Горизонты науки

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
17
О создании Сибирского центра
генетических моделей на животных
М. П. МОШКИН
МОШКИН Михаил Павлович — доктор биологических наук, профессор, заведующий
Отделом генофондов экспериментальных животных Института цитологии и генетики СО РАН.
Область научных интересов популяционная физиология, исследование материальных основ внутривидовых взаимодействий, обеспечивающих устойчивое воспроизведение биологических видов.
Автор более 150 научных статей, 4 статей в БРЭ,
1 монографии или Зачем нужны 300 тысяч линий мышей
П ОСТ ГЕНОМНАЯ bЭРАbОпыт В. Гарвея по изучению кровообращения.
При остановке венозного оттока с помощью жгута можно увидеть работу венозных клапанов, облегчающих движение крови по направлению к сердцу
Нет нужды доказывать, что вопрос о том, как работает живой
организм, актуален для каждого из нас. Проблема заключается лишь
в выборе адекватного инструмента познания. Как правило, процесс
исследования любой биологической системы, будь то клетка, особь
или биогеоценоз, начинается с морфологического, структурного
описания. Однако несмотря на необходимость этого этапа, его одного
недостаточно, чтобы постичь механизмы функционирования изучаемой
системы. Замечательной иллюстрацией того, насколько ошибочными
могут быть умозрительные построения, опирающиеся исключительно на
описание структур, являются представления античных ученых о функции
головного мозга. Этому материальному субстрату высшей нервной
деятельности Аристотель, как и его коллеги, отводили роль хранилища
воды и слизи для охлаждения крови, а также спермы, поступающей из
мозга по венам вокруг ушей.
Современные методологические основы изучения функций были
заложены еще в XVII в. английским врачом В. Гарвеем, который одним
из первых начал сознательно манипулировать структурами организма
с целью понять их предназначение. И сегодня, спустя столетия, этот
подход не утратил своей актуальности направленные воздействия на
живые системы остаются основным подходом к экспериментальному
изучению механизмов их функционирования. Изменился лишь масштаб
в наше время объектами манипуляций все чаще становятся как крупные
экосистемные образования (например, элементы ландшафтов, таки мелкие структуры живых организмов (клетки, клеточные органеллы
и органические молекулы)
С
равнительно недавно произошло поистине эпохальное событие, которое задало вектор научных исследований на многие десятилетия вперед в 2001 г. две конкурирующие научные команды (Международная организация по изучению генома человека — HUGO и Celera Genomics) объявили о первых расшифровках генома человека. Составление полного списка нуклеотидных последовательностей ДНК человека (а заодно и некоторых наиболее изученных видов животных) можно смело отнести к одному из самых грандиозных описаний.
Однако, сам факт расшифровки генетического текста (те. определение порядка расположения нуклеотидов в геноме) не предполагает его понимания. Наум приходят такие классические книги, как Библия, которые читаются, перечитываются и переистолковываются многократно.

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
19
Получение трансгенных животных
В наши дни трансгенные организмы перестают быть редкостью и значение их для биологии и медицины трудно переоценить. Искусственное включение практически любого интересующего исследователей гена позволяет физиологам изучать на трансгенных животных различные отклонения в гомеостазе организма, иммунной системе, в эмбриогенезе и во многих других случаях.
Исследования в биомедицине сосредоточены в основном на том, чтобы создать широкий спектр моделей заболеваний человека, включая такие, как атеросклероз, диабет, гипертонию, болезнь Альцгеймера, ретинобла- стому, онкологические и многие другие заболевания. Модели трансгенных животных, как правило мышей, позволяют изучать механизмы развития и лечения болезней человека. Трансгенные мыши являются также незаменимой модельной системой и для тестирования генетических конструкций перед получением сельскохозяйственных трансгенных животных-биореакторов, способных с молоком продуцировать белки человека. В случае же генетического текста ситуация усложняется тем, что сам процесс считывания информации происходит в несколько этапов, на каждом из которых возможна корректировка и перекодирование. В итоге элементарное событие на уровне генотипа, начинающееся с транскрипции конкретного гена, на уровне фенотипа приобретает достаточную неопределенность.
Чтобы разобраться во всех этих хитросплетениях, неизмеримо более сложных, чем даже взаимодействия между органами, тканями и клетками, ученые вновь вынуждены прибегать к манипуляциям структурами. Однако, в отличие от «постгарвеев- ского» времени, в «постгеномную» эру в распоряжении исследователей находятся уже не десятки видимых глазом структурных образований, но около 25 тысяч (!) микрообъектов генов. Ведь именно таковы размеры геномов человека и многих видов млекопитающих, используемых современной наукой в качестве экспериментальных моделей.
Возможность целенаправленного генно-инженерного манипулирования резко увеличила темпы накопления знаний о роли отдельных генов и их комбинаций в реализации программ индивидуального развития, в реакциях организма на различные факторы среды, а также в понимании патологических процессов, имеющих генетическую природу. Так, простой наукометрический анализ, заключающийся в запросе на сайте
PubMed научных статей, в которых
Гранулоцит-колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является
ценным стимулятором кроветворения, широко применяемым
в клинике при переливании крови, лечении последствий радио-
и химиотерапии в онкологии (Hobel et al., 2003). В клинических
исследованиях показано, что Г-КСФ-терапия предотвращает и
лечит инфекции у иммунонекомпетентных пациентов, благоприятно
воздействуя на клетки крови. В последнее время Г-КСФ используется
и для различных целей так называемой регенерационной медицины.
Появились сообщения, что Г-КСФ улучшает функции сердечной
мышцы и уменьшает смертность после острого инфаркта миокарда
при введении в область инфаркта стволовых клеток крови
пациента. Г-КСФ синтезируется в моноцитах, фибробластах и
эндотелиальных клетках
Трансгенные животные — это
генетически модифициро-
ванные организмы, в геном
которых искусственно вве-
ден чужеродный ген, спо-
собный экспрессироваться
и наследоваться как любой
природный ген
СЕРОВ Олег Леонидович — доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН. Лауреат государственной премии, автор более
200 публикаций
СЕРОВА Ирина Александровна — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Института цитологии и генетики СО РАН. Автор более 70 публикаций упомянуто словосочетание трансгенные мыши, дает более 90 тыс. ссылок и это притом, что впервые такие мыши были получены всего лишь 20 лет назад Сегодня рост числа статей в этой области биологии идет со скоростью, превышающей тысячу публикаций в месяц.
Мышиная троица
Но почему, собственно, мы завели речь о мышах Не секрет, что львиная доля научных исследований ориентирована на обеспечение здоровой и продолжительной жизни людей. Но среди всего многообразия экспериментальных объектов, именно мыши попадают в точку оптимума при учете двух главных факторов — генетической близости к человеку и доступности для
Области применения гене-
тических моделей на живот-
ных:
1. Моделирование патологий
(model of diseases).
2. Молекулярно-генетиче-
ская физиология (functional
genomic).
3. Испытание средств профи-
лактики и лечения (preclinical
studies)
Мышь как оптимальный модельный объект в координатах «доступность—адекватность»
Прокариоты
Беспозвоночные
Мышь
Свинья
Приматы
Доступность для исследования
Сходство с человеком исследования. Бактерии, дрозофилы и другие беспозвоночные, безусловно, наиболее удобны для содержания в лабораторных условиях, но по многим характеристикам, в том числе генетическим, слишком далеки от человека. Обезьяны и свиньи, напротив, наиболее генетически близки к нам, однако содержание и изучение подобных многокилограм- мовых объектов требует значительных материальных затрат. Кроме того, работа с крупными млекопитающими ограничена поэтическим соображениям. Например, в Японии не хотят убивать обезьян, и хотя избыточная численность обезьян в некоторых районах приносит реальный экономический ущерб, японцы вкладывают немалые средства в разработку методов контрацепции диких животных.
Итак, в качестве наиболее приемлемого компромисса для исследователей остается мышь с заданными генетическими свойствами. Какие же возможности открываются при изучении подобных модельных объектов Во-первых, мы можем приблизиться к пониманию роли и места генетических процессов в формировании фенотипа в широком смысле этого слова, те. в регуляции морфологического развития ив обеспечении физиологических и поведенческих функций. Одним из наиболее продуктивных подходов в этой области является строго адресованное выключение (нока-
утирование) отдельных генов или, наоборот, усиление их функции.
Во-вторых, благодаря генно- инженерным методам, появилась возможность прямого наблюдения

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
21
Животные-биореакторы
Получение терапевтически ценных белков человека в молоке трансгенных животных — одно из перспективных направлений современной биотехнологии. Стратегия создания сельскохозяйственных молочных животных в качестве биореакторов основана на введении в управляемую регуляторными элементами одного из генов молока коровы, козы или овцы комбинированной генетической конструкции, содержащей последовательность ДНК человека, кодирующую необходимый белок. Согласно этой стратегии, такие трансгенные животные способны синтезировать на высоком уровне белок человека исключительно в молочной железе и секретировать его в молоко, которое в свою очередь становится источником для выделения белка человека. В настоящее время имеются примеры успешного применения этой технологии, и созданы трансгенные козы, овцы, кролики, свиньи — продуценты человеческих белков -антитрипсина, сывороточного реактивного белка С, антитромбина, факторов VIII и IX свертываемости крови, лактоферрина, кальцитонина и др. (Wall et al.,1997; Rudolph, 1999; Гольдман и др, 2002). Фармакологический рынок рекомбинантных белков, полученных из молока трансгенных домашних животных оценивается в 1 млрд долл. в настоящее время и прогнозируется его развитие до 18,6 млрд долл. кг и др, Тестирование новых генно-инженерных конструкций, как правило, производится на трансгенных мышах из-за того, что большинство крупных животных — потенциальных продуцентов лекарственных белков человека имеют длительный репродуктивный период и к тому же дорого обходятся. Анализ генетических конструкций на трансгенных мышах позволяет быстро отобрать из них наиболее перспективные как по уровню продукции Наиболее широко используемый метод введения трансгена — микроинъекция в пронуклеусы (мужское и женское ядро) зиготы в тот момент, когда спермий проник в яйцеклетку, и пронуклеусы готовятся к слиянию. Суть метода заключается во введении в мужской пронуклеус с помощью микроманипулятора со стеклянным капилляром (диаметр кончика 1 мкм) раствора экзогенной (чужеродной) ДНК (500—1000 копий гена. Эта процедура проводится под микроскопом со специальной оптикой, позволяющей видеть пронуклеусы в трехмерном измерении.
Эффективность интеграции трансгенов в геном, те. число трансгенных животных от общего числа родившихся при использовании данного метода в зависимости от вида животных колеблется незначительно. Так, у мышей этот показатель составляет 5—15 %, у свиней — 10—15 %, у кроликов — 10 %, у овец, коз и коров — 5—10 Можно выделить следующие этапы получения трансгенных животных) получение зигот от гормонально стимулированных самок
2) микроиньекция раствора ДНК генных конструкций в мужской пронуклеус зиготы) трансплантация проинъецированных зигот сам- кам-реципиентам, подготовленным для вынашивания беременности) анализ родившихся потомков на присутствие трансгена методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР-анализ);
5) анализ трансгенных животных по наследованию трансгена, экспрессии рекомбинантного белка, его биологической активности необходимо узнать, активен Момент микроинъекции рекомбинатной ДНК в мужской пронуклеус зиготы козы
Пронуклеусы
Зигота козы ли встроенный трансген, передается ли он потомкам, обладает ли белок всеми биологическими свойствами его природного аналога и соответствует ли уровень продукции биотехнологическим целям) создание линии (стада) трансгенных животных для научных или биотехнологических целей.
Зигота мыши. Хорошо видны два пронуклеуса
Получение линий трансгенных мышей
Были созданы три генно-инженерные конструкции, способные обеспечить синтез биологически активного гранулоцит-колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) человека в молоке трансгенных мышей. Конструкции содержали ген Г-КСФ человека, слитый с регуляторными последовательностями гена альфа-S1-казеина молока коровы или козы разной длины — от 721 до
3387 пар оснований (pb). Это позволяло включить от минимально необходимого до максимального набора сайтов регуляции, которые составляют сложный физиологический механизм активации функций молочной железы, таких, например, как рецепторы гормональной стимуляции лактации, беременности и др. С помощью микроинъекций рекомбинантной ДНК в зиготы мышей получено более 10 трансгенных животных, каждое из которых дало начало собственной линии мышей. На более чем 400 потомках этих основателей были исследованы наследование трансгена, продукция и биологические свойства Г-КСФ человека. Установлено, что трансген наследуется в ряду поколений по законам Менделя как любой природный ген. Обнаружено, что в молочных железах трансгенных лактирующих самок всех линий трансген стабильно экспрессировался. Концентрация Г-КСФ человека в молоке варьировала от 0,1 мг/мл до 1000 мкг/мл. У трансгенных животных с самой короткой регуляторной последовательностью (721 pb) выявлено присутствие Г-КСФ человека в сыворотке крови, что свидетельствует об эктопической экспрессии трансгена, те. белок человека синтезировали не только клетки молочной железы, но и других внутренних органов. Это было нежелательное осложнение, поскольку трансгенный белок — сильный стимулятор кроветворения и может нанести вред здоровью трансгенной особи. Молоко всех трансгенных животных стимулировало образование кроветворных гранулоцитсодержащих колоний в культуре клеток пуповинной крови человека, и его активность была сопоставима с активностью препаратов натурального Г-КСФ человека. По совокупности характеристик наиболее перспективной оказалась третья конструкция с самой протяженной) регуляторной областью, которая и была использована для получения трансгенных коз
Молоко трансгенных мышей стимулирует рост кроветворных колоний у человека
Вот далеко неполный список фармакологиче-
ски ценных белков человека, полученных от
трансгенных мышей интерферон, фактор
свертываемости крови IX, сывороточный
альбумин, некоторые иммуноглобулины
и многие другие белки, которые уже
рекомендованы для создания молочных
биореакторов
ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
Мышь-донор
Зиготы, взятые у мыши-донора
Микроиньекция раствора ДНК геннных конструкций в зиготы
Мышь-реципиент с трансплантированными зиготами
Трансгенная мышь

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
23
Два трансгенных козленка с геном
Г-КСФ человека противоположного пола — Камилла
(слева) и Августин
(справа), которые родились в марте
2008 года
Второй биотехнологический проект на козах, известный нам пока только из популярной прессы, развивается в совместном российско-белорусском проекте с генетической конструкцией лактоферрина человека.
Лактоферрин содержится в женском грудном молоке и является природным антибиотиком, защищающим детский организм от всевозможных болезней. Государственными заказчиками программы выступают Федеральное агентство по науке и инновациям России и Национальная академия наук Белоруссии. Основные исследования проводят специалисты Института биологии гена РАН и Научно-практического центра НАН Белоруссии по животноводству. В конце 2007 г. ученые сумели получить двух трансгенных козлят, которые несут ген лактоферрина человека.
Фотоматериалы получены совместно с участником проекта
Л. Е. Андреевой (к. б. нс. нс. Института молекулярной
генетики РАН (Москва)).
Литература
Гольдман ИЛ. и др. Лактоферин: свойства и перспективы
биотехнологического производства // Биотехнология. —
1998. — № 4. С. 3—16.
Гольдман ИЛ. и др. Трансгенные козы в мировой фар-
маиндустрии ХХI века // Генетика. — 2002. — Т. 38,
№ 1. — С. 5—21.
Завадская Е. Сидр. Получение рекомбинантного эн-
достатина в молоке трансгенных мышей // Генетика. —
2001. — Т. 37. — С. 1207—1212.
Dvoryanchikov G. A. et al. Secretion of Biologicaly Active
Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF) in
Milk of transgenic Mice // Russian J. of Genetics. — 2005. —
V. 41, N. 10. — P. 1088—1094.
Freitas V. J. et al. Production of transgenic goat (Capra hircus)
with human Granulocyte Colony Stimulating Factor (hG-CSF)
gene in Brazil // Ann. Braz. а. Sci. — 2007. — V. 79 N. 4. —
P. 585—592.
Hubel K. et al. Clinical applications of granulocyte colony-
stimulating factor: an update and summary // Ann. Hematol. —
2003. — V. 82. —P. 207—213.
Niemann H. et al. Transgenic farm animals: an update //
Reprod. Fertil. Dev. — 2007. — № 19. — 762 р.
Wall R. J. et al. Transgenic dairy cattle: genetic engineering on a
large scale // J. Dairy Sci. — 1997. —V. 80. — P. 2213—2224.
Wall R. J. Transgenic livestock: progress and prospects for the
future // Theriogenology. — 1996. — V. 45. — P. 57.
Zakharova E. S. et al. Transcription and mRNA splicing of
the human lactoferrin gene controlled by the regulatory region
of the bovine alphaS1 casein gene in the mammary gland of
transgenic mice and in mouse embryonic stem cells // Dokl.
Biochem. Biophys. — 2006. — N. 411. — P. 336—338.
После этого эксперимента в марте 2008 г. на свет появилось
24 козленка. ПЦР-анализ всех козлят показал, что только три козленка — трансгенные, несущие Г-КСФ человека. Один из трансгенных козлят, к сожалению, родился мертвым. Фото сделано
участником проекта, профессором Vicente Freitas
Последний день эксперимента на козах по получению трансгенных коз с геном Г-КСФ человека. Осень, 2007 год для тестирования, проведения его предклинических и клинических испытаний и разрешения применения получаемого лекарства в медицинской практике.
Опыт ведущих фармакологических фирм США, Канады и Англии показывает, что такие проекты длятся около 10 лет при высоком уровне финансирования. С сожалением можно отметить, что в России таких технологий практически нет, как и инфраструктуры для их развития, а это означает, что биологически ценные белки человека мы будем покупать за рубежом. А таких белков уже около 60 (Rudolph, 1999). К тому же досадно, что российские ученые получили и протестировали на трансгенных мышах несколько эффективных генных конструкций для целей биотехнологии (Завадская и др, 2001; Дворянчиков и др, 2005; Гольдман и др, 1998; Zakharova et al., 2006), однако современных биотехнологических ферм в России нет, и эти разработки пока не используются в полной мере.
Скорее как исключение следует отметить два биотехнологических проекта, развивающихся в России В рамках российско-бразиль- ского проекта, о котором рассказывается выше, участвуют Институт цитологии и генетики СО РАН, Институт молекулярной генетики РАН, Государственный университет Рио де Жанейро (UFRJ) и Университет штата Сеара (UECE), в июле 2006 г. получена трансгенная коза с геном Г-КСФ человека, конструкция предварительно была протестирована на трансгенных мышах (Dvoryanchikov et al., 2005). Статья, посвященная получению трансгенной козы опубликована в Журнале Академии наук Бразилии
(Freitas et al, 2007). Осенью 2007 г. эксперимент успешно повторен, ив марте 2008 г. родились три трансгенных козленка, из которых сейчас успешно подрастают только двое — Камилла и Августин.
заданного белка, таки по его биологическим свойствам.
Проекты по получению трансгенных биореакторов, как правило, состоят из трех частей создание генетической конструкции, включающей ген человека под управлением регуляторных областей одного из молочных генов (например, казеиновых, тестирование ее на трансгенных мышах и, наконец, введение отобранных конструкций в геном молочных животных. Получение эффективного продуцента большая удача и гарантия в относительно сжатые сроки создания стада его потомков, обеспечивающих рынок ценным фармакологическим продуктом. При таком стаде создается лаборатория по выделению и очистке рекомбинантного белка, который передается в соответствующие фарминституты ГОРИЗОНТЫ НАУКИ

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
25
По прогнозам ученых в ближайшие 20 лет число линий мышей достигнет 300 тысяч.
Основные источники разнообразия мышиных линий) трансгенез;
2) точечные мутации (ENU);
3) селекция
В качестве примера можно привести курьезный случай, произошедший водной из лабораторий Женевского университета при изучении молекуляр- но-генетических механизмов работы биологических часов. Внимание профессора У. Шиблера и его коллег привлекло семейство белков PAR bZip, объединяющее три транскрипционных фактора, чья экспрессия меняется в строгом соответствии с суточным ритмом. Для выяснения их роли в работе биочасов исследователи использовали мышей с нокаутом соответствующих генов, по одному ив комбинации. И здесь они столкнулись с неожиданным явлением суточный ритм не только не исчез, но дополнился отчетливым недельным циклом. В кулуарах уже стали обсуждать глубокий биологический смысл библейской недели, но все разрешилось самым прозаическим образом.
Появившийся у нокаутных мышей недельный ритм проявлялся главным образом в массовой гибели животных по понедельниками четвергам. Выяснилось, что согласно графику уборки помещений в эти дни в виварии работали пылесосы, шум которых вызывал у животных эпилептические припадки. Специальное исследование показало, что выключение транскрипционных факторов попутно приводило к резкому росту возбудимости мышей, обусловленному дефицитом
«Три ипостаси ге-
нетически модифи-
цированной мыши
1) объект исследо-
вания;
2) инструмент иссле-
дования;
3) звено в биотехно-
логическом произ-
водстве
Кривая роста числа публикаций с использованием материалов по изучению трансгенных мышей и вклад разных стран мира (круговая диаграмма) в общее число публикаций. Данные получены на основе запроса (transgenic mouse) на сайте PubMed. К моменту выхода статьи общее число публикаций перевалит за 100 000
США
ЕС
Япония
Китай
Другие страны
Россия
18000 16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
1985 1994 1995 1998 2000 2002 Число публикаций 2007 2027 300000 250000 200000 150000 100000 50000 Карта, на которой показано, куда поставляет свои материалы Японский центр биоресурсов. В Россию и Африку биоресурсы практически не поставляются
Мыши (в 158 институтов)
Растения (в 468 институтов)
Клетки (в 685 институтов)
за морфофункциональными процессами, происходящими в организме. И, наконец, уже созданы трансгенные мыши, которые могут стать реальными звеньями в биотехнологических цепочках, связанных с производством лекарственных препаратов. Иными словами, трансгенная мышь сегодня выступает сразу в трех ипостасях: она может быть и объектом исследования, и его инструментом, и производственной мощностью в биотехнологическом цикле.
Ген в нокауте
Сегодня редкая зарубежная статья, посвященная механизмам функционирования организмов, обходится без использования нокаутных животных. Значимость этого подхода отмечена Нобелевской премией 2007 г. в области физиологии и медицины, которую разделили М. Капекки (США, О. Смитис и сэр М. Эванс (Великобритания. Премия была присуждена за Открытие принципов введения специфических генных модификаций в организм мышей посредством эмбриональных стволовых клеток, теза изобретение метода нокаута (gene knockout) отдельных генов. С помощью этого метода удалось показать, что выключение гена может отражаться не только на целевых признаках, контролируемых этим геном, но и на многих других характеристиках организма. Это хорошо известное классическим генетикам так называемое плейотропное действие генов. Однако масштабы плейотропии, которые наблюдаются при изучении нокаутных генотипов, часто превосходят самые смелые ожидания. Нужно заметить, что при этом наши современники нередко попадают в ситуацию, подобную аристотелевской в отношении роли мозга. Однако в отличие от античных ученых они довольно быстро находят правильные решения, поскольку следуют экспериментальным принципам Гарвея, даже если и не отдают себе в этом отчета.
ДНК (в 270 институтов)
Бактерии (в 312 институтов)
Всего 1 893 института 2007

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
27
ритмов, по степени и природе нарушений когнитивных функций и других проявлений старения. Как показали наши исследования, полноценной моделью преждевременного старения и связанных с ним заболеваний может служить созданная в е гг. прошлого века в Институте цитологии и генетики СО РАН под руководством академика Р. И. Салганика линия крыс OXYS. Развитие комплекса признаков преждевременного старения у этих животных — результат направленной селекции крыс Вистар по признаку ранней спонтанной катаракты. В пяти первых поколениях развитие этого заболевания провоцировали обогащенной галактозой диетой. К настоящему времени мы имеем е поколение крыс OXYS со спонтанно развивающейся катарактой и сцепленно с ней наследуемым синдромом преждевременного старения. Его проявлениями становятся сниженная на 28 % по сравнению с исходной линией крыс Вистар продолжительность жизни и раннее развитие фенотипических проявлений старения и возраст-зависимых заболеваний на фоне ранней инволюции тимуса и снижения активности Т-клеточного звена иммунной системы. В тесном сотрудничестве с коллегами из Института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН, Московского института глазных болезней им. Гельмгольца, Новосибирским научно-исследовательским институтом травматологии и ортопедии нам удалось показать, что развивающиеся у крыс OXYS изменения соответствуют основным критериям моделей таких заболеваний, как сенильная Селекция на преждевременное старение
Создание и характеристика биологических моделей социально значимых заболеваний человека один из подходов к выяснению их этиологии и патогенеза, к разработке новых способов лечения и профилактики. В последние годы лавинообразно нарастает количество генетических моделей, среди которых доминируют моногенные — это или трансгенные, или животные с нокаутом генов, или животные с определенными мутациями. Такой подход позволяет приблизиться к пониманию вклада конкретного гена в развитие признака, ноне воспроизводит феноти- пические проявления заболеваний полигенной природы. В полной мере это относится к заболеваниям пожилого возраста, которые развиваются у людей зачастую параллельно и на фоне комплексных проявлений старения, критический возраст манифестации которых существенно различается. Создание моделей, воспроизводящих такую ситуацию — сложная задача, но именно такой подход представляется оптимальным для поиска и испытания новых способов терапии и профилактики. В мире существует практически одна признанная модель преждевременного старения созданная японскими учеными линия мышей SAM (senescence accelerated mouse), которая представлена сегодня
12 сублиниями, различающимися по характеру расстройств в эмоциональной сфере, циркадианных Линия крыс OXYS. Развитие комплекса признаков преждевременного старения у этих животных — результат направленной селекции крыс Вистар по признаку ранней спонтанной катаракты катаракта, возрастная макулодистрофия и остеопороз. Проявления этих заболеваний воспроизводятся на клиническом и морфологическом уровнях и отвечают на стандартную терапию. Модель плодотворно используется для экспресс-оценки эффективности новых методов диагностики, лечения и профилактики ряда возрастных заболеваний и профилактики преждевременного старения. Существенно расширить фундаментальные исследования по выяснению молекулярно-генетической природы преждевременного старения позволило сотрудничество с коллегами из МГУ в рамках проекта Ионы
Скулачева». При этом проект нацелен на решение практических задач разработку фармакологических препаратов, способных осуществлять направленное воздействие на энергетические станции живой клетки — митохондрии, нарушая работу программы старения. Четырех месяцев испытаний на крысах OXYS оказалось достаточно, чтобы показать способность синтезированного под руководством академика В. П. Скулачева митохондриально-адресованного антиоксиданта SkQ ионы Скулачева») предупреждать и(или) задерживать преждевременное старение и развитие связанных с ним заболеваний у крыс OXYS. Испытания, которые удалось провести за один год, продемонстрировали уникальный лечебный потенциал препарата, его способность не только предупреждать и задерживать развитие катаракты и дистрофии сетчатки, но снижать выраженность уже развитых патологических изменений вплоть до полного их исчезновения.
КОЛОСОВА Наталия Гориславовна — доктор биологических наук, руководитель сектора геномной и постгеномной фармакологии Института цитологии и генетики СО РАН
Демонстрация регулируемой экспрессии GFP в фибробластах из ушных раковин трансгенных мышей. Через 6 дней после добавления (Tet-on) или отмены (Tet-off) доксициклина отмечается экспрессия GFP гена 12 18 24 дни 80 60 40 20 0
6 12 18 24
GFP MFI
Dox+ Dox- Dox+
Dox+ Dox- фермента, катализирующего превращение витамина В — кофактора ферментов, участвующих в поддержании баланса важнейших нейромедиаторов. Содержательная часть этой работы была опубликована в журнале Genes & Development (2004), а анекдотическая распространяется как устное предание.
Другая важная истина, открывшаяся при изучении нокаутных животных, заключается в том, что мы недооцениваем
компенсаторные возможности организмов. Некоторые исследователи были разочарованы, не увидев ожидаемых фенотипических проявлений, которые, согласно начальным представлениям, были обязаны иметь место при выключении того или иного гена. Это явление обусловлено тем, что перманентный дефицит продуктов экспрессии конкретного гена может компенсироваться входе онтогенетического развития за счет других систем организма. Таким образом, на примере каждой нокаутной линии мы, по сути, исследуем не только роль определенного гена, но и работу компенсаторных механизмов, что само по себе интересно и важно.

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
29
Оказалось, что механизмы развития артериальной гипертонии у крыс линии НИСАГ адекватно отражают патогенез гипертонической болезни у людей в урбанистических популяциях. Соответствие обнаружено не только на уровне нейроэндокринных и морфофизиологических реакций, но ив характере поведения высокая мотивированность к конкуренции за жизненные блага, повышенная агрессивность и усиленная исследовательская активность. Такая близость нашей экспериментальной модели гипертонической болезни к человеческой патологии позволяет использовать крыс линии НИСАГ не только для изучения механизмов формирования гипер- тензивных состояний, но и для поиска и испытания новых лекарственных препаратов для профилактики и лечения гипертонической болезни и ее осложнений. Как известно, одно из грозных осложнений гипертонической болезни — мозговой инсульт. Оказалось, что крысы линии НИСАГ очень чувствительны к нарушениям мозгового кровообращения. Небольшие ограничения притока крови к определенным областям мозга способны привести у крыс НИСАГ к развитию обширного мозгового инсульта и даже к гибели животного. Это сделало их незаменимой экспериментальной моделью для поиска фармакологических препаратов для борьбы с инсультом. Это обстоятельство послужило основанием для плодотворного международного сотрудничества. Фармацевтическая фирма D-Pharm (Rehovot, Israel), специализирующаяся на разработке новых противоин- сультных препаратов, обратилась с просьбой испытать Селекция гипертоников
Гипертензивные крысы линии НИСАГ со стресс- чувствительной артериальной гипертонией получены в результате многолетней селекции по уровню артериального давления в условиях мягкого эмоционального стресса (Маркель, 1985; Markel, 1991). Исследования причини генетико-физиологиче- ских механизмов формирования стресс-зависимой формы артериальной гипертонии показали, что у крыс НИСАГ действительно имеется генетически обусловленное повышение чувствительности к действию стрессирующих факторов, что выражается прежде всего в формировании стойкого гипертензивного статуса. При снижении порога реагирования на внешнюю стимуляцию повышение артериального давления происходит уже ив обычных нормальных условиях. Крылатое выражение Ганса Селье — основателя учения о стрессе, что вся жизнь — это стресс, очень хорошо подходит для описания подобной ситуации. О роли стресса как фактора, провоцирующего развитие гипертонической болезни у людей, пишут многие исследователи. При этом имеет значение как наличие генетической предрасположенности к усилению стрессовой реакции, таки всевозрастающее давление стресса у популяций людей в индустриально развитых странах с высокой плотностью городского населения и чрезмерным уровнем конкуренции.
МАРКЕЛЬ Аркадий Львович — доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией эволюционной генетики Института цитологии и генетики СО РАН. Автор 320 публикаций
Нарушение кровотока в русле среднемозговой артерии у крыс линии НИСАГ с артериальной гипертонией ведет к развитию мозгового инсульта. Введение препарата DP-b99 сразу после развития инсульта значительно уменьшает очаг некроза и снижает смертность впервые часы после инсульта
Смертность (%) через два часа после окклюзии мозговой артерии
Размер очага некроза (мм
3
)
Среднемозговая артерия крысы Без препарата ± 2.23 18 ± 3.65 30 новый синтезированный в лабораториях фирмы препарат на модели инсульта у крыс линии НИСАГ. В результате большой экспериментальной работы, проведенной в лабораториях Института цитологии и генетики СО РАН, получены результаты, подтверждающие эффективность нового препарата. Эти результаты послужили основой для проведения клинических испытаний. В пресс-релизе, опубликованном фирмой
3 января 2007 г, приводятся следующие результаты. Закончена вторая фаза клинических испытаний препарата условное название DP-b99). Препарат использовали для лечения 150 больных ишемическим мозговым инсультом от й до й степени по шкале NIH Stroke
Scale (USA). Больные находились в 27 клиниках Германии, Южной Африки и Израиля. В группе больных, получавших препарат DP-b99, отмечено двукратное увеличение числа больных с полным восстановлением всех функций после перенесенного инсульта по сравнению с такой же группой больных, не получавших препарат DP-b99. Таким образом, новая модель артериальной гипертонии, созданная в Институте цитологии и генетики СО РАН, уже принесла реальную пользу практической медицине. Именно опыты на крысах НИСАГ дали зеленый свет для проведения последующих клинических испытаний, которые оказались чрезвычайно успешными. Миллионы больных ждут появления новых эффективных препаратов в борьбе с этим страшным нередко смертельным) осложнением гипертонической болезни — мозговым инсультом.
Тетрациклиновый выключатель
Для решения ряда задач исследователям нужно непросто выключить тот или иной ген, но добиться изменения его экспрессии в строго определенное время. В этой публикации намеренно не приведены результаты замечательных работ по использованию технологий подавления экспрессии генов путем введения так называемых антисмысловых или малых интерфири-
рующих РНК (small interference RNA — siRNA) — это отдельная важная тема. Основное внимание будет уделено трансгенным животным, имеющих благодаря искусству генных инженеров наследственно закрепленные свойства, благодаря которым можно управлять активностью конкретных генов с помощью достаточно простых фармацевтических средств.
Один из подходов к управлению экспрессией генов основывается на создании так называемых генетических
конструктов, в которых экспрессию гена контролирует
промотор (участок ДНК перед самим геном, который запускается определенным лекарственным препаратом
(drug-inducible systems (DIS) — генные системы, индуцируемые лекарством. Одна из первых систем такого рода основана на использовании тетрациклина (Tet) или его производного доксициклина. Генно-инженер- ные конструкции, регулируемые этими веществами, получили названия Tet-off или Tet-on, в зависимости оттого, подавляется ли экспрессия гена удалением (off) или добавлением (on) антибиотика.
Работу подобных систем наглядно иллюстрирует генно-инженерная конструкция, в которой Tet-off или Tet-on системы регулируют экспрессию гена
зеленого флюоресцирующего белка (green fluorescence
protein – GFP), также внедренного в мышиный геном. В результате трансгенные зародыши, несущие подобные конструкции и пересаженные на ранней стадии развития самкам дикого типа, могут менять свою окраску в зависимости от поступления в их клетки доксоцикли- на, который добавляется в питьевую воду матерям, их вынашивающих (Szulc et al., 2006). Контролируемая экспрессия GFP сохраняется и во взрослом состоянии,

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
31
Циклическая экспрессия гена люциферазы, вставленного в промоторный район гена циркадных часов (Per1). Суточные ритмы экспрессии демонстрируют и центральный механизм биочасов — супрахиазматические ядра (SCN) и периферические органы и ткани. На рисунке суммированы данные, полученные на трансгенных мышах и крысах. По (Hastings et al., о чем свидетельствует флюоресценция фибробластов, выделенных из ушных раковин взрослых трансгенных особей. Также экспериментально доказано, что подобные трансгенные конструкции, управляющие экспрессией, передаются по наследству. Но существуют еще более интересные приложения
Tet-off/Tet-on систем. Оказывается, под управляемый доксициклином промотор можно поставить небольшой
(40—50 оснований) палиндром, частично комплементарный к участку гена, интересующего исследователей. При экспрессии подобной конструкции будут нарабатываться так называемые шпилечные РНК (small hairpin
RNA — shRNA), которые связываются с соответствующими комплементарными последовательностями синтезированной на гене матричной РНК, что приводит к разрушению последней и ингибированию синтеза белка
(Szulc et al., Генетический нокаут
Согласованная работа медиаторов и модуляторов мозга лежит в основе эмоционального состояния и поведения животных и человека. Эмоции, как и все известные формы поведения — агрессия, половое поведение, сони бодрствование, привыкание и пристрастие к алкоголю и наркотикам, — реализуются действием определенных медиаторных систем с участием разных типов рецепторов к этим медиаторам. Беспрецедентные международные консорциумы Геном человека и Геном мыши показали значительное сходство этих геномов и сделали мышь излюбленным объектом генетики. Перед исследователями основного регулятора поведения — мозга — открылись принципиально новые возможности, связанные с поразительными успехами в расшифровке структуры генов и создании методов получения трансгенных и нокаутных мышей. Стратегия генетического нокаута позволяет получать линии мышей с необратимым селективным повреждением конкретного гена и, соответственно, отсутствующим в организме животного специфическим белком — рецептором или ферментом метаболизма медиатора. Эта методология вызвала огромный интерес в результате чего были выве-
ПОПОВА Нина Константиновна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией нейрогеномики поведения Института цитологии и генетики СО РАН. Член Международного общества нейрогенетики поведения (IBANGS) и Serotonin Club. Автор более
350 научных работ дены уже более тысячи линий мышей с отсутствием какого-либо гена. Важнейшее достоинство стратегии генетического нокаута то, что она моделирует определенные типы наследственной невропатологии. Так, в середине х гг. ХХ в. Бруннер (Brunner) описал обширное голландское семейство, в котором выявлены мужчины с признаками умственной недостаточности и проявлением импульсивной агрессии. У них была идентифицирована точечная мутация в восьмом экзо- не локализованного в Х-хромосоме структурного гена моноаминоксидазы А (МАО А) — одного из основных ферментов катаболизма медиаторов мозга серотонина, дофамина и норадреналина. А через год французские исследователи из Института Кюри была получили линию трансгенных мышей с необратимо разрушенным геном
МАО А. При этом принципиально важно, что у линии мышей с отсутствующим геном МАО А обнаружены изменения в уровне серотонина, дофамина, норадреналина и их метаболитов, а также высокая агрессивность, сходные с описанными при точечной мутации этого гена у человека. Как показали наши исследования, для мышей с генетическим нокаутом МАО А характерно снижение исследовательского поведения и усиление разных видов агрессивного поведения. Важной особенностью нокаутных мышей является их асоциальность. Нормальные мыши интенсивно дерутся только впервые часы после создания новой группы, затем в сообществе устанавливается определенная иерархия и жестоких драк не происходит. В отличие от них, в группе МАО А-нокаутов драки не прекращаются, приводя к гибели части животных. Другой особенностью мышей с отсутствующим геном МАО А является сниженная реакция на большинство видов острого стресса и на хронический стресс.
Важный вывод, вытекающий из уже известных данных по нокаутным мышам, заключается в том, что отсутствие одного рецептора или фермента, даже очень важного для функционировании нескольких медиа- торных систем, каким является МАО Ане приводит к всеобщей дезорганизации регулируемых этими медиаторами функций. Стратегия генетического нокаута отчетливо демонстрирует менделевский принцип один ген — один белок. Разрушение гена, контролирующего синтез определенного белка, приводит к полному отсутствию этого белка — фермента или рецептора в организме. Однако другой принцип один ген — одно нарушение функции (one gene, one disorder) (Plomin et al., 1994), как правило, не выполняется.
Это соответствует распространенному как в генетике, таки в физиологии представлению о том, что любая сложная физиологическая функция или поведение регулируется не одним генома ансамблем генов и, соответственно, по крайней мере несколькими медиатор- ными системами. Все это свидетельствует о сложности и многофакторности регуляции любого адаптивно значимого вида поведения и огромных компенсаторных возможностях организма. Это делает нокаутных мышей не только уникальной моделью для изучения наследственных психопатологий, но и ценной моделью для выявления механизмов их компенсации.
МОНОАМИНОКСИДАЗА А
Фермент метаболизма серотонина, дофамина и норадреналина, которые регулируют:
поведение;
эмоции;
реакцию на стресс
•
•
•
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НОКАУТ МАО А
Увеличение в мозге уровня серотонина, дофамина и норадреналина. В результате:
агресивность, «асоциальность»;
снижение иследовательского поведения;
снижение реакции на стресс;
устойчивость к алкоголю 0
0.1 0.2 0.3 0 1 2 3 4 5 Дни 15 20 25 30 8 9 10 11 12 13 14 Дни 24 0 1 2 3 4 5 Дни
Биолюми- несценция
(10 3
мин
-1
)

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
33
ному повреждению (Xiao-Wei Tan et al., 2005). Клетки плода были обнаружены в материнском организме спустя месяц после родов, причем некоторые из них дифференцировались в нейроны. Это позволяет предположить участие эмбриональных стволовых клеток в восстановлении поврежденных отделов материнского мозга. (Подобные научные сведения могут быть с пользой применены нашими политиками, агитирующими российских женщин рожать больше и чаще).
Применение трансгенных конструкций не ограничивается визуализацией движения клеток оно также позволяет проводить прямую регистрацию экспрессии любых интересующих исследователя генов. В качестве примера можно привести работы из области регуляции циклических процессов, протекающих с суточным или околосуточным (циркадным) периодом в живых организмах. Еще в е гг. экспериментами на изолированных органах и тканях многоклеточных организмов доказано, что многие из последних обладают способностью к самостоятельной генерации суточных ритмов. Но как работают эти задающие ритм механизмы в рамках целого организма или, как это бывает в иерархически организованных колебательных системах, основную роль водителей ритма выполняет центральный механизма все периферические компоненты меняют свою функциональную активность под влиянием команд из центра?
Показателем самостоятельности периферических водителей ритма может быть цикличность экспрессии известных к настоящему времени часовых генов. Для наблюдения за уровнем генной экспрессия были созданы трансгенные мыши, у которых промотор одного из часовых генов (Per1) запускал также экспрессию гена люцеферазы (фермента, катализирующего образование люминесцирующего продукта. При введении в организм субстрата для этого фермента с помощью оптического зонда можно было наблюдать активацию гена лю- цеферазы. Оказалось, что интенсивность свечения при этом в разных органах варьировала с околосуточным периодом, что доказывает самостоятельность работы периферических компонентов часового механизма.
Мышь-биореактор
Выше упоминалось, что трансгенных мышей можно также использовать в биотехнологических циклах, хотя на первый взгляд этот грызун как продуцент чего-либо полезного выглядит достаточно сомнительно. Ноне- оспоримым достоинством мыши является то, что она относится к наиболее освоенным объектам генной инженерии Таким образом, к настоящему времени созданы предпосылки для получения таких генно-инженерных систем, которые позволяют запускать или подавлять экспрессию нужного гена у лабораторной мыши в любой заданный момент времени простым введением антибиотика. К этому можно добавить, что имеются и другие трансгенные конструкции, обеспечивающие подавление экспрессии целевого гена или генов в нужном месте (тканеспецифическое управление работой генов).
Лучше один раз увидеть…
Упомянутый выше ген GFP используется не только для демонстрации работоспособности Tet-off/Tet-on- конструкций. Например, клетки, полученные от животных с постоянной экспрессией этого гена, можно наблюдать при их введении в организму которого этого гена нет.
Ярким примером подобного использования служат работы, посвященные изучению миграции плодовых клеток в материнском организме. Дело в том, что клинические исследования показали, что в тканях женщин можно обнаружить мужские клетки, несущие Y-хро- мосому (Bianchi et al., 1996). Единственный, не мистический путь появления подобных клеток в женском организме — их миграция через плацентарный барьер при вынашивании мальчика. Такой микрохимеризм
послужил основой для дискуссии о патогенетической роли плодовых клеток, поскольку последние с большей вероятностью обнаруживаются у женщин, страдающих аутоиммунными заболеваниями (Johnson, Bianchi,
2004). Но чтобы ответить на вопрос, являются ли им- мунологически чужеродные клетки причиной болезни или они лишь накапливаются в поврежденных тканях, необходимы детальные исследования перемещения этих клеток в материнском организме как в норме, таки при экспериментальных повреждениях.
Сделать это непросто, поскольку таких клеток немного, а Y-хромосома является хотя и надежным, ноне слишком заметным маркером. Существенно облегчить решение сложной задачи могут все те же зеленые трансгенные мыши, производящие GFP. Для этого нужно лишь скрестить зеленых самцов с обычными самками, а затем проследить пути миграций экс- прессирующих клеток в материнском организме.
С использованием этого подхода было, в частности, обнаружено наличие некоторого числа мужских клеток в тканях мозга самок, причем чаще всего они встречались в отделах, подвергнутых эксперименталь-
АМСТИСЛАВСКИЙ Сергей Яковлевич — доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий сектором криоконсервации и репродуктивных технологий Института цитологии и генетики СО РАН. Автор более 80 научных публикаций
Криоархивирова- ние на примере куницеобразных
В настоящее время кроме homo
sapiens на Земле обитает еще около 4600 видов млекопитающих. Численность многих из них стремительно сокращается, о чем убедительно свидетельствует Красная Книга (https://www.redlist.
org). Приведем один конкретный пример из 37 видов семейства
Felidae, лишь судьба домашней кошки не вызывает опасения. Ареал же диких видов кошачьих непрерывно сокращается, многие из них уже занесены в Красную Книгу. Почти столь же остро стоит проблема ив других семействах отряда хищных
(Carnivora). Список исчезающих видов куницеобразных, а именно об этом семействе пойдет речь в этом разделе, тоже достаточно впечатляющий, В связи стем, что традиционные методы сохранения млекопитающих или ex situ требуют боль-
Детеныши, рожденные в результате трансплантации бластоцист европейской норки хонорику. Фото В. Циндренко
ших финансовых затрат, все более популярными становятся криобанки, в которых можно сохранять генофонд этих видов (Амстиславский, Другая причина резко возросшей в последнее время популярности методов репродуктивной биотехнологии заключается в том, что стремительное увеличение числа трансгенных и нокаутных линий мышей создает необходимость их архивирования. Уже существует около тысячи линий крыс и около десяти тысяч линий мышей (Abbott, 2004). Большая часть этих линий создана в результате трансгенеза, мутагенеза или нокаутирования отдельных генов. Предполагается, что в течение следующих двух десятилетий общее число мышиных линий достигнет
300 000. По образному выражению А. Эбботт, генетики должны готовиться к потопу (Abbott, 2004). Зарубежные специалисты по лабораторным животным единодушны в том, что проблему резкого возрастания числа линий лабораторных животных можно решить путем создания криобанка для сохранения этих ресурсов. В настоящее время уже создана Международная федерация генетических центров, снабженных криобанками. В них сохраняют замороженные эмбрионы и сперматозоиды, из которых по мере надобности можно путем эмбриотрансплантации и (или) искусственного осеменения восстановить требуемую линию. В эту федерацию — FIMRe
(Federation of International Mouse Resources) вошли ведущие центры Северной Америки, Западной Европы, Японии и Австралии.
В настоящей статье мы расскажем о наших исследованиях, выполненных в содружестве трех институтов (Института цитологии и генетики СО РАН, Института систематики и экологии животных СО РАН и Института прикладной биотехнологии университета г. Куопио, Финляндия) по разработке репродуктивно-биологических подходов и криотехнологий, направленных на консервацию исчезающих видов куницеобразных. Работа поэтому проекту изначально велась на хорьках и отчасти на горностаях. Цель первого этапа — показать, что эмбрионы куницеобразных

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
35
среди млекопитающих. Поэтому когда возникла идея получать человеческие антитела не от вакцинированных людей, а от других животных, ученые обратились именно к мышам. Были получены трансгенные животные, у которых мышиные гены, кодирующие легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов, были заменены на соответствующие гены человека (Jakobovits et al., Создание таких животных шло в несколько этапов. Сначала были получены линии мышиных эмбриональных стволовых клеток, у которых путем нокаута инактивированы гены собственных иммуноглобулинов, а также линии, в которые были внедрены гены иммуноглобулинов человека. На основе этих линий получены трансгенные мыши. При их скрещивании выделена линия XenoMouse, у которой мышиные иммуноглобулиновые гены полностью замещены соответствующими генами человека.
Таким образом, появилась возможность использовать мышиную систему иммунного распознавания чужеродных антигенов для получения клонов лимфоцитов, вырабатывающих специфические иммуноглобулины человека. На их основе можно создавать
гибридомы — клеточные линии, полученные путем слияния иммунных клеток с опухолевыми, которые производят моноклональные антитела поуже известной технологии.
способны переживать криоконсервацию при температуре жидкого азота, т. к. на момент начала проекта в мире не было ни одного позитивного результата. Более того, способ замораживания эмбрионов хищных млекопитающих вообще отсутствовал, была лишь одна успешная попытка в 1988 г. Б. Дрессер с соавторами США) получили живых котят из эмбрионов, которые хранились в криобанке (Dresser et al., 1988). Задача этого этапа — поиски разработка адекватных способов получения эмбрионов куницеобразных и их трансплантации. В качестве экспериментальной модели выбран черный хорек (Mustela putorius) и его одомашненная форма — хорек фуро (Mustela putorius furo), которые являются ближайшими родственниками исчезающей европейской норки. Кроме того, первые эксперименты по криоконсервации эмбрионов проводились нами также и на эмбрионах горностая (Mustela erminea)
(Amstislavsky et al., 1996; Кизилова и др, На уникальной ферме куницеобразных, основанной супругами Терновскими в конце 1960 — начале х гг. в Академгородке (Ternovskaya et al., 2006), нами проведены успешные трансплантации эмбрионов между разными хорьками. Показательны эксперименты по трансплантации эмбрионов между хорьком фуро и черным хорьком. Однако неоднократные попытки получить живое потомство после пересадки эмбрионов хорька, прошедших полный цикл замораживания, не привели к желаемому результату. В этот период мы полностью осознали, насколько капризны эмбрионы хищных в плане их заморозки и почему подавляющее большинство попыток замораживания эмбрионов псовых и кошачьих заканчивались неудачей. Дело в том, что в эмбрионах хищных
(Carnivora) содержится много липидных гранул, которые чувствительны к процедурам криоконсервации. В эмбрионах же лабораторных грызунов и большинства видов сельскохозяйственных животных этих гранул существенно меньше. Именно по этой причине во всем мире большинство попыток получить потомство после криоконсервации зародышей хищных заканчивались неудачей.
К этому времени у нас накопился достаточный опыт ив изучении репродуктивной биологии куницеоб- разных, ив практической трансплантации эмбрионов разных видов млекопитающих.Более того, к этому моменту мы разработали оптимальную биологическую модель трансплантации эмбрионов хорька. В связи с этим С. Я. Амстиславский был приглашен в Институт прикладной биотехнологии университета г. Куопио Финляндия) для участия в проекте по трансплантации и криоконсервации эмбрионов хорька.
Ранее автором было замечено, что основные (видимые в световой микроскоп) структурные нарушения эмбрионов хорька и горностая, подвергавшихся процедурам замораживания и криоконсервации, наступают лишь на этапе отмывки от криопротектора. Возникла идея исключить этот этап и сразу из соломины в среде,
Морула европейской норки (Mustela lutreola) при световой микроскопии. Темный цвет обусловлен обилием липидных гранул, из-за которых большинство попыток получения потомства после криоконсервации зародышей хищных заканчивалось неудачей. Фото Е. Кизиловой
В 1972 г. был открыт способ криоконсервации эмбрионов мышей, а в 1976—1978 гг. — заложен первый криоархив (в Джексоновской лаборатории, Бар Харбор, США) В 2005 г. — создана мировая федерация мышиных ресурсов (FIMRe), куда вошло
17 центров (Mammalian Genome, Развитие эмбрионов хорька в культуре in vitro после криоконсервации:
а. Эмбрионы хорька до замораживания.
б. Те же эмбрионы после криоконсервации.
в. Те же эмбрионы после четырех дней культивирования.
г. На восьмой день культивирования один из зародышей прикрепился ко дну чашки Петри
18 16 14 12 8
6 4
2 Число криобанков
1975 1980 1985 1990 1995 2000 Первыми такими иммуноглобулинами, прошедшими клинические испытания, стали антитела против ин- терлейкина-8, которые использовали для подавления иммунных процессов при обострении псориаза. Принципиально важным можно считать тот факт, что ни у одного из пациентов не было выявлено аллергической реакции на эти иммуноглобулины (Davis et al., В настоящее время стадию предклинических и клинических испытаний проходят более десяти вариантов моноклональных антител, полученных с использованием трансгенных мышей линии XenoMouse. В основном это антитела против различных факторов роста или их рецепторов, применение которых позволяет ограничить рост злокачественных опухолей, и даже более вызывать их обратное развитие
(Jakobovits et al., В перспективе — мышиное наводнение
Итак, расшифровка геномов человека и многих лабораторных животных, вкупе с развитием генно-инженер- ных технологий, открыли практически неограниченные возможности для создания живых экспериментальных моделей. Уже сегодня общее число генетических линий истоков мышей, содержащихся в мировых центрах
«мышеводства», перевалило за 20 тысяч.
И число их продолжает стремительно увеличиваться. Достаточно сказать, что один только проект
KOMP (Knockout Mouse Project — Проект «нокаутные мыши, организованный по инициативе Национального института здоровья США, нацелен на создание линий мышиных эмбриональных стволовых клеток с нокаутами по каждому гену. Таким образом, по завершению этого проекта будет получено около 25 тысяч новых клеточных линий (Austin, et al., 2004)! И произойдет это достаточно скоро один из участников проекта
(Wellcome Trust Sanger Institute) информировал, что его производственные мощности позволяют получать
5 тысяч клеточных линий в год.
В проекте также предусмотрено финансирование работ по оптимизации технологии получения нока- утных мышей на основе вновь созданных линий эмбриональных стволовых клеток по информационному обеспечению по развитию систем хранения и распределения мышей с различным генотипом. Всего в проекте участвует 19 институтов и научно-исследовательских центров, работающих в разных областях биологии и биомедицины.
а
б
в
г

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
37
содержащей криопротектор, пересадить эмбрионы в матку реципиента. Сложность осуществления задуманного заключалась в том обстоятельстве, что глицерин и ДМСО (диметилсульфоксид, которые использовались в качестве криопротекторов при замораживании эмбрионов, очень токсичны. Помог счастливый случай. Именно в это время начинал входить в моду этиленгликоль, менее токсичный криопротектор, который мы и решили попробовать вместо ДМСО и глицерина. Кроме того, еще в Новосибирске, нами отрабатывалась процедура трансплантации эмбрионов в минимальном объеме среды. Это «ноу-хау» оказалось особенно важным теперь, когда мы решили трансплантировать эмбрионы непосредственно в матку, минуя этап отмывки от криопротектора.
Уже в самом начале финского этапа международного проекта удалось получить обнадеживающий предварительный результат. Мы показали, что эмбрионы хорька, прошедшие цикл «замораживания—криокон- сервации—размораживания» с этиленгликолем, способны возобновить дальнейшее развитие в условиях
in vitro вплоть до завершающего этапа — имплантации
(Amstislavsky et al., 2000). Вскоре нам удалось получить и живых хорчат после криоконсервации эмбрионов. Именно трансплантация без отмывки оказалась наиболее успешной. После трансплантации с отмывкой также родились хорчата, но их было намного меньше, чем при первом инновационном) подходе (Lindeberg et al., 2003). Попутно мы подробно исследовали биологическую модель трансплантации эмбрионов у этого вида (Lindeberg et al., 2002). Изучили, сколько эмбрионов нужно пересаживать реципиенту, на какой день псевдоберемен- ности, какова должна быть точность синхронизации донора и реципиента и т. д. Все это было очень важно для успеха проекта, т. к. из практики работы на разных видах млекопитающих, в том числе на лабораторных и сельскохозяйственных, нам было хорошо известно, чем больше имеется эмбрионов перед началом замораживания и чем эффективнее отработаны методы их трансплантации, тем выше шанс получить позитивный результат (Амстиславский и др, После пресс-конференции в 2001 г, наша группа стала своего рода знаменитостью в Финляндии. Результат, так впечатливший журналистов, действительно интересный. На тот момент это был первый в мире успех криоконсервации зародышей вида, принадлежащего к отряду Carnivora, не учитывая опыт с зародышами домашней кошки. Фотографии хорчат опубликовали во многих газетах, в том числе ив. В дальнейшем мы возобновили эксперименты по эмбриотехнологии куницеобразных на базе фермы Тер- новских. Эти работы были поддержаны в 2002—2006 гг. совместным проектом Российской и Финской академиями наук. То, что экспериментальная активность по проекту вновь переместилась в Новосибирск, было связано с важным обстоятельством в мире существует лишь четыре фермы, где в неволе разводят ближайшего исчезающего родственника хорька — европейскую норку. Еще каких-то 100—150 лет назад ареал его распространения простирался по всей Европе и даже доходил до бассейна р. Оби (Schreiber et al., 1989; Тер- новский, Терновская, 1994). К настоящему времени от этого ареала остались лишь три островка, а именно западная популяция в Пиренеях, южная популяция в дельте р. Дунай и северо-восточная популяция в России и Белоруссии. Однако, несмотря на осознание проблемы научной общественностью и экологами, исчезновение этого вида продолжается. Размножающиеся в неволе европейские норки становятся главным гарантом того, что этот вид полностью не исчезнет, и именно эти особи, способные размножаться в неволе, станут основой для изучения репродуктивной биологии данного вида и экспериментов по ре-интро- дукции в природу (Терновский, Терновская, Европейскую норку разводят в неволе в Эстонии, Германии, Испании, нов новосибирском Академгородке это стали делать первыми в мире. И несмотря на то, что инвестиции в зарубежные фермы (особенно в недавно отстроенный центр в Испании) несравнимы с затратами на поддержание фермы Терновских, именно здесь плодовитость при размножении данного вида остается наиболее высокой по сравнению с зарубежными. Тиит Маран — один из лидеров в области сохранения европейской норки, руководитель центра в Эстонии, где этого зверя также разводят в неволе, и, пожалуй, один из самых авторитетных экспертов поэтому виду в мире (https://www.
lutreola.ee/), не перестает этому удивляться!
Именно на базе фермы Терновских, начиная с 2002 г, мы сосредоточились на изучении репродуктивной биологии европейской норки и разработке эмбрио- технологических подходов к консервации этого вида. Мы попробовали создать эффективную модель трансплантации эмбрионов гибридам европейской норки и хорька. Таких гибридов, носящих название хонорики и нохорики, в течение многих лет получают на ферме
ИСиЭЖ СО РАН. Хонорики — гибриды самца хорька и самки европейской норки — впервые были получены супругами Терновскими (Терновский, Терновская,
1994). Этот метод широко вошел в практику, и сейчас слово «хонорик» уже никого не удивляет. Обратное скрещивание — самки хорька с самцом норки, — впервые осуществлено в 2001 г, и пока «нохорики» получены только на ферме Терновских (Ternovskaya et al., Гибридизация хорька и норки может наблюдаться ив природе. Кстати, это явление считают одной из причин исчезновения европейской норки. Мы попытались обратить феномен гибридизации с хорьком во благо исчезающего вида и добились успеха. В 2002—2004 гг. мы трансплантировали в общей сложности эмбрионов норки девяти самкам хонорика. При этом родилось 28 детенышей. Кроме того, 16 эмбрионов европейской норки трансплантировали трем самкам нохорика, из которых родилось 8 норчат. Таким образом, при обоих типах трансплантации эффективность составила. Один раз мы пересадили самке хонорика 5 эмбрионов норки и 5 эмбрионами хорька. В итоге на свет появился выводок, состоящий из норчат и хорчонка. Этот результат так понравился редакторам журнала
«Reproduction Fertility and Development», что фотография этого выводка была вынесена на обложку журнала.
(Amstislavsky et al., Ив самом деле, случай уникальный родными, а точнее, единоутробными братьями и сестрами стали представители разных видов — хорька и норки. Несмотря на эти успехи остаются еще важные проблемы, требующие решения. Так, например, эффективность криоконсервации эмбрионов куницеобразных остается пока низкой лишь 11 % эмбрионов хорька подвергшихся «замораживанию—криоконсервации—транс- плантации, развились в живых хорчат. Это гораздо ниже эффективности процедур трансплантации для лабораторных или некоторых сельскохозяйственных животных. Кроме того, прямая трансплантация между европейской норкой и хорьком пока не приводит к рождению потомства. При попытках межвидовой трансплантации эмбрионов, даже между близкородственными видами чаще всего возникают проблемы, обусловленные Один из первых выводков, полученных в 1998 г. после трансплантации эмбрионов хорька, прошедших полный цикл замораживание – криоконсервация – размораживание.
Фото Хели
Линдеберг
C. Я. Амстиславский проводит трансплантацию эмбрионов хорька, подвергавшихся замораживанию и криоконсервации. В результате трансплантации родилось живое потомство. Фото Хели Линдеберг
ГОРИЗОНТЫ НАУКИ

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
39
различием гормональных и иммунных механизмов поддержания беременности у этих видов. Для преодоления межвидового барьера необходимо хорошо изучить их репродуктивную биологию (Ам- стиславский, 2006). В заключение хотим отметить, что в результате этого проекта впервые показана принципиальная возможность криоконсервации эмбрионов куницеобразных и создана модель трансплантации эмбрионов исчезающего вида — европейской норки. Следует отметить, что наши разработки высоко оцениваются. В
2003 г. на Первой международной конференции по сохранению европейской норки (Logrono, Spain) это направление было одобрено и получило официальное признание в резолюциях конференции. В 2008 г. нами получен грант РФФИ (№ 08-04-49088) для изучения межвидового репродуктивного барьера между европейской норкой и хорьком и разработки подходов к его преодолению, и уже есть первые результаты (Amstislavsky et al.,
2008). Эти успехи дают надежду на развитие животных, работу нервной и нервно-мышеч- ной систем. Этот первичный анализ затем дополняется гематологическими, иммунологическими, биохимическими и эндокринными данными. Наследующем этапе животные, отобранные на основе фенотипиче ского скрининга, подвергаются генетическому анализу, который позволяет установить точную локализацию нуклеотидной замены и, соответственно, определить ген, в котором произошла мутация.
Всего с момента основания Мюнхенского проекта
(1997) и до настоящего времени проведен скрининг более чем 30 тысяч мышей и получено более 750 линий, на которых проводятся исследования генетических основ отклонений в строении тела, предрасположенности к аллергиям, нарушениям нервной деятельности и обмена веществ. Помимо полученных в последние годы трансгенных и мутантных мышей и крыс никто не сбрасывает со счетов другие генетические линии животных, полученные в результате направленной селекции, которые традиционно поддерживаются в вивариях. Некоторые из них являются уникальными объектами для изучения генетических механизмов таких социально значимых болезней, как артериальная гипертензия, преждевременная старость, психические расстройства и др. Кроме того, эти линии неоценимы для испытаний новых лекарственных препаратов и при разработке немедикаментозных средств профилактики и лечения болезней.
К имеющемуся списку животных-моделей следует добавить панели рекомбинантных линий, которые широко используются в генетике количественных признаков.
Таким образом, с помощью разных методов уже сегодня получены тысячи генетических линий лабораторных мышей. А согласно прогнозу, опубликованному четыре года назад в Nature, кг. их число достигнет 300 тысячи, как пишет автор статьи, генетики уже сегодня готовятся к мышиному потопу (Abbot, 2004). Строим криодамбы*
В соответствии с общепринятыми нормами для поддержания одной линии мышей в живом разведении требуется 10—12 пар племенных животных и, как минимум, 50 голов ремонтного молодняка. Все это количество можно разместить примерно в 3 м вивар- ного помещения. Пока речь идет о десятках генотипов, такой подход кажется вполне приемлемым, но если Реальный опыт применения репродуктивных технологий для сохранения генофонда. На примере куницеобразных
ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
дальнейшее развитие этого направления, а также на то, что на базе изучения специфики репродуктивной биологии этого вида и его ближайших сородичей рано или поздно будет создан оптимальный пакет репродуктивных технологий, который позволит сделать криобанк эмбрионов одним из основных инcтрументов сохранения европейской норки. Другим основанием для оптимизма является то, что американский сородич европейской норки, черноногий хорек (Mustela nigripes), который еще недавно считался исчезающим видом, и даже существовало убеждение, что он безвозвратно исчез, в настоящее время практически находится вне опасности (Grenier et al., 2007). А ведь именно серьезное изучение репродуктивной биологии этого вида куницеобразных, отработка методов разведения в неволе и ре-интродукции, а также применение репродуктивных биотехнологий как ключевого элемента всей программы обеспечило этот успех.
Литература
Амстиславский С. Я. и др. Методы биотехнологии в практике разведения
животных. — Новосибирск Изд-во ИЦиГ, 1991. — 170 с.
Амстиславский С. Я. Эмбриотехнологические подходы к сохранению исчезающих
видов млекопитающих дисс. д-ра биол. наук. — Новосибирск, 2006. — 265 c.
Кизилова Е. Аи др. Влияние криоконсервации на морфологию бластоцист
хорька // Онтогенез. — 1998. — Т. 29. — С. 1—8.
Терновский Д. В, Терновская ЮГ. Экология куницеобразных. — Новосибирск
Наука, 1994. — 223 с.
Abbott A. Genetisists prepare for deluge of mutant mice // Nature. — 2004. —
N. 432. — 541 р.
Amstislavsky S. et al. Embryo cryobanking for conserving laboratory and wild animal
species // Scand. J. of Lab. Anim. Science. — 1996. — N. 23. — Р. 269—277.
Amstislavsky S. et al. Ex-situ preservation of Mustelidae: primer of application
of genetic resource bank concept with the use of polecats as the model species //
Scientifur. — 2000. — N. 24. — Р. 45—58.
Amstislavsky S. et al. Transfer of European mink (Mustela lutreola) embryos into
hybrid recipients // Theriogenol. — 2004. — N. 62. — Р. 458—467.
Amstislavsky S. et al. Embryo development and embryo transfer in the European mink
(Mustela lutreola), an endangered mustelid species // Reprod. Fertil. Dev. — 2006. —
N. 18. — Р. 459—467.
Amstislavsky S. et al. Conservation of the European Mink (Mustela lutreola): Focus
on Reproduction and Reproductive Technologies // Reprod. Domest. Anim. — 2008. —
N. 43. — Р. 502—513.
Dresser B. L. et al. First successful transfer of cryopreserved feline (Felis catus)
embryos resulting in live offspring // J. Exp. Zool. — 1988. — N. 246. — Р. 180—186.
Grenier M. B. et al. Rapid population growth of a critically endangered carnivore //
Science. — 2007. — N. 317. — 779 р.
Lindeberg H. et al. Surgical transfer of in vivo produced farmed European polecat
(Mustela putorius) embryos // Theriogenology. — 2002. — N. 57. — Р. 2167—2177.
Lindeberg H. et al. Surgical recovery and successful surgical transfer of conventionally
frozen-thawed embryos in the farmed European polecat (Mustela putorius) //
Theriogenology. — 2003. — N. 60. — Р. 1515—1526.
Schreiber A. et al. Weasels, Civets, Mongooses and their relatives. An action plan for
conservation of Mustelids and Viverrids. — USA: Kelvin Press, 1989. — 99 р.
Ternovskaya Y. et al. Strategies for European mink preservation: International
Conference on Conservation of European Mink. 5—8, 2003, Logrono, Spain, Proceedings
Book // Gobierno de la Rioja, 2006. — Р. 267—279.
К вышесказанному следует добавить, что работы по созданию коллекций эмбриональных стволовых клеток мышей с нокаутами по разным генам сегодня ведутся в Европе, Канаде и Японии. Иными словами, реальность получить в недалеком будущем настоящее мышиное наводнение уже не вызывает сомнений.
Помимо трансгенной технологии, важным источником генетического разнообразия модельных животных являются точечные мутации. Их получают при введении животным N-этилнитрозомочевины
(N-ethylnitrosourea — ENU): этот химический мутаген вызывает единичные замены нуклеотидных оснований, что может оказать значимое влияние на функцию конкретного гена.
Достоинством данного метода является его простота для получения точечной мутации достаточно однократной инъекции ENU. Однако в отличие от генотипов, полученных с использованием генно-инженерных технологий, местоположение мутации, вызванной химическим мутагеном носит случайный характер. Поэтому требуется проведение значительной работы по ее идентификации, которая начинается с отбора мышей, чей фенотип представляет интерес для дальнейших исследований.
Наиболее масштабные работы по созданию таких генетических моделей мышей выполнены в рамках Мюнхенского ENU проекта. Особо стоит отметить экспресс-методы фенотипического описания мышей, которые были разработаны при его реализации (стандартный протокол фенотипирования включал в себя
135 морфологических, поведенческих и физиолого- биохимических параметров).
Один из наиболее удачных стандартизированных протоколов первичного описания животных, который сейчас используется в разных странах мира, предложен британскими учеными. Он известен по аббревиатуре
SHIRPA, в которой последние две буквы (phenotype
assessment) относятся к содержанию методического подхода, а остальные ведут происхождение от названий университетов и колледжей, в которых протокол разработан позволяет в течение 15 минут описать мышь по 58 параметрам, отражающим основные экстерьерные характеристики, показатели двигательной активности и некоторые рефлекторные реакции. Отклонение по этим параметрам является индикатором фенотипически значимых мутаций в генах, контролирующих рост и Этот и следующий разделы написаны совместно с С. Я. Амстиславским
*

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
41
СОЛЕНОВ Евгений Иванович — доктор биологических наук, доцент, старший научный сотрудник Института цитологии и генетики СО РАН. Лауреат премии Л. А. Орбели, 1998 г. Автор 92 научных работ речь идет о тысячах и сотнях тысяч линий, то поддержание мышиных ресурсов в форме племенных ядер становится невозможным. Выход из тупикового положения — это создание криоархивов. Сегодня коллекции генетических линий животных могут сохраняться в виде замороженных эмбрионов, сперматозоидов, яйцеклеток и даже яичниковой ткани. Однако ведущие архивы генотипов делают ставку прежде всего на эмбрионы. Эмбрион диплоидный организм, тогда как сперматозоиды и яйцеклетки гаплоидны, поэтому для полноценного архивирования генетической линии можно консервировать либо эмбрионы, либо гаметы обоего пола. Первый путь экономически более оправдан, поскольку второй предполагает еще один технологический этап размороженные сперматозоиды и яйцеклетки должны соединиться, чтобы образовать эмбрион.
Эмбрион — это уже особь. И хотя эта особь состоит всего лишь из нескольких клеток, у него уже есть программа развития, закодированная в геноме. Поэтому для восстановления линии достаточно трансплантировать размороженные эмбрионы самкам-реципиентам, где они продолжат свое развитие. Большинство экспертов сходятся на том, что для надежной консервации требуется 200—500 эмбрионов. Однако как свидетельствует мировой опыт, генетическую линию удается иногда восстановить всего лишь из
20 эмбрионов.
Полтысячи эмбрионов легко упаковываются в объем около 0.3 л, что на четыре порядка меньше, чем объем, необходимый для поддержания линии живых мышей. Кроме того затраты на корм, подстилку и обслуживание существенно дороже, чем затраты на консервацию (жидкий азот и его регулярную доливку в сосуд Дьюара. Но как долго можно сохранять эмбрионы в замороженном состо-
«Видеть насквозь»
У многих людей эксперименты на животных ассоциируются исключительно с вивисекцией, хотя бы и под анестезией. Это неверно. К настоящему времени создано множество методов, позволяющих исследовать животных, их различные формы поведения, физиологические и биохимические процессы без существенного вреда для жизни животного и даже без ущерба его здоровью. Прогресс в развитии таких подходов связан не столько постепенным развитием морали в человеческом обществе, сколько из прагматических соображений научные данные, полученные на нетравмированном, здоровом животном наименее искажены артефактами эксперимента. Многие из этих методов имеют значительную историю, и их современное развитие связано главным образом с обеспечением комфортных условий для экспериментального животного и для самого экспериментатора. Наряду с совершенствованием традиционных методов, в последние годы достигнуты впечатляющие успехи в разработке принципиально новых подходов к визуализации внутренних структур и внутренних процессов. паратура, позволяющая вызывать и регистрировать излучение нативных молекул в клетках или межклеточном пространстве, в толще тканей при этом особенно интересуются мозгом) сейчас считается очень перспективной и разрабатывается во многих ведущих медицинских университетах мира. Традиционное рентгеновское исследование в настоящее время также получило новые функции. Появилась аппаратура, способная анализировать спектральный состав проходящих Х-лучей и на этой основе изучать состав костной, жировой и других тканей, что необходимо при исследовании моделей ряда заболеваний, связанных сна- рушением минерального и жирового обмена. Одновременно с развитием исследований организма с применением электромагнитных излучений, о которых говорилось выше, развивались и совершенствовались традиционные инвазивные методы. Многие из них сейчас уже нельзя называть кровавыми, настолько незначительны повреждения вор- ганизме при их применении. Для решения многих прикладных и фундаментальных задач исследователям необходимо знать концентрацию тех или иных веществ в изучаемой ткани или, наоборот, вводить заданные количества препаратов в определенные органы. Причем желательно это делать незаметно для животного, и уж точно эта процедура должна быть безболезненна. Традиционно это делалось, в лучшем случае, методом биопсии — процедуры для которой часто применялся наркоз. Сейчас же создан спектр микродиализных приборов, которые могут безболезненно находиться в теле постоянно и позволяют брать пробы тканевой жидкости или вводить тестируемое вещество незаметно для животного. Закончить этот краткий обзор некоторых современных методов, применяемых в биомедицинских исследованиях хочется на философской ноте. Все, даже самые Картина движущейся крови в мозге крысы Прижизненное прослеживание пути стволовых клеток, проникающих в мозг мыши после экспериментального воздействия, моделирующего инсульт
Лидирующие позиции здесь занимает томография, которая позволяет получать изображение внутренних органов слоями и воссоздавать с помощью компьютера их трехмерное изображение. В зависимости от физических принципов, заложенных в эти приборы, они видят разные ткани организма по-разному. Так ткани мозга содержат относительно много воды (здесь Аристотель был прав, и, следовательно, атомов водорода, поэтому мозг лучше разглядывать с помощью ЯМР- томографа. Для мышей, имеющих малые размеры, необходимо иметь и соответствующие мышиные приборы. И такие машины созданы. Инженеры сумели повысить разрешение ЯМР-томографов до десятков микрон (!) — неплохая точность даже в масштабах мышиных органов. Каждый такой прибор очень дорогой и непосилен для академической лаборатории, занимающейся фундаментальными исследованиями. Таким прибором может владеть только центр коллективного пользования, который сделает исследования доступными для многих лабораторий. И здесь в очередной раз становится очевидным обеспечение дорогостоящих экспериментов высококачественными стандартизированными животными, использование которых позволяет получить надежные результаты при небольшом количестве повторов.
Чего ради идти на такие траты Ради возможности изучать все более глубокие фундаментальные процессы жизни организма. Один из самых современных образцов такого инструмента — Bruker Bio
Spin, который предполагается приобрести для комплектации ЦКП генетических моделей, обладает программами, позволяющими выделять движущиеся ткани кровь, сердечную мышцу, и открывают заманчивые возможности исследования наживой нетравмированной мыши. Этот же прибор, точнее приборный комплекс, способен допол- лучшие методы имеют и свои отрицательные стороны. Для тех методов, о которых говорилось выше, положительная сторона — это их эффективность, а отрицательная — дороговизна и сложность применения. Для проведения исследований такими методами надо вкладывать значительные средства в приборы, воспитывать специалистов высокого уровня и оплачивать их работу. Но результаты окупают все. Вспоминается библейская притча о талантах, где говорится, что больше добавится тому, кто богаче…
нять информацию, получаемую в новой, считающейся очень перспективной, области радиомедицины, томографии с применением позит- рон-эмитирующих изотопов (PET). Есть еще исключительно привлекательная функция, заложенная в современный исследовательский
ЯМР-томограф, это его способность проводить спектроскопический анализ вещества в заданной точке живого нетравмированного организма. Значительный прогресс происходит ив методах оптического исследования организма. Тенденция та же, поиск путей исследовать животное, сохраняя ему жизнь, а по возможности и комфорт. Светочувствительные приборы, способные регистрировать отдельные кванты света, позволяют видеть светящиеся молекулы-трассеры прямо сквозь ткани мыши, правда, мышь должна быть как минимум белая, а лучше и вовсе голая, такие тоже бывают. Сейчас уже проводятся исследования роста и метастазирования опухолей, клетки которых мечены генами, производящими светящий белок — люциферазу. Однако возможно оптическое наблюдение белков, которые сами в обычных условиях света не производят, но генерируют его в результате возбуждения внешним излучением. Такой индуцированный свет позволяет видеть молекулярные структуры, которые его излучают даже сквозь ткани организма. Ап-
ГОРИЗОНТЫ НАУКИ

ГОРИЗОНТЫ НАУКИ
43
Для обеспечения стандарта лабораторных животных содержат в чистых помещениях, куда под избыточным давлением подается стерильный воздух. Корм, вода, подстилка и клетки поступают вчистую зону вивария после предварительной стерилизации криобанке, нисколько не потеряли своей способности оживать. Поучительна и история, связанная с созданием первого в мире (и пока самого крупного) криобанка мышиных генотипов Джексоновской лаборатории (США. Поводом к его строительству стал пожар, случившийся в 1947 г, который уничтожил значительную часть коллекции традиционно разводимых там линейных животных. Поэтому как только технологии криохра- нения эмбрионов мышей были разработаны, их тотчас же реализовали в этом мировом генетическом центре. И когда в 1989 г. в лаборатории случился еще более разрушительный пожар (он бушевал более пяти часов и унес жизни около полумиллиона мышей, криобанк стал настоящей «палочкой-выручалочкой». Ведь некоторые линии мышей существовали лишь в коллекции лаборатории так что восстановить их можно было лишь из собственного криобанка. Пример Джексоновской лаборатории оказался заразителен, и криоархивы стали создаваться в других генетических центрах. Сегодня их число приближается к двадцати. В японских центрах предусмотрен даже резервный банк на случай повреждения основного криохранилища при землетрясении. Например, Центр биоресурсов общества РИКЕН (BRC RIKEN) имеет основной криобанк в г. Тсукубе, а также резервный в
400 км к юго-западу (для последнего выделено место водном из помещений синхрофазотрона, смонтированного на мощном фундаменте).
Однако криоархивы не только помогают при стихийных бедствиях. Ведь при размножении традиционным способом в генетической линии неизбежно накапливаются мутации. Кроме того, как и все живые существа, мыши подвержены инфекциям. Поэтому криобанк эмбрионов необходим не только для восстановления линии, погибшей от инфекции или несчастного случая, но и для поддержания ее чистоты.
Свободные от патогенов
Расширение возможностей создания живых генетических моделей идет бок о бокс ужесточением требований к организации работы с экспериментальными животными. Наиболее дорогими трудновыполнимым требованием является обеспечение условий для содержания животных, свободных от основных видоспецифических возбудителей болезней (specified
pathogen free — Для чего нужны такие животные. Благодаря избавлению от инфекций устраняется практически неподдающийся контролю источник вариации экспериментальных данных, в результате надежность получаемых результатов значительно повышается. Поэтому согласно международным правилами стандарты) именно животные должны использоваться при проведении доклини- ческих испытаний лекарственных препаратов и оценки биобезопа- сности новых материалов, включая продукты питания. Стандартизация как условий содержания, таки самих лабораторных животных позволяет существенно сократить размеры экспериментальных групп. Неслучайно в нашей стране животных впервые стали использовать при изучении воздействия на организм космического полета (императивом к уменьшению числа экспериментальных животных в этом случае служили ограничения, накладываемые размерами космических аппаратов).
В Сибирском центре генетических моделей на животных, строительство которого по плану завершится уже в 2009 г, SPF- животных будут содержать по всем международным стандартам. Это помещение уже в скором времени станет стерильными в нем будут стоять стеллажи с клетками
И. И. Гейци, — управляющий проектом строительства Сибирского центра генетических моделей животных, рассказывает о принципе сообщения между стерильным помещением и внешним грязным коридором. Разработкой этого шлюзового отсека занимались специалисты, которые проектировали подводные лодки
Помимо всего прочего, снижение количества объектов исследования без ущерба для качества экспериментов и улучшение условий содержания животных отвечает этическим требованиям.
Еще одной причиной, заставляющей прикладывать значительные усилия для избавления от патогенов, заключается в том, что некоторым генетическим линиям животных свойственна повышенная восприимчивость к болезням. В частности, для решения многих задач иммунологии требуется выключить отдельные звенья иммунной системы, что делает животных беззащитными по отношению к неизбежным в естественных условиях возбудителям болезней. Иллюстрацией к этому служит приведенная выше работа по мышам, производящим человеческие антитела. Промежуточным этапом при получении таких животных были мыши с нокаутированными собственными генами иммуноглобулинов, те. мыши, способные погибнуть от любой, даже неопасной, инфекции.
Для обеспечения стандарта лабораторных животных содержат в чистых помещениях, в которые под избыточным давлением подается стерильный воздух. Корм, вода, подстилка и клетки поступают вчистую зону вивария после предварительной стерилизации. В той же Японии корма обеззараживают гамма-облучением, а все остальное пропускается через автоклавы. И поскольку мышь не является нано-объектом, несмотря на небольшие размеры, объем клетки для содержания 5—6 мышей составляет около 5 л. И регулярное автоклавирование 1—2 тыс. клеток требует оборудования соответствующих габаритов.
Все вышеперечисленное привело к тому, что в развитых странах работу вивариев обеспечивает индустрия, производящая стеллажи, клетки, поилки, корма, подстилку и даже специальные игрушки для развлечения янии? На основе накопленного в мире опыта можно уверенно утверждать, что если консервация произведена правильно, тоне важно, сколько времени эмбрионы хранились в жидком азоте — несколько секунд или десятки лет. Так, британский ученый Д. Уиттингем скол- легами (в 1972 г. именно они открыли способ заморозки эмбрионов мышей) продолжают и сегодня получать мышей с использованием эмбрионов, замороженных впрок более 30 лет назад эмбрионы, хранящиеся в

44 45
шения с вкладчиками в криоархивы
FIMRe и пользователями регулируются на основе соглашений о передаче материалов. При этом вкладчики получают следующие преимущества:
• гарантии авторских прав;
• освобождение от затратна сохранение и распространение генетической модели;
• надежное хранение;
• и, наконец, как подсчитали в японском центре BRC RIKEN, у вкладчиков повышается индекс цитирования более, чем на 88 При передаче созданных генетических моделей пользователям учитывается ведомственная принадлежность последних. Например, в Японии университетские и академические лаборатории оплачивают только себестоимость разведения и содержания животных для коммерческих же организаций плата выше на 30 %. Нов обоих случаях поступления от продажи животных не покрывают расходы на поддержание самих генетических центров. Поэтому большинство из них финансируется из федеральных бюджетов государств, проявляющих реальную заботу о развитии высоких технологий в области здравоохранения.
Создание сети международных центров, объединяемых FIMRe дало весомый вклад в изучение генетических основ функционирования организмов в норме и при патологии, а также в поиск оптимальных средств профилактики и лечения болезней. Сегодня исследователям предлагается следующий алгоритм взаимодействия с мировыми генетическими архивами формулирование потребности в экспериментальных животных с Коридоры строящегося здания Центра пока напонимают катакомбы подземелий. Трубы вытяжных систем придают интерьеру фантастический вид мышей. Последнее, несмотря на кажущуюся комичность — обязательное требование к содержанию животных в Англии и Скандинавских странах. Международная кооперация
Стремительно увеличивающееся многообразие мышиных генотипов привело к созданию международной организации, призванной координировать работу национальных центров генетических ресурсов. Сегодня Федерация международ- заданными свойствами, поиск нужного генотипа в базе данных FIMRe, заказ животных через ближайший Центр, ассоциированный FIMRe, получение Центром заказанной линии, разведение и передача животных заказчику.
При этом в настоящее время уже намечается отчетливая тенденция сокращения обмена племенными животными в пользу обмена кри- опродуктами. Можно предсказать, что реализация проектов, подобных
KOMP, приведет к включению в мировой оборот модельных организмов линий эмбриональных стволовых клеток с заданными изменениями генотипа, а затем и генно-инженерных конструктов, которые можно будет заказать по каталогам, как любой химиреактив. Это особенно эффективно сточки зрения биобезопасности, поскольку риск трансграничного обмена нежелательными микроорганизмами невозможно исключить при самом тщательном контроле за перевозкой живых организмов.
Но все эти блага прогресса будут доступны только тем странам, в которых будут существовать Центры, обеспечивающие полный цикл работы с генетическими ресурсами, те. имеющие в своем составе крио- банк, лаборатории репродуктивных технологий и трансгенеза, ив которых племенное разведение и содержание животных будут проводиться в соответствии с SPF- стандартом. А что в России?
Единственный на сегодня в России питомник животных, сертифицированный в соответствии с международными стандартами, расположен в Пущинском научном центре неподалеку от Москвы. В Питомнике лабораторных животных Филиала Института биоорганической химии им. академиков ММ. Шемякина и Ю. А. Овчинни- кова РАН поддерживается около дюжины наиболее ходовых линий мышей, несколько линий крыс и одна линия сирийских хомячков. Помимо воспроизводства экспериментальных объектов в питомнике налажена работа по освобождению животных от патогенов, криокон- сервирование половых продуктов и эмбрионов, хирургическая подго- ных мышиных ресурсов (Federation of International Mouse Resources —
FIMRe) объединяет 16 центров, расположенных в Северной Америке, Европе, Азии и Австралии. Центры формируют коллекции генотипов согласно договоренности, стараясь не дублировать друг друга. Эти коллекции пополняются благодаря собственной генетико-селекцион- ной и генно-инженерной работе центров, однако основной вклад вносят научно-исследовательские лаборатории различной ведомственной принадлежности.
Отно- товка животных для хронических и острых экспериментов.
В непосредственной близости от питомника находится один изо сновных потребителей животных лаборатория биологических испытаний Филиала ИБХ РАН. Возможность использования подобных животных позволяет проводить здесь доклиническую оценку лекарственных препаратов в соответствии с международным стандартом GMP (Good
Manufacturing Practice) — ISO 9000, и, соответственно, получать заказы на такие испытания от зарубежных университетов и фармацевтических компаний.
А какова ситуация за Уралом Если двигаться на восток от Пу- щино-на-Оке, то обнаружится, что следующий центр разведения SPF- животных находится в Японии. Все остальное пространство между этими географическими точками абсолютно свободно от животных, свободных от патогенов. И это удручает, потому что ив Сибирском, Михаил Мошкин и Юкио Накамура (Yukio
Nakamura — заведующий Лабораторией клеточной инженерии, BRC в криобанке стволовых клеток
(Япония)

Каталог: wp-content -> themes
themes -> Клаас – угольщик. Андрей Коржневский Сооткин
themes -> Профилактика
themes -> Екатерина Сергеевна Кудинова 8 (495) 580-1434, 8 (903) 724-1288