Клинико-диагностическое значение определения антител к аденозиндезаминазе у больных системной красной волчанкой 14. 00. 39 ревматология

академик РАМН, профессор

доктор медицинских наук,

профессор Коршунов Николай Иванович

доктор медицинских наук,

профессор Мач Эвелина Семеновна
Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

Защита состоится «__» _________ 2009 г. в ___ часов на заседании
Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоград­ский государственный медицинский университет» Росздрава по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Вол­гоградский государственный медицинский университет» Росздрава.
Автореферат разослан «___» __________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.008.02

доктор медицинских наук, профессор А.Р. Бабаева

Системная красная волчанка (СКВ) является относительно редким заболеванием с распространенностью около 1 случая на 1000 населения, однако эта патология имеет большое социальное и медицинское значение (Uramoto K.M., 2005; Насонова В.А., 2005). Экономическая значимость СКВ обусловлена преимущественным поражением лиц трудоспособного периода жизни, преобладанием среди заболевших женщин детородного возраста, что ведет к большим прямым и косвенным затратам на лечение. Особенно тревожной тенденцией является трехкратный рост забо­лева­емости СКВ за последние сорок лет (Cervera R., 2003).

Создание классификации и разработка диагностических критериев СКВ существенно улучшило диагностику и определило основу для совершенствования лечебной тактики при этом заболевании. Широкое применение кортикостероидов и цитостатических иммунодепрессантов в качестве основных элементов комплексной терапии расширило возможности воздействия на активность патологического процесса. Однако, несмотря на достигнутые успехи в диагностике и лечении СКВ, задача своевременной постановки диагноза, назначения адекватной терапии и контроля за ее эффективностью часто бывает осложнена вариабельностью клинической картины и полиморфизмом проявлений, а также недостаточностью знаний этиологии и патогенеза этого тяжелого страдания (O’Neill S.G., 2005; Клюквина Н.Г., 2006; Navarra S.V., 2006).

Специфический для СКВ механизм активации аутоиммунитета до настоящего времени достоверно не установлен. Наиболее перспективным направлением считается гипотеза о возможности взаимосвязи между индукцией иммунного ответа к аутоантигенам и нарушением процессов апоптоза при СКВ (Lorenz H.M., 2000).

Наряду с этим в последнее время в литературе обсуждается вопрос об участии в патогенезе аутоиммунных заболеваний различных нарушений, связанных с метаболическими процессами, происходящими на клеточном или субклеточном уровнях, медиаторами которых являются ферменты. Биохимические реакции, составляя материальную основу всех функциональных процессов организма, несут адаптационную, гомеоста­тическую миссию. Хорошо известно, что с активностью аденозиндеза­миназы (АДА), являющейся ключевым ферментом пуринового метабо­лизма (ПМ), тесно связаны иммунологические процессы в организме. От активности данного фермента зависит внутриклеточная концентрация аденозина и дезоксиаденозина – пуриновых метаболитов, играющих важную роль в процессах кооперативных взаимодействий клеток иммунной системы. Снижение активности АДА и следующие за этим многочисленные изменения, являющиеся результатом накопления в клетке токсических концентраций аденозина, дезоксиаденозина и соответствующих нуклеоти­дов, а также блокады рибонуклеотидредуктазы, приводят, в конечном счете, к остановке биосинтеза РНК, ДНК и гибели клеток.

Серьезные нарушения в активности АДА наблюдаются при иммуно­дефицитных заболеваниях различной этиологии. Данные об изме­нении энзиматической активности АДА в сыворотке крови при ревматических заболеваниях немногочисленны и противоречивы, а изучению иммуноло­гической активности фермента посвящены единичные работы (Lee J.Y., 2002; Негметзянова Е.С., 2006). Учитывая характерные иммунологические нарушения при СКВ и участие ПМ в патогенезе этого заболевания, можно предположить, что снижение энзиматической активности ряда ферментов пуринового метаболизма, в том числе и АДА, может быть обусловлено как гиперпродукцией антител к этим ферментам, так и влиянием метабо­лических нарушений.

Определение антител к АДА и выяснение их влияния на активность этого фермента у больных СКВ как с позиций диагностики активности и формы патологического процесса, изучения отдельных звеньев патогенеза заболевания, так и возможности коррекции, контроля эффективности проводимой терапии представляет собой актуальную задачу.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования является усовершенствование иммунологической диагностики, дифференциальной диагностики и объективизация контроля эффективности проводимой терапии путем исследования антителообразования к аденозиндезаминазе у больных системной красной волчанкой.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. 
   Получить иммобилизированную форму аденозиндезаминазы, изучить ее физико-химические свойства.
   
2. 
   Применить иммобилизированную форму аденозиндезаминазы в иммуноферментном методе исследования для определения аутоантител к этому ферменту; определить границы нормы; оценить диагностическую ценность данного метода при СКВ.
   
3. 
   Изучить содержание антител к аденозиндезаминазе в сыворотке крови больных СКВ в зависимости от активности, повреждения, характера течения, клинических особенностей заболевания и показателей качества жизни, связанного со здоровьем.
   
4. 
   Изучить динамику антителообразования к аденозиндезаминазе у больных СКВ в процессе стационарного лечения; оценить возмож­ность использования теста по определению антител к аденозин­дезаминазе в качестве объективного критерия эффектив­ности проводимой терапии.
   

Впервые для иммунодиагностики СКВ разработан и применен в предложенном варианте иммуноферментного анализа метод с исполь­зованием иммобилизированной формы аденозиндезаминазы; подобраны оптимальные условия его постановки и иммобилизации фермента, позво­ляющие сохранять энзимные функции и антигенные свойства аденозин­дезаминазы. Установлено, что при СКВ вырабаты­ваются аутоантитела к аденозиндезаминазе. Показано, что уровень аутоантител к аденозинде­заминазе коррелирует с активностью патоло­гического процесса и повреж­де­нием при СКВ. Выявлено, что аутоантитела к аденозиндезаминазе чаще выявляются у больных СКВ с высокой активностью болезни, при наличии антифосфолипидного синдрома, а также признаков поражения кожи и нервной системы. Показана возможность оценки активности СКВ с исполь­зованием показателей уровня антител к аденозиндезаминазе. Установлена способность исследованных показателей к изменению под влиянием лечения, что позволяет прогнозировать клиническое течение СКВ и обеспечивает возможность оценки эффективности проводимой терапии.

Разработана доступная для применения в клинических лабораториях методика иммуноферментного определения уровня антител к аденозин­дезаминазе на основе иммобилизированной формы энзима в качестве антигенной матрицы. Выявление антител к аденозиндезаминазе в предло­женной модификации ИФА может быть использовано в качестве допол­нительного теста в комплексной диагностике СКВ для характеристики активности патологического процесса, клинических вариантов заболева­ния, а также как критерий эффективности лечения СКВ.

На защиту выносится положение о возможности использования определения антител к аденозиндезаминазе с помощью метода иммуно­ферментного анализа в качестве дополнительного теста для выделения степени актив­ности, клинических вариантов СКВ, оценки эффективности проводимой терапии, а также для изучения биологических свойств фер­ментов, аутоантигенов и механизмов взаимодействия антиген-антитело.

По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из которых 7 – в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных Высшей аттестационной комиссией; 9 публикаций – в материалах Всероссийских научных съездов и конференций; 5 работ – в местной печати, 1 работа − в зарубежной печати. Материалы диссертации были представлены на научно-практических конференциях Волгоградского государственного медицинского университета (2007, 2008 гг.), научных конференциях ГУ НИИ КиЭР РАМН (2007, 2008, 2009 гг.), V национальной научно-практической конференции с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека (Смоленск, 2007); II Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2007), IV Всероссийской конференции "Инновационные технологии в ревматологии" (Нижний Новгород, 2008); IV международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008); Всерос­сийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы клини­чес­кой и экспериментальной медицины» (Чита, 2008); III Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2008); IX Всероссийской научно-практическая конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2009); VI и VII Съездах аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009).

Методы определения антител к аденозиндезаминазе у больных СКВ иммуноферментным методом внедрены в практику работы муниципаль­ного учреждения здравоохранения «Городская клиническая больница № 25» г. Волгограда и государственного учреждения здравоохранения «Волгоградский областной клинический госпиталь ветеранов войн». Материалы проведенного исследования входят в лекционный курс на кафедре госпитальной терапии Волгоградского государственного медицин­ского университета, а также используются на семинарах, научно-практи­чес­ких и клинических конференциях врачей.

Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и состоит из введения, 9 глав, обсуждения результатов, выводов и практи­ческих рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами, 17 рисунками, 3 выписками из истории болезни. Указатель литературы содержит 363 источника, в том числе 101 отечественный и 262 иностранных.

В качестве антигена использовался коммерческий препарат АДА производства «Sigma», США (Cat. № А 5043) с активностью 130 Ед/мг, концентрация белка в нем составила 95,6 мг/мл. Для получения иммобилизированной формы фермента использовали раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Иммобилизацию проводили методом эмульсии­он­ной полимеризации по И.П. Гонтарю с соавт. (Гонтарь И.П., 2001) в потоке газообразного азота с включением магнитного материала. Полученные гранулированные магнитоуправляемые препараты на основе иммобили­зированной аденозиндезаминазы имели правильную сферическую форму с размером частиц от 10 до 100 мкм (контроль осуществлялся с помощью микроскопа).

Антитела к АДА определяли в модификации классического ELISA-теста с использованием гранулированных магнитоуправляемых препаратов с иммобилизированной АДА (в разведении 10 мкг/мл) в качестве антиген­ной матрицы. Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в единицах оптической плотности (Ед). Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 2 стандартных отклонения от средних значений контрольной группы.

Для определения активности АДА сыворотки крови использовалась методика Martinek R.G. (1963), основанная на калориметрическом опреде­лении аммиака с помощью фенолгипохлоритного реактива.

Биохимические исследования проводились унифицированными мето­дами в биохимической лаборатории (заведующий  профессор, д.м.н. Мартемьянов В.Ф.), иммунологические пробы, позволяющих охаракте­ризовать иммунный статус больных СКВ, – в лаборатории клинической иммунологии (заведующий  профессор, д.м.н. Гонтарь И.П.) НИИ клини­ческой и экспериментальной ревматологии РАМН.

Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программных пакетов STATISTICA (Statistica for Windows, Release 6.1, StatSoft Inc., USA) и SPSS (SPSS for Windows, Release 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Представление описательных статистик и выбор статистических критериев производились нами исходя из цели исследо­вания, решаемых при этом задач и рекомендаций руководств по биоста­тистике.