностью, в связи с чем некоторые авторы рассматривают их как предраковые. Вполне вероятно, что СК-зависимая регенерация происходит в тех случаях, когда гепатоциты утрачивают способность нормально делиться. Пролиферация овальных клеток наблюдается при заболеваниях человека, связанных с хроническим поражением печени и циррозом и в соответствующих экспериментальных моделях. Человеческие овальные клетки можно идентифицировать по поверхностному маркеру OV6. Они также экспрессируют маркеры гепатоцитов (альбумин), эпителия желчных протоков (цитокератин 19 – СК-19), альфа-фетопротеин, маркер ГСК CD34. Овальные клетки крысы экспрессируют и другие маркеры ГСК, такие как фактор стволовых клеток (SCF), рецептор SCF, c-kit тирозин киназу и Thy-1. Овальные клетки мыши экспрессируют маркер ГСК Sca-1. Фенотипическое сходство овальных клеток и ГСК инспирировало гипотезу о том, что овальные клетки происходят не от резидентных печеночных СК, а от ГСК костного мозга.

Одним из самых информативных подходов при изучении биологии и функций СК и других клеток является проведение тестов на способность клеток заселять поврежденные участки ткани. Этот подход был впервые использован для доказательства существования ГСК, а позже – в других моделях. Опыты с очищенными субпопуляциями клеток костного мозга мыши позволили выявить типы клеток, обладающие наибольшим репопуляционным потенциалом. В то время как дифференцированные клетки костного мозга размножаются плохо, гепатоциты, причем не только диплоидные, но и тетраплоидные и октаплоидные, весьма активны в репуляционных тестах.

Были получены экспериментальные доказательства того, что, наряду с гепатоцитами, участвовать в репопуляции печени после массовой гибели паренхиматозных клеточных элементов могут несколько других типов клеток, в том числе фетальные гепатобласты, овальные клетки, клетки поджелудочной железы и ГСК. Фетальные гепатобласты, экспрессирующие альфа-фетопротеин и маркеры, характерные для гепатоцитов (альбумин) и холангиоцитов (СК19), обычно рассматриваются как СК фетальной печени. Они обладают высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом и, после трансплантации, способны полностью реконструировать поврежденную ткань. Овальные клетки также бипотентны и легко репопулируют печеночную ткань после повреждения. Известно, что в раннем онтогенезе гепатоциты, холангиоциты и все основные типы паренхиматозных клеток поджелудочной железы развиваются из общего эндодермального предшественника. Имеются доказательства того, что во взрослом организме в печени и в поджелудочной железе присутствуют клетки-предшественники паренхиматозных клеток обоих органов, так называемые печеночно-панкреатические СК. Это подтверждается тем, что опухоли печени, особенно холангиокарциномы, экспрессируют маркерные энзимы поджелудочной железы амилазу и липазу.

Костный мозг содержит несколько видов стволовых и прогениторных клеток, в том числе ГСК, клетки-предшественники различных клеток крови, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), так называемые мультипотентные взрослые прогениторные клетки (multipotent adult progenitor cells, MAPC) и др. В экспериментах на животных было показано, что несущие генетические маркеры клетки костного мозга после трансплантации способны дифференцироваться в гепатоциты. Более того, аутопсическое исследование пациентов, умерших через месяцы и даже годы после пересадки несовпадающего по полу костного мозга, показало присутствие в их тканях, в том числе в печени, донорских эпителиальных клеток. В настоящее время предпринимаются попытки идентифицировать типы клеток костного мозга, обладающие репопуляционной активностью в отношении печеночной ткани. Было показано, что способностью дифференцироваться в полноценные гепатоциты обладают ГСК, имеющие фенотип (c-kithighThylowLinnegSca-1+). Субпопуляция человеческих CD34+ клеток, экспрессирующих молекулу комплемента Clq (ClqR(p)), после ксенотрансплантации в организм мышей или овец также дает начало функционально активным гепатоцитам. MAPC обладают свойствами, сближающими их с эмбриональными СК, в том числе плюрипотентностью. Они дифференцируются в эпителиальные клетки печени in vitro, а при трансплантации в интактных мышей проникают в печень реципиента, хотя и в небольших количествах, и дифференцируются в гепатоциты.

Участие клеток костного мозга в поддержании гомеостаза печеночной паренхимы и ее репаративной регенерации остается предметом споров. Не вполне ясно, играют ли ГСК или другие клетки костного мозга клинически значимую роль в восстановлении печени при каком-либо заболевании человека. В настоящее время обсуждаются два альтернативных пути репопуляции печени клетками костномозгового происхождения. Во-первых, некая субпопуляция клеток костного мозга может выходить в кровоток, подвергаться хоумингу в печени и дифференцироваться в эпителиальные клетки. Эти клетки могут быть либо общими мультипотентными предшественниками гепатоцитов и клеток крови или специализированными эндодермальными прогениторными клетками. Во-вторых, печеночные клетки костномозгового происхождения могут быть результатом не дифференцировки, а слияния клеток.

Получение культур клеток из стромы костного мозга и гиалинового хряща для хондропластики.
Котельников Г.П., Волова Л.Т., Тюмина О.В., Ларцев Ю.В., Волчков С.Е., Кулагина Л.Н., Клементенко Ю.А.

ФГУ ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»

ГУЗСО «Клинический центр клеточных технологий»
Проблема регенерации гиалинового суставного хряща у пациентов с дегенеративно-деструктивным остеоартрозом является чрезвычайно острой, так как комплекс терапевтических и известных хирургических методов не позволяет достичь положительного эффекта. Использование новых достижений в биологии и медицине – клеточных технологий - является весьма перспективным и актуальным.

Разработка новых подходов и операций с использованием биологического материала для обеспечения репаративного хондрогенеза при повреждении и разрушении хрящевой ткани сустава.

Одной из главных задач данного комплексного исследования является получение культур клеток из стромы костного мозга и гиалинового суставного хряща для последующей их аутотрансплантации в зону разрушенной хрящевой ткани у экспериментальных животных.

Эксперименты выполнены на кроликах (18 животных) породы Шиншилла, весом 3 кг, обоих полов. Животные были разделенные на 2 группы. В первой (8 животных) - проводилась пункция костей конечностей и подвздошной кости с целью получения костного мозга. Во второй (10 животных) - вскрывали коленный сустав и забирали фрагменты хряща из разных участков хрящевой поверхности большеберцовой кости. Всех животных содержали в условиях вивария, эксперименты на них выполнялись под общим обезболиванием с соблюдением асептики и антисептики в ЦНИЛ СаГМУ.

Для культивирования в работе использованы среды a-MEM, DMEM или 199 (ООО “Биолот”) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Инвертированные микроскопы Carl Zeiss Аxiovert 40 c и Биолам П-2-1, гемоанализатор Реntra-60, термостаты и СО2 - инкубаторы фирмы Sanyo (Incubator MIR-262) и ламинары II класса защиты.

Клетки культивировали в стандартных условиях при температуре 37°С в пластиковых культуральных флаконах с вентилируемыми крышками Orange Scientific (производство Бельгии), Corning (производство США) площадью 25 и 75 см2.

Проводили ежедневную морфологическую оценку состояния нативной клеточной культуры в течение одного месяца. После чего культуру фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Отработана методика получения костного мозга у животных (кроликов). Аспирацию костного мозга производили с помощью 5 мл шприца. Из подвздошной кости можно получить не менее 1,5 мл костного мозга. Ядросодержащие клетки выделяли 2 методами: лизирование эритроцитов с последующей отмывкой и градиентное центрифугирование (Ficoll, ООО «Биолот»). После чего ядросодержащие клетки рассеивались на пластиковую посуду.

На третьей неделе культивирования появляются очаги фибробластоподобных клеток, которые по сравнению с дермальными фибробластами значительно крупнее, имеют короткие отростки и большое ядро. Обращает на себя внимание наличие колоний по всей поверхности культурального флакона, центральная часть которых имеет сетчатую структуру. По ее периферии обнаруживаются мелкоклеточные скопления с центрально расположенным ядром (недифференцированных хондробластов). Эти структурные образования клеток проявляют выраженные адгезивные свойства к поверхности пластика флаконов. В течение 1 месяца клетки сохраняют жизнеспособность.

Культуру хондробластов получали из гиалинового хряща по модифицированной методике первичных эксплантатов. Через 15 суток по периферии кусочка хрящевой ткани определялась сетчатая структура, затем появлялись очень мелкие круглые клетки, по форме и размерам аналогичные тем, которые определялись в культуре из костного мозга. Клетки росли в виде пласта. К 30 суткам пролиферация клеток усиливалась и значительно возрастало количество рядов крупных круглых клеток с центрально-расположенным ядром.

Использованный алгоритм культивирования клеток, источником которых является ткань гиалинового хряща позволяет получать хондроидный материал в виде пласта. В том случае, когда источником клеточных культур является костный мозг, в процессе культивирования образуются колонии фибробластоподобных клеток.

Синтетические и натуральные биоматериалы - 3D матриксы для культуры аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при замещении костных дефектов в эксперименте

Чиссов В.И.¹, Сергеева Н.С.¹, Свиридова И.К.¹, Решетов И.В.¹, Баринов См.² , Франк Г.А.¹, Тепляков В.В.¹, Кирсанова В.А.¹, Ахмедова С.А.¹, Агзамов Д.С.',Филюшин М.М.¹, Комлев B.C.², Фадеева И.В.², Козлов В.В.¹, Бухаров А.В.¹, Хесуани Ю.Д.³

¹ФГУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена Росмедтехнология»

²Институт физико-химических проблем керамических материалов РАН, ИПК РАН

³Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова
Проблема эффективного способа доставки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в очаг поражения актуальна при различных патологических состояниях: заболеваниях сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппарата, неврологических расстройствах и др. В онкологической клинике использование ММСК перспективно при реконструктивно-пластических операциях для замещения костных дефектов сложных конфигураций и различных объемов. В то же время, из анализа литературы и собственного опыта известно, что непосредственное введение культуры ММСК в очаг поражения не приводит к ожидаемому терапевтическому эффекту вследствие их быстрой элиминации. Использование нетоксичных, биосовместимых каркасных 3D структур для культуры ММСК, которые могли бы обеспечивать оптимальные условия для адгезии, экспансии иммобилизованных клеток и способствовать полной интеграции имплантата с окружающими тканями, решает в определенной мере данную проблему. Исходя из этого, разработка 3D материалов - матриксов для клеточных культур (в том числе, стволовых) является своевременной и актуальной задачей.

Цель настоящего исследования - биомедицинские испытания в экспериментах in vitro и in vivo ряда образцов пористой гранулированной наноструктурированной кальцийфосфатной бифазной и замещенной биокерамики, а также натурального коралла Acropora cervicornes в качестве 3D матриксов для культуры аутологичных ММСК; использование наиболее перспективных образцов самостоятельно и в составе биоинженерной конструкции (3D матрикс с иммобилизованными ММСК) для замещения костных дефектов у экспериментальных животных .

Материалы и методы. Изучение острой токсичности данных материалов (24 часа инкубации) и их матриксных качеств (3, 7, 10, 14, 17, 21, 28 суток культивирования) проводили в экспериментах in vitro на модели иммортализованных фибробластов человека (ФЧ). Метод оценки жизнеспособности клеток в динамике культивирования - МТТ-тест. Биосовместимость материалов оценивали в экспериментах in vivo при их подкожной имплантации мышам-самкам линии BDF₁ (через 1, 2, 4 недели, 3 и 6 месяцев). Метод оценки - световая микроскопия. Исследование эффективности использования биоимплантатов самостоятельно и в составе биоинженерной конструкции (иммобилизованные аутологичные ММСК на материале) проводили на двух экспериментальных моделях: остеотомии голени крыс - самок линии Wistar (биокерамические имплантаты) и сегментарной резекции большой берцовой кости барана (имплантат из натурального коралла). Для исследования динамики закрытия костного дефекта крыс через 3, 6, 9, 12 недель и 8 месяцев их выводили из эксперимента, и, после декальцинации, производили морфологическое исследование зоны дефекта. В эти же сроки осуществляли рентгенологическое исследование животных всех групп. Баранам производили рентгенологические исследования трижды: накануне операции (для определения размеров имплантата) и в динамике закрытия дефекта через 1 и 4 месяца после операции. Далее после эвтаназии животного производили распил бедренной кости на фрагменты с последующим гистологическим исследованием материала.

Результаты и обсуждение. В экспериментах in vitro изучена острая цитотоксичность 10 различных образцов гранулированной пористой кальцийфосфатной керамики: бифазных материалов на основе гидроксиапатита (ГА) и трикальцийфосфата (ТКФ) с разным процентным соотношением составляющих, карбонат- и кремнийзамещенной гидроксиапатитовой биокерамики (КГА и КЗГА), композиционных материалов αТКФ -βТКФ, чистого βТКФ, а также натурального коралла Acropora cervicornes. Показано, что все образцы материалов не токсичны для клеток - через 1 сутки культивирования к их поверхности прикрепляется и распластывается 80-90% от инициального пула ФЧ. Оценены матриксные свойства поверхностей данных материалов по способности поддерживать активный рост и пролиферацию клеток при совместном культивировании. Обнаружено, что все образцы (за исключением композита αТКФ - βТКФ) обладали выраженными матриксными свойствами - за период наблюдения пул ФЧ увеличивался в 7,5-9,0 раз vs 5,0 в контроле (культуральный пластик полистирен). В экспериментах in vivo изучали биосовместимость образцов ГА, ГА-ТКФ, КГА, КЗГА и натурального коралла. Выявлено, что при подкожной трансплантации мышам данные образцы не вызывают реакции воспаления со стороны окружающих тканей, т.е. являются биосовместимыми.

При динамическом наблюдении за процессом закрытия дефекта голени крысы с использованием биокерамических имплантатов ГА-ТКФ, КЗГА и βТКФ без стволовых клеток и в составе биоинженерной конструкции обнаружены остеоиндуктивные потенции изученных биоматериалов разной степени выраженности. В целом, очаги оссификации в зоне дефекта появляются в промежутках между гранулами уже через 3 недели после операции. К 6-ой неделе эти процессы нарастают, вокруг гранул, попавших в верхнюю часть дефекта, начинает формироваться надкостница. Параллельно процессам формирования новой костной ткани идут процессы резорбции биоматериалов, наиболее выраженные для βТКФ. К 12 неделе эксперимента биокерамические гранулы (за исключением КЗГА) почти полностью резорбируются и замещаются зрелой костной тканью с формированием остеонов. Использование биоинженерной конструкции в зоне дефекта приводит к более раннему формированию очагов оссификации и, как минимум, на неделю раньше восстановления костного дефекта. По скорости биорезорбции и остеоиндуктивным качествам изученные биокерамические материалы могут быть представлены в следующей последовательности: КЗГА→ГА-ТКФ→βТКФ).

Наиболее эффективной для замещения протяженного дефекта бедренной кости барана оказалась биоинженерная конструкции из натурального коралла Acropora cervicornes, насыщенного культурой аутологичных ММСК. Обнаружен выраженный остеоиндуктивный эффект данной конструкции по сравнению с контролем (коралловый имплантатат без клеток): через 5 месяцев после сегментарной резекции бедренной кости барана установлена полная консолидация коралла с окружающими тканями. На гистологических препаратах отмечено активное костеообразование с формированием зрелых остеонов с параллельной резорбцией собственного вещества коралла.

Таким образом, синтетические кальцийфосфатные биокерамические материалы ГА-ТКФ, КГА, βТКФ и натуральный коралл Acropora cervicornes могут рассматриваться в качестве перспективной системы иммобилизации и направленной доставки ММСК при замещении костных дефектов.

Действие аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на репаративные процессы в нервной ткани при диффузной травме головного мозга крыс.
Южаков В.В., Коноплянников А.Г., Цыб А.Ф., *Рошаль Л.М., *Сушкевич Г.Н., *Семенова Ж.Б., Бандурко Л.Н., Ингель И.Э., Кальсина С.Ш., Верховский Ю.Г., Шевчук А.С., Цыганова М.Г., Лепехина Л.А.

ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск,

*НИИ неотложной детской хирургии и травматологии Департамента здравоохранения г. Москвы
Травматическое повреждение головного мозга остается одной из серьезных проблем здравоохранения. В отличие от многих других тканей, нервная система имеет ограниченный потенциал самовосстановления. Высокодифференцированные нейроны не обладают способностью к полной регенерации, а присутствующие в головном мозге взрослого организма нейральные стволовые клетки имеют ограниченные возможности генерировать новые функциональные нейроны в ответ на повреждение. Поэтому актуальным является поиск новых методов терапии травм головного мозга с использованием трансплантации стволовых клеток. Многочисленные исследования по данному вопросу свидетельствуют, что необходимой пластичностью и терапевтическим потенциалом для нервной системы обладают мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из костного мозга взрослого организма. По данным литературы, трансплантация МСК способствует репарации поврежденной нервной системы и восстановлению неврологического статуса при фокальной церебральной ишемии и локальной травме головного мозга.

В данной работе изучали влияние системной трансплантации МСК из костного мозга взрослого организма на функциональную морфологию нейронов и репаративные процессы в нервной ткани крыс после закрытой черепно-мозговой травмы. Исследования выполнены на головном мозге крыс самцов линии Вистар в возрасте 2-х месяцев массой тела 140-150 г, разделенных на 5 групп. Моделирование травмы головного мозга осуществляли методом падающего груза. Груз весом 50 г свободно падал с высоты 110 см в полой трубке диаметром 1,2 см на теменную область головы. Площадь ударной поверхности импактора составляла 0,5 см2. Из выживших животных (около 50% от общего количества) были сформированы группы сравнения. Группы были равноценны по степени тяжести травмы головного мозга, которую оценивали по комплексу симптомов и тестов в течение 30 минут после воздействия. Животные 1-й экспериментальной группы (n=16) с травмой головного мозга лечение не получали. Крысам 2-й группы (n=10) с травмой проводили базисную терапию на основе применения противоотечных, антигипоксических и противовоспалительных препаратов. Животным 3-й группы (n=10) через сутки после травмы однократно внутривенно вводили 2 × 106 МСК, суспендированных в 0,5 мл физиологического раствора. Крысам 4-й экспериментальной группы (n=10) проводили комплексное лечение путем сочетанного применения базисной терапии и введения МСК. Контрольную группу составили 14 ложнотравмированных крыс.

Головной мозг для исследования брали у декапитированных под нембуталовым наркозом крыс через 1 ч, 1, 3 и 14 сут после нанесения травмы. Выделенный мозг фиксировали в 10%-ном формалине или 70% этаноле. После фиксации мозг разрезали на два сагиттальных блока или на 4 фронтальных фрагмента на уровне рострального отдела боковых желудочков, гиппокампа, среднего мозга и мозжечка. Срезы препаратов, фиксированных в этаноле, окрашивали крезиловым фиолетовым и тионином по Нисслю. Для иммуноокрашивания пролиферирующих клеток использовали мышиные моноклональные антитела к PCNA (proliferating cell nuclear antigen) при разведении 1:50 (клон PC10, «Calbiochem»). Гистотопографическое картирование зон повреждений и точное определение уровней коронарных срезов производилось по стереотаксическому атласу головного мозга крыс.

Результаты исследования показали, что закрытая черепно-мозговая травма вызывает у крыс диффузное повреждение головного мозга. Первичное повреждение сопровождается сосудистыми нарушениями и травматическим отеком, достигающим максимального развития на 1 сут. Формирование отека ведет к ишемическим повреждениям нейронов коры и стволовой части мозга. Уже в ранние сроки после травмы запускаются реактивные и компенсаторно-регенерационные механизмы с инициацией пролиферации глии и клеток в зонах нейрогенеза. Однако фаза регенерации носит пролонгированный характер с медленно протекающими репаративными процессами поврежденных тканевых и клеточных структур головного мозга. Результаты наших исследований согласуются с данными других авторов, которые показали, что патологические события, формирующиеся при повреждении взрослого мозга, стимулируют нейрогенез в паравентрикулярной зоне боковых желудочков и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа. Лечебный эффект после базисной терапии по усилению пролиферативной активности клеток сосудистых сплетений, микроглии и, особенно, клеток эпендимы и субэпендимального слоя определялся лишь на 3 сут после травмы. Через две недели у животных, получавших комплексное лечение, гистологический рисунок коры и других отделов головного мозга практически не отличался от вариантов нормы для животных контрольной группы. Тем не менее, несмотря на восстановление морфологии нейронов, в коре, мозолистом теле и промежуточном мозге сохранялись локальные очаги пролиферации клеток и повышенная активность зон нейрогенеза. С учетом этого можно считать, что полноценного восстановления поврежденных клеточных и тканевых структур мозга в данном периоде времени после травмы, даже у животных, которым вводили МСК на фоне базовой терапии, еще не происходит.

По нашим данным, при диффузной травме головного мозга нейропротекторным действием МСК было не только усиление в фазе регенерации репаративных процессов в целом (быстрое восстановление субстанции Ниссля в нейронах, ускорение глиогенеза и ангиогенеза), но и, возможно, активация герминативных зон нейрогенеза. Анализ данных по этому вопросу показывает, что лечебное действие МСК при повреждении нервной ткани может реализовываться несколькими путями. Во-первых, есть сведения, что после миграции в поврежденную нервную ткань МСК начинают экспрессировать нейрональные и астроцитарные маркеры и, не исключено, что способны замещать погибшие клетки. Во-вторых, продукты экспрессии МСК могут оказывать стимулирующее действие не только на нервные стволовые клетки, но и на эндотелий сосудов. И, наконец, МСК активируют клетки, которые дополнительно экспрессируют факторы роста в головном мозге. Так, по данным литературы, после повреждений или дегенерации, обусловленной травмой, выживаемость нейронов и их восстановление промотируют нейротрофические факторы, которые экспрессируют глиальные клетки. Наши результаты свидетельствуют, что индуцированную травмой пролиферацию глиальных клеток потенцирует базисная терапия и активирует введение МСК. Возможно, снижая развитие отека и восстанавливая микроциркуляцию, базовая терапия способствует более быстрому поступлению, накоплению и/или миграции МСК в поврежденные участки головного мозга.

Таким образом, сравнительный анализ полученных результатов позволяет заключить, что системно введенные в сингенный организм мезенхимальные стволовые клетки обладают пролиферотропным, ангиогенным и, по-видимому, нейротрофическим эффектами. Косвенные данные свидетельствуют, что в период регенерации нервной ткани МСК могут активировать пролиферацию клеток в зонах нейрогенеза. Визуально лечебный эффект определен на вторые сутки после внутривенного введения МСК. На фоне базисной терапии нейропротекторное действие МСК усиливается. Можно предположить, что комплексное лечение при общемозговой диффузной травме, основанное на применении метаболической поддержки и внутривенного введения МСК, создает предпосылки для активации механизмов компенсаторно-приспособительных процессов в период репаративной регенерации и усиления трофики нервной ткани, необходимых для восстановления функциональной морфологии поврежденных нейронов. Результаты данной работы согласуются с выводами других авторов о положительном терапевтическом действии МСК при травматическом повреждении головного мозга.

Изменение экспрессии генов в процессе дифференцировки мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга и жировой ткани человека в клетки костной ткани.
Савченкова И.П., Ростовская М.С.¹, Чупикова Н.И.¹, Дьяконов Л.П., Тепляшин А.С.¹

Всероссийский государственный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко РАСХН, 109428, г. Москва, Рязанский проспект, 24/1, Россия,

ООО Институт стволовой клетки, г. Москва, Кузнецкий мост, 17/1, Россия

Введение. Появились сообщения о выделении из жировой ткани клеточной популяции с фенотипом подобным ММСК КМ, которая обладает потенциями к дифференцировке в клетки костной, хрящевой и жировой тканей. На сегодняшний день достаточно хорошо изучены факторы, вызывающие дифференцировку ММСК в клетки костной ткани. Интенсивно ведутся работы по моделированию остеогенеза, как в монослое, так и в трехмерных структурах, т.е. на матрицах носителях. ММСК, подвергнутые дифференцировке in vitro в клетки костной ткани представляют собой удобную модельную систему in vitro для изучения событий, происходящих в остеогенезе на молекулярном уровне.

Целью нашей работы было сравнить потенции ММСК, выделенных из костного мозга и подкожно-жировой клетчатки при индукции дифференцировки в клетки костной ткани in vitro на уровне экспрессии генов-маркеров остеогенеза: остеопонтина (ОП), остеокалъцина (ОК) и костного сиалопротеина (КС).

Материал и методы.

В эксперименте использовали ММСК КМ и ПЖК человека. Для выявления поверхностных АГ клетки анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии на цитометре Epics Elite Coulter. Первичные мышиные AT, используемые в наших экспериментах, были против 23-х АГ человека фирмы «Becton Dickinson». В качестве вторичных AT использовали анти-мышиные IgG козы, меченые ФЭ той же фирмы. Для получения клеток костной ткани МСК высевали в чашки Петри диаметром 10 см в концентрации 5x10³ клеток/см². Индукционной средой для дифференцировки в клетки костной ткани была ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (1 г/л), дополненная СПК (10%), дексаметазоном (10^-7 М), β-глицерофосфатом (10 мМ) и аскорбиновой кислотой (0,2 мМ) (Reyes et al., 2001).Через 14, 21 и 28 сут после начала индукции часть клеток окрашивали по von Kossa и ализариновым красным, а часть клеток параллельно использовали для выделения РНК. В качестве контроля были использованы клетки, растущие без индукторов. Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega), согласно рекомендациям производителя. Концентрацию выделенной РНК определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 260 нм по формуле lOD=40 мкг РНК/мл. Реакцию обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) проводили в объеме 10 мкл. Для ПЦР-реакции были использованы следующие праймеры на маркеры: остеокальцин (ОК), прямой 5'-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3' и обратный 5'-GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC-3' (Caterson et. al., 2002); остеопонтин (ОП), прямой 5'-ACCCTTCCAAGTAAGTCCAAC-3' и обратный 5'-AGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3'; костный сиалопротеин (КС) II типа, прямой 5'-AAGGGCACCTCGAAGACAAC-3' и обратный 5'-ACCATCATAGCCATCGTAGC-3'; глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, прямой 5'- GGGCTCCTTTTAACTCTGGT-3' и обратный 5'-TGGCAGGTTTTTCTAGACGG-3'(Caterson et. al., 2002). Праймеры на ОП и КС были подобраны к опубликованным последовательностям мРНК (соответственно, ВС093033 и NM_004967, GenBank).

Результаты и обсуждение.

Ранее нами были выделены и охарактеризованы клетки с фенотипом подобным ММСК из КМ и ПЖК взрослого организма человека (Тепляшин и др., 2005). Цитофлуореметрический анализ выявил на их поверхности наличие АГ, экспрессия которых характерна для ММСК человека. Так клетки, выделенные из КМ и ПЖК, положительно окрашивались AT к АГ: CD10 (78.5 % и 79.4 %), CD13 (99.0 % и 99.5%), CD29 (98.7% и 98.8%), CD44 (98.1% и 98.6%), CD49a (89.9 % и 69.2%), CD49b (90.1 % и 96.8%), CD54 (39.9 % и 91.4%), CD71 (88.1 % и 85.1%), CD73 (99.6 % и 99.2%), CD90 (99.2 % и 99.2%), CD105 (99.5 % и 97.4), CD166 (99 % и 97.9%), HLA ABC (99.4 % и 99%), соответственно. Все типы клеток были отрицательны по CD34 (0.3 % и 3.2%), CD45 (0.1 % и 1.2%) и CD133 (0.9 % и 1.6%) - маркерам, свойственным стволовым клеткам крови, CD31 (0.5 % и 2.3%) - маркеру эндотелиальных клеток, а также HLA DP (2.3 % и 1.85%), HLA DQ (0.3 % и 1%) соответственно. Доля клеток положительно окрашенных AT к рецептору фактора стволовых клеток c-kit (CD117) составляла 7% для клеточной популяции, выделенной из КМ, а для ПЖК - 1.2 %. Данные приведены по 5-ти донорам. Сравнительный анализ экспрессии АГ на ММСК КМ и ПЖК, выявил значительные различия в количестве клеток, положительно окрашенных по а4 интегрину (CD49d) и молекуле клеточной адгезии VCAM (CD 106). Подобные различия, наблюдаемые в наших экспериментах, были выявлены и другими исследователями (De Ugarte et al., 2003). Интересным оказался факт, что эти две популяции клеток были отрицательны по STRO-1, экспрессия которого, как известно, характерна для стромальных клеток КМ с остеогенным потенциалом. При культивировании в среде, индуцирующей дифференцировку в клетки костной ткани, морфологические изменения в клетках, выделенных из КМ, наблюдали на 14 сут, в то время как в клетках выделенных из ПЖК, эти изменения были обнаружены только на 28 сут культивирования. Визуальная оценка подтверждалась окраской экспериментальных образцов ализариновым красным и по von Kossa . Формирование кости включает цепь последовательных событий, которые можно условно разделить на три фазы: пролиферативную с секрецией матрикса, созревание матрикса и минерализация матрикса (Owen et el., 1990). Для каждой из перечисленных фаз характерна экспрессия различных генов. Считается, что ОП принадлежит к одному из ранних маркеров, свидетельствующих об инициации дифференцировки ММСК в остеогенном направлении. Его экспрессия характерна для предшественников остеобластов (преостеобластов) (Yao et al., 1994). Анализ экспрессии генов в процессе дифференцировки ММСК КМ и ПЖК в клетки костной ткани обнаружил, что клетки, выделенные из КМ, как в контрольной, так и экспериментальной группах были позитивны по ОП на 14 сут. В отличие от них, в клетках выделенных из ПЖК в среде без индуктора экспрессия ОП не была выявлена. ОП появлялся в клетках подвергнутых дифференцировке на 14 сут. К специфическим маркерам, характеризующим позднюю стадию дифференцировки включая окраску по von Kossa (Puchtler et al., 1978), относят OK (Tracy et al.,1990). Экспрессия OK свидетельствует об окончательной дифференцировке остеобластов. В наших экспериментах экспрессия ОК была обнаружена только в клетках КМ, подвергнутых дифференцировке на 14 сут. Наиболее специфичным маркером поздней стадии дифференцировки в направлении остеогенеза является КС (Chen et al., 1992). Его экспрессия характерна только для минерализованных клеток. На 14 сут в клетках КМ подвергнутых дифференцировке была обнаружена экспрессия КС, которая сохранялась на протяжении всего эксперимента (21 и 28 сут). В клетках выделенных из ПЖК ОС и КС не был выявлен даже на 28 сут индукции.

Таким образом, несмотря на схожесть фенотипа популяций выделенных из КМ и ПЖК эти клетки обладают разными характеристиками, в том числе потенциями дифференцироваться в направлении остеогенеза. Сравнительный анализ уровня экспрессии генов маркеров остеогенеза в модельных системах, полученных на основе ММСК из двух разных источников показал, что клетки, выделенные из КМ являются более перспективным источником при моделировании костной ткани in vitro.

Роль фетальных стволовых клеток в восстановлении нарушенных функций органов и тканей.
Доскалиев Ж.А., Каюпов Б.А.

Казахская государственная медицинская академия, Казахстан, г. Астана

Национальный научный медицинский центр, Казахстан, г. Астана
Последние десятилетия в медицине ознаменовались рядом крупнейших достижений молекулярной и клеточной биологии, на базе которых развились научно-обоснованные, принципиально новые и эффективные биотехнологические способы профилактики и лечения многих заболеваний человека, фетальная трансплантация в их числе. В настоящее время в области клинического применения фетальных тканей и клеток накоплен достаточно большой опыт. Однако в ведущих медицинских центрах мира не прекращаются интенсивные научные исследования по разработке технологий фетальных трансплантаций, что определяет эту область исследований как одну из самых приоритетных в развитии медицины.

Построение рациональной системы применения фетально - клеточной трансплантации в восстановлении нарушенных функций систем, органов и тканей.

В Национальном научном медицинском центре Казахстана, в рамках совместной с Казахской государственной медицинской академией научно-технической программы, за период 2001-2006 гг. проведено 1072 фетальные трансплантации.

Этические положения соответствовали законопроектам Международного комитета по изучению аспектов трансплантации человеческих тканей (Канада, 1994 год), Конвенции о правах человека и биомедицине (Страсбург, 1996).

В качестве источника фетального материала служили нежизнеспособные плоды человека, массой не более 400гр, полученные от женщин, искусственно прерывающих беременность по социальным и медицинским показаниям в сроках гестации от 18 до 20 недель. Забор фетального материала производился при условии отрицательных результатов исследований сыворотки крови матери и плода при тестировании на СПИД, сифилис, гепатиты В и С, цитомегаловирус, вирус простого герпеса и ряд внутриклеточных бактерий (хламидии, микоплазма, уреплазма).

Изолированные фетальные клетки получали комбинированным методом диссоциации, а для поддержания их жизнеспособности использовались сложные среды, в состав которых входят аминокислоты, витамины, нуклеотиды, белки, желатин и растворы Рингера, Рингер-Локка, Рингер-Тироде, Хенкса, Эрла.

Для долгосрочного хранения клеточных суспензий использовался метод программной криопрезервации, материал хранился в условиях низкотемпературного холодильника и в жидком азоте, в качестве стабилизатора клеточного материала использовался глицерин и ДМСО.

При разработке оптимального способа пересадки фетальных клеток нами были исследованы различные способы трансплантации клеток: подкожно, внутривенно, интрапаренхиматозно, эндоваскулярно через чревный ствол и почечную артерию, внутрисуставно и эндолюмбально. Результаты проведённого исследования приведены в таблице 1.

Фетальная трансплантация в восстановлении нарушенных функций систем, органов и тканей проявляется многогранными лечебными эффектами и значительно превышает все известные современные методы лечения по глубине своего воздействия, качеству, специфичности и, что самое важное – по эффективности. Наблюдение и оценка клинического опыта продолжаются.

Таблица 1. Результаты фетальной трансплантации в восстановлении нарушенных функций систем, органов и тканей

Нозологии	Критерии эффективности	Результаты
Циррозы печени вирусной, токсической, аутоиммунной этиологии (n=600)	Маркеры холестаза и цитолиза Биопсия печени в динамике МРТ, КТ в холангиорежиме Кластеры дифференцировки кроветворения	Снижение уровня синдрома холестаза у 87% больных, цитолиза у 76%, портальной гипертензии у 68%, морфологически - уменьшение индекса гистологической активности по Knodell на 5 баллов.
Сахарный диабет типа 1и 2 СД 1 тип - n = 66 СД 2 тип – n= 58 (n=124)	Гликозилированный гемоглобин С-пептид Свободный инсулин СД 3, СД 4	Стабилизация углеводного обмена – 96%; Уменьшение доз инсулина в среднем на 30 – 35% - 88%; Отмена инсулина при сахарном диабете 2 типа – 40%; Регрессирование микроангиопатий – 72%
Хронические гломерулонефриты с исходом в хроническую почечную недостаточность (n=96)	Функциональное состояние почек (СКФ, креатинин) УЗДГ сосудов почек Биопсия почки Иммунологические маркеры клеток – предшественников костного мозга	Отсутствие прироста уровня азотемии и удлинение додиализного периода у 81%. Стабилизация гемодинамики со значительным снижением дозы антигипертензивных препаратов у 96%. Улучшение качества жизни в виде снижения признаков уремической интоксикации у 97%.
Гипотиреозы различной этиологии (послеоперационный, врожденный, аутоиммунный) (n=48)	Гормоны щитовидной железы ТТГ Антитела к тиреоглобулину и тиреопероксидазе УЗИ щитовидной железы	Повышение уровня тиреоидных гормонов (трийодтиронин, тироксин) у 89% больных. Увеличение объема щитовидной железы у 87%. Улучшение качества жизни (уменьшение доз заместительной терапии) у97%.
Ревматоидный артрит, асептический некроз головки бедренной кости. (n=65)	Клинические проявления Рентгенологическая картина РФ, СРБ, Ig Антинуклеарные факторы Морфология синовиальной оболочки	Купированы болевой синдром, сгибательная контрактура суставов, синовиты у всех больных, положительная рентгенологическая динамика через 3 месяца у 62%, снижение уровня суммарных антиядерных антител у 61%, уровня острофазовых проб у 70%.
Органическая патология центральной нервной системы (n=145)	Индекс Бартела Шкала функциональной независимости МРТ, КТ ЭЭГ, Электромиография	Регресс неврологического дефицита (снижение спастики мышц) у 87% больных, улучшение качества жизни по индексу Бартела у 94%.

Каталог: fileadmin -> rsmu -> documents -> conference -> 2007 year
documents -> Определение оптимальной тактики лечения больных инфарктом миокарда без подъема сегмента st на экг 14. 00. 06 Кардиология
documents -> Многоканальная электромиостимуляция и гипербарическая оксигенация в комплексном лечении больных с диабетической ангиопатией 14. 00. 51- восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия
documents -> Полиненасыщенные жирные кислоты в комплексной терапии различных форм псориаза на примере жителей Приморского края ( клинико-экспериментальное исследование ) 14. 00. 11 кожные и венерические болезни
documents -> Эндоскопия в диагностике и лечении экссудативного среднего отита у детей 14. 00. 04 Болезни уха, горла и носа
documents -> Затяжное течение острых средних отитов у детей раннего возраста (клинико-аудиологические аспекты) 14. 00. 04 Болезни уха, горла и носа
documents -> Морфогенез метаплазий, дисплазий и аденокарцином в пищеводе Барретта (иимуногистохимическое исследование) 14. 00. 15 патологическая анатомия
2007 year -> Программа 30 мая 2007 год 9 часов 00 минут 10 часов 00 минут регистрация участников конференции