Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием >03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология

На правах рукописи

доктор медицинских наук,

академик РАН Евгений Иванович Чазов

доктор медицинских наук,

профессор Алексей Владимирович Мазуров
Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН	Аслан Амирханович Кубатиев ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН
доктор медицинских наук, профессор	Владимир Александрович Макаров ГУ Гематологический научный центр РАМН
доктор биологических наук	Юрий Аскольдович Романов ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Ведущая организация – Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет.
Защита диссертации состоится 23 января 2008 г. в 13.30 час.
на заседании диссертационного совета Д 208.073.01в РКНПК «Росмедтехнологий» по адресу: 121552, г. Москва, ул. З-я Черепковская, д. 15-А
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК «Росмедтехнологий»

Автореферат разослан " ____ " _______________ 2007 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Неоднородность пула циркулирующих в крови тромбоцитов была обнаружена еще в начале прошлого века. Различия отмечены в количестве, морфологии, возрасте, объеме, плотности, функциональной активности, содержании белков, гликогена, ферментов и рецепторов, что позволило говорить о гетерогенности пула тромбоцитов (Karpatkin, Khan, 1978).

Интактные тромбоциты имеют характерную форму диска. При активации происходит быстрое, занимающее менее секунды, изменение формы из дисковидной в сферическую. На разных этапах этого процесса могут появляться переходные формы, которые долгое время рассматривались в качестве одной из причин гетерогенности тромбоцитарного пула, а их выявление использовалось для определения риска тромботических осложнений у больных (Corash, 1990). Кроме того, были обнаружены и другие по форме тромбоциты, которые R. Allen (1979) относил к атипичным или артефактным. Но в дальнейшем появились неопровержимые данные, что такие формы появляются в результате их рождения мегакариоцитами (Gladwin, Martin, 1990; Hartwig, Italiano, 2003; Kozaki, 2005).

Возможны следующие пути появления тромбоцитов из мегакариоцитов: 1) разделение цитоплазмы мегакариоцитов демаркационными мембранами и быстрый «взрывной» выброс тромбоцитов, 2) образование эндоплазматических пузырей, содержащих пластинки, и их отделение от материнской клетки, 3) инвагинация мембраны с отделением тромбоцитов в виде бус, 4) образование из цитоплазмы псевдоподий, которые проникают в синусы костного мозга и отшнуровываются, в результате чего рождаются незрелые формы тромбоцитов, названные протромбоцитами. В дальнейшем, уже в кровотоке, они разделяются, образуя тромбоциты дисковидной формы.

Важную роль в продукции разных тромбоцитов играет степень полиплоидизации ядра мегакариоцитов (Ravid et al, 2002). С ней связан уровень содержания в тромбоцитах специфичных для них белков. Транскрипционные факторы, поэтины, цитокины, молекулы адгезии и катехоламины являются определяющими для созревания и полиплоидизации мегакариоцитов (Slayton et. al., 2005).

В настоящее время выделяют три формы тромбоцитов, появление которых в кровотоке зависит от состояния мегакариоцитов и в первую очередь от их плоидности. Это дисковидные тромбоциты, удлиненные биполярные протромбоциты (менее зрелые формы, рожденные клетками с низкой плоидностью) и большие сферические («ретикулярные») тромбоциты с высоким содержанием мРНК, происходящие из мегакариоцитов с высокой плоидностью. Кроме этих трех, выделяют четвертую субпопуляцию – сферические тромбоциты размером 1–2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий. За исключением редких патологий их появление в крови не связано с мегакариоцитопоэзом, а происходит в результате активации и изменения дисковидной формы кровяных пластинок.

Большинство исследований функциональных свойств тромбоцитов проводится на дисковидных и их производных – сферических формах. Что касается протромбоцитов и больших сферических («ретикулярных») форм, они остаются мало изученными, данные о них в основном имеют описательный характер, а сведения об их функциональных свойствах, способности к активации и роли в различных процессах единичны и противоречивы.

Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования было выяснение взаимосвязи между морфологической гетерогенностью тромбоцитов, их функциональными свойствами и участием различных субпопуляций в гемостазе и тромбозе.

К задачам исследования были отнесены:

1. 
   выявление и характеристика различных субпопуляций тромбоцитов, циркулирующих в крови человека и животных в норме;
   
2. 
   отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты;
   
3. 
   подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови;
   
4. 
   изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок – в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов;
   
5. 
   поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro;
   
6. 
   исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагий;
   
7. 
   изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов.
   

Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности.

Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию. Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений.

Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов. Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции.

Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы in vitro. Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания.

Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов.

Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула. Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией. В больших сферических тромбоцитах не обнаружена типичная для тромбоцитов грануляция и выявлена сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом.

Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту. Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов.

Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев. У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты.

Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью. Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) – фазе геморрагий.

За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов. Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях. Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии. Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием. Получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы». Этот метод используется в клинической практике.

Материалы и методы исследования.

Проводились исследования крови 54 специально отобранных здоровых добровольцев, 24 случайно обратившихся в донорский пункт с целью коммерческой сдачи крови добровольца, состояние здоровья которых не контролировалось, 38 профессиональных доноров, 29 больных бронхиальной астмой, 15 больных с артериальной гипертонией кризового течения, 18 больных феохромоцитомой, 18 больных с различными воспалительными заболеваниями (пневмония, пиелонефрит, абсцессы разной локализации), 14 – с генерализованными формами менингококковой инфекции, 52 больных ИБС с атеросклерозом коронарных сосудов, 11 больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий.

Отдельные эксперименты выполнены на 126 самцах крыс линии Wistar весом 250-300 г, 23 белых лабораторных мышах весом 25-30 г, 54 кроликах породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг, 7 сусликах весом 120-130 г. Часть экспериментов проводили на предварительно подвергнутых двусторонней демедуляции надпочечников крысах. Кровь брали самотеком из вены или шприцем из сердца, в некоторых экспериментах на крысах и мышах – через имплантированный в брюшную аорту катетер.

Метаболический стресс создавали с помощью болюсного введения 500 мг/кг 2-дезокси-Д-глюкозы (2ДГ). Концентрацию эндогенных катехоламинов в плазме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

Выделение и хранение концентрата тромбоцитов осуществляли в отделении переливания крови ФГУ РКНПК в контейнерах Fenwal PL-1240. Тромбомассу от 38 доноров получали двумя способами: «в осадке» и из лейкоцитарной пленки методом «Buffy Coat». Забор образцов для исследования осуществляли непосредственно после помещения тромбомассы в мешки для хранения (0 точка), на 1, 3 и 5 сутки хранения. Одновременно с этим проводился анализ контроля стерильности.

При подсчете выделяли 4 типа тромбоцитов: дисковидные (Д) размером 2-4 мкм; сферические (С₁) размером 1-2 мкм, с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий; большие сферические (С₂) размером 4-5 мкм, с выраженными инвагинациями плазматической мембраны, часто называемые в литературе «ретикулярными тромбоцитами»; вытянутые биполярные протромбоциты (ПТ) длиной 2-20 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм, одинаковые по всей длине или сужающиеся к концам наподобие веретена.

Для исследования внутриклеточных структур тромбоцитов 2 мл крови с антикоагулянтом префиксировали в 1% глутаровом альдегиде, отделяли ОТП и проводили более жесткую фиксацию 2,5% глутаровым альдегидом. Импрегнацию осуществляли 0,1% раствором четырехокиси осмия. Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) “JEOL” – 200 CH.

Исследование функций тромбоцитов. Агрегацию исследовали с помощью лазерного двухканального анализатора агрегации НПФ «БИОЛА» модели 230LA. Способность к образованию агрегатов малого размера (от 3 до 100 клеток) оценивали по спонтанной и индуцированной 0,1 и 0,5 мкмоль АДФ агрегации. Образование агрегатов среднего и большого размера (свыше 100 клеток) оценивали по индуцированной 1,0 и 5,0 мкмоль АДФ агрегации.

Адгезию оценивали с помощью СЭМ. 50 мкл ОТП наносили на адгезивную поверхность, инкубировали 5 мин. при комнатной t в закрытом бюксе, снимали неприкрепленные клетки с поверхности и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом. Параллельно исследовали тромбоциты, прикрепившиеся к поверхности и оставшиеся в суспензии, которые характеризовали как не способные к адгезии. Подсчет разных форм проводили на 25 полях сканирования, передвигая столик по диагонали, при увеличении 2500х или на 50 полях при увеличении 5000х. Для определения количества тромбоцитов (в %), способных к адгезии, использовали формулу: А=N_аx100/N_a+N_n, где: A – количество тромбоцитов определенной формы, способных к адгезии; N_а – общее число подсчитанных клеток, прикрепленных к поверхности; N_n – общее число подсчитанных клеток, оставшихся в суспензии.

Способность к эндо-экзоцитозу регистрировали с помощью флюориметрии методом АО-теста. Флюоресцентный зонд акридиновый оранжевый (АО) избирательно поглощается и запасается в основном внутри гранул и по его накоплению и освобождению можно судить о функциональном состоянии тромбоцитов.

Средний объем тромбоцитов (СОТ) оценивали по тромбоцитокриту. В кювету переменного диаметра добавляли 1 мл ОТП с 0,1 моль ЭДТА и центрифугировали 20 мин при 2000 g. Высоту столбика осевших клеток измеряли по линейке бинокуляра и пересчитывали по формуле DxH/N^-3, где D – диаметр капилляра, H – высота столбика осевших клеток, получившегося после центрифугирования, N – количество клеток в мм³ ОТП. Объем тромбоцитов выражается в фл. Параллельно для контроля проводили измерение СОТ на гемоанализаторе "Hemascreen 5".

Статистическую обработку и оценку корреляций с помощью критерия Спирмана осуществляли с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Определение различий проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. На рисунках и в таблицах приводятся отклонения от среднего значения, соответствующие стандартной ошибке или стандартному отклонению.

Результаты исследования и обсуждение

1. 
   Особенности морфологии и функций тромбоцитов человека и животных
   

В цитратной крови специально отобранных здоровых добровольцев, чье состояние оценивается по отсутствию хронических заболеваний, жалоб на здоровье и обращений к врачу в течение последнего года, 85 – 98 % (в среднем 94±5,2%) тромбоцитов имеют форму дисков. С₁ формы немногочисленны и в среднем составляют 6,3±0,7%. Обнаружено также от 1 до 4% (2,4±0,3%) ПТ небольшой длины (до 6 мкм). Более длинные ПТ, делящиеся или с перетяжками отсутствуют. Больших сферических тромбоцитов, относящихся к субпопуляции С₂, нет (рис. 1).

Для тромбоцитов отобранных здоровых добровольцев характерно отсутствие способности спонтанно агрегировать. В ответ на добавление 0,1 мкмоль АДФ агрегация составляет 1,7±0,1 отн ед, а в ответ на 5 мкмоль АДФ – 47,8±3,7 %. СОТ соответствует 8,6±0,6 фл и не превышает 10 фл. Реакция освобождения, оцениваемая по АО-тесту, достигает 19,2±1,9 усл ед, но не выходит за предел 22 усл ед.

У профессиональных доноров содержание Д форм снижено, а С₁ форм повышено, что может быть связано с активацией, вызванной кровопотерей и перестройкой организма в результате длительного донорства. Содержание ПТ увеличено почти в 2 раза и колеблется от 3 до 7% (в среднем 4,8±0,8%, р<0,05) по сравнению с ЗД. В основном они имеют веретенообразную или биполярную конфигурацию, но в отдельных случаях присутствовали единичные ПТ до 20 мкм длиной с перетяжками на концах. С₂ не обнаружены. Спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация (18,6±2,0%), СОТ (8,2±0,9 фл) и реакция освобождения (18,6±2,0 усл ед) незначительно отличались от сходных показателей у ЗД.

У большинства случайных добровольцев, обратившихся в донорский пункт с целью сдачи крови на коммерческой основе, состояние здоровья не контролировалось, и поэтому среди них могли оказаться лица с различными заболеваниями. По сравнению со здоровыми добровольцами, у этого контингента исследованных повышено содержание С₁ и снижено количество Д форм, хотя это не столь выражено, как у доноров. В то же время, у отдельных случайных добровольцев отличий от здоровых добровольцев не наблюдалось. В среднем содержание ПТ также не отличалось, но у некоторых представителей этой группы выявлены С₂ формы (рис. 1). Несмотря на то, что их количество ни у одного случайного добровольца не превышало 1%, у них наблюдается спонтанная агрегация (1,5±0,1 отн ед), повышенные 0,1 мкмоль АДФ-индуцированная агрегация (2,1±0,3 отн ед) и реакция освобождения (20,3±2,9 усл ед), хотя СОТ не менялся. Встречающиеся в ряде работ данные о присутствии С₂ форм в крови здоровых лиц может быть связано с недостаточно строгим отбором людей для включения в группу нормы.

По сравнению с цельной кровью, в ОТП увеличивается количество С₁ и уменьшается число Д форм в результате активации, вызванной процедурой выделения тромбоцитов. В то же время производимые при выделении действия не влияют на состояние С₂ и ПТ, количество которых в ОТП и цельной крови одинаково.

Анализ проведенных исследований в различных группах относительно здоровых лиц позволил нам выбрать группу отобранных здоровых добровольцев в качестве контроля для исследования морфо-функциональных особенностей тромбоцитов. Можно говорить о минимальной гетерогенности тромбоцитов у этой группы лиц, чей пул представлен преимущественно Д формами, минимальным количеством ПТ и отсутствием С₂ форм, что ограничивает возможность исследовать эти субпопуляции.

В поиске возможности использования лабораторных животных для изучения функциональных свойств тромбоцитов различных субпопуляций, мы исследовали кровь бодрствующих крыс, кроликов, мышей и сусликов. У всех видов животных в цельной крови основная часть пула тромбоцитов представлена Д формами, которые различаются по размеру и структуре. У крыс Д формы более уплощенные и крупнее, чем у других животных. У кроликов, мышей и сусликов тромбоциты субпопуляции Д более выпуклые, но без признаков активации. Максимальное количество Д форм обнаружено в крови крыс и кроликов, в то время как у мышей и сусликов их количество меньше, но одновременно с этим повышено число С₁ с гладкой поверхностью и без выраженных псевдоподий, что говорит о минимальной активации.

Таблица 1.

Морфо-функциональные особенности тромбоцитов у различных видов лабораторных животных. Агрегация в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ.

Ни у одного из видов интактных животных не обнаружены С₂ тромбоциты. В то же время у крыс почти в 5 раз увеличено число циркулирующих ПТ. У остальных животных их содержание сходно с наблюдаемым у ЗД. Такая морфологическая гетерогенность пула тромбоцитов крысы отличает ее от других видов лабораторных животных.

Межвидовые различия касаются и функциональной активности кровяных пластинок. Спонтанная агрегация отсутствовала у всех видов животных. АДФ-индуцированная агрегация была самой высокой у кроликов, а наиболее низкой у крыс. Сходные различия касаются и способности к экзоцитозу: тромбоциты крыс наименее активны по этому параметру (табл. 1).

Выявленные особенности морфологии и функции тромбоцитов у крыс могут быть связаны с тем, что эти животные наиболее восприимчивы к эмоциональному стрессу, а иммобилизация, которой они подвергались для взятия крови, приравнивается у них к такому состоянию. Это позволило нам предположить, что стрессорные воздействия различной природы могут влиять на изменение пула тромбоцитов, и в частности на появление ПТ.

2. 
   Роль катехоламинов в регуляции тромбоцитарного пула крыс