Биотехнология и генетическая инженерия

2. Генная инженерия и ее методы.

3. Клеточная и эмбриональная инженерия.
1. Понятие о биотехнологии

Современная биотехнология занимает ведущее положение в системе биологических, медицинских, ветеринарных и зоотехнических исследований, представляет собой новую форму промышленной технологии, основу которой составляют биологические объекты – животные, растения и микроорганизмы.

Основная цель и задачи биотехнологии направлены на разработку методов и приемов, позволяющих получать биологически активные соединения (ферменты, гормоны, вакцины), а также конструировать молекулы новых веществ и создавать новые формы организмов, отсутствующие в природе (химерные молекулы, животные).

В животноводстве широко используют различные биотехнологические методы (генная и клеточная инженерия), с помощью которых можно ускорить селекционный процесс по созданию новых высокопродуктивных пород с.-х. животных.

В биотехнологии пользуются двумя терминами, различающимися смысловым содержанием: «Генная инженерия» - как прием изучения и воздействия на процессы, проходящие на уровне молекул и генов, и термин «Генетическая инженерия» - как комплекс методов, проводимых в более широком плане на клетках и организме в целом.

В принципе оба термина являются синонимами и подразумевают методы, обеспечивающие переделку и реконструкцию генетического материала, т.е. формирование новой наследственности.

Использование достижений генной инженерии идет в основном в следующих направлениях:

• 
  изучение организации генетического аппарата высших организмов;
  
• 
  использование микроорганизмов как продуцентов хозяйственно полезных веществ;
  
• 
  конструирование новых организмов путем пересадки чужеродных генов, т.е. получение трансгенных животных.
  

• 
  повышение эффективности и ускорение селекционного процесса;
  
• 
  повышение коэффициента размножаемости самок;
  
• 
  сохранение ценных, малых популяций генофонда исчезающих пород;
  
• 
  получение потомков от бесплодных, но генетически ценных животных;
  
• 
  повышение устойчивости животных к заболеваниям;
  
• 
  получение монозиготных близнецов одного определенного пола;
  
• 
  получение химер, развивающихся из эмбрионов 5-6 дневного возраста разных животных (пород, видов) и объединенных в одно целое;
  
• 
  повышение плодовитости коров путем пересадки половин эмбриона в оба рога матки.
  

Исторически биотехнология возникла на основе традиционных микробиологических (большей частью бродильных) производств. Многие подобные «технологии» неосознанно применялись еще в древности при получении вина, пива, хлеба, кисломолочных и квашенных продуктов.

С помощью биотехнологии в настоящее время получают десятки дорогостоящих биологически активных веществ, среди них гормоны, ферменты, витамины, антибиотики, некоторые лекарства, такие как инсулин, интерферон и другие.

Для справки: инсулин – белок регулирующий содержание сахара в крови; интерферон – белок защищающий еще непораженные клетки от вирусов (гриппа).

Однако, до появления методов генной инженерии интерферон мог быть получен лишь в ничтожных количествах из лейкоцитов (белых кровяных клеток).

Для получения 1 грамма интерферона нужно переработать кровь от 90 тыс. доноров.

Биотехнологические разработки интенсивно используются при создании безотходных процессов производства при переработке сырья, очистке воды от нефти, канализационных стоков, в борьбе с вредителями с.-х. культур, получения кормового и пищевого белка, биогаза и др.

Так, с помощью микробов из 1 тонны нефти получается около 1 тонны дрожжей, содержащих 600 кг белка.

И еще: при размножении 1 бактерия (при оптимальных условиях кормовых, среды и др. факторов) через 44 часа сумела бы образовать такое потомство, масса которого соответствовала массе нашей планеты (около 6 000 000 000 000 000 000 000 тонн).

Биотехнологическими приемами, еще 6000 лет тому назад пользовались народы Двуречья изготовляя пьянящий напиток, т.е. пиво тех времен.

Умели варить пиво и древние египтяне используя дрожжи, сахар и брожение. Римляне и греки используя виноградный сок получали вино.

На основании выше сказанного на вопрос, что такое биотехнология, мы можем ответить так, что это наука об использовании живых организмов и биологических процессов в производстве.

В связи с выше изложенным, историю возникновения и развития биотехнологии можно разделить на три этапа.

Первый этап – зарождение биотехнологии. Многие сотни лет человек, не имея научных представлений о микробиологии, биохимии и других науках, разработал и практически успешно использовал методы биотехнологии в хлебопечении, сыроделии, виноделии, изготовлении кисломолочных продуктов, т.е. древнейших отраслях хозяйственной деятельности.

Второй этап (XIX в.) – становление биотехнологии как науки. Начало бурного развития биотехнологических наук: генетики, микробиологии, биохимии, вирусологии, физиологии, эмбриологии и др.

Третий этап (середина 70-х годов XX в.) – развитие биотехнологии в различных направлениях с помощью методов генной и клеточной инженерии.

Первыми биотехнологическими приемами в животноводстве стали искусственное осеменение животных и силосование кормов.

Впервые в Росси в 1887 г. хирургическим путем В.И. Шведов трансплантировал дробящиеся оплодотворенные яйцеклетки – зиготы крысы.

История трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота начинается с 1950 г., когда О. Уиллем (США) пересадил оплодотворенную яйцеклетку от одной телки другой и получил живого теленка.

Из европейских государств, которые стали использовать трансплантацию эмбрионов как метод, ускоряющий селекционный процесс и повышающий его эффективность, необходимо отметить Францию, Великобританию, Данию, Германию, Италию, Бельгию, Словакию.

Современный этап развития биотехнологии связан с открытием новых закономерностей в процессах жизнедеятельности организмов на молекулярном уровне.

Развитие биотехнологии привело к созданию промышленного производства по получению различных биопрепаратов для использования их в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности.

С каждым годом увеличивается число технологий, методов и препаратов, предназначенных повысить продуктивность животных и качество продукции. В мире насчитывают более 450 биотехнологических компаний, производящих препараты для поддержания здоровья животных и повышения их продуктивности.

Направления биотехнологии

Одно из наиболее перспективных направлений – клонирование эмбрионов, т.е. получение максимального количества потомков от высокопродуктивных животных.

Для этого разработана методика создания идентичных (клонов) эмбрионов путем внесения ядра клетки эмбриона высококлассного животного в неоплодотворенную яйцеклетку с предварительно удаленным ядром, малоценным в племенном отношении; разделение эмбрионов на два, четыре, шесть и восемь частей.

Одноклеточные «синтетические» эмбрионы научились выращивать до 8-, 16- и даже 32- клеточной стадии в лабораторных условиях. Поэтому их можно не только имплантировать коровам или замораживать с целью хранения, но и использовать для последующего клонирования. Таким образом, можно in vitro получать неограниченное количество эмбрионов, исключая процедуру их взятия у высокопродуктивных животных. Теоретически от одного эмбриона крупного рогатого скота можно иметь тысячи животных.

Другое достижение биотехнологических исследований в области животноводства, имеющее практическое значение, - метод получения трансгенных животных, в геном которых «встроен» чужеродный ген. С его помощью за короткий период можно получить быстрорастущих животных, с высокой молочной продуктивностью, устойчивостью к болезням и т.д.

Получение даже одного животного с унаследованным пересаженным геном считается большим достижением. Такое животное рассматривают как основу для создания новой линии.

Сегодня биотехнология используется при решении многих практических вопросов по повышению эффективности здравоохранения, увеличению продовольственных ресурсов страны и обеспечению различных производств сырьем, созданию и использованию рентабельных возобновляемых источников энергии и безотходных производств, сокращению вредных антропологических воздействий на окружающую природную среду и в других отраслях.

В настоящее время, в наиболее развитых странах созданы и продолжают создаваться предприятия, которые используя биотехнологию производят корма и кормовые добавки, продукты питания, медицинские препараты, проводят трансплантацию эмбрионов и решают другие хозяйственные задачи.

Полагают, что дальнейший прогресс человечества не только будет во многом зависеть от развития биотехнологии, но и просто не сможет без нее обойтись, так как нет пока других научно обоснованных предложений обеспечить прежде всего продуктами питания все возрастающее население Земли.

Наиболее перспективными направлениями в биотехнологии являются производства связанные с нетрадиционным получением на биофабриках, в необходимых количествах белка, незаменимых аминокислот, лекарственных препаратов, биогаза и преобразованием солнечной энергии.

2. Генная инженерия и ее методы

Современная генная инженерия пользуется комплексом разнообразных методов и технологий на уровне молекул, клеточных элементов (хромосом, ядра), соматических и половых клеток, на организме, находящемся на разных стадиях онтогенеза.

В основном, комплекс методов осуществляется в искусственных условиях (in vitro) иногда в природных (in vivo).

Для конструирования новых генетических структур на молекулярном уровне служат следующие методы:

- выделение молекул ДНК из различных естественных природных веществ;

- разделение молекул ДНК на фрагменты с помощью различных ферментов (эндонуклеаз, рестриктаз, ДНК – полимераз и т.п.);

- склеивание фрагментов ДНК разной структуры ферментом липазой для образования новых генетических комплексов;

- конструирование рекомбинантных ДНК с использованием векторов в виде фагов, бактерий и плазмид.

В условиях in vitro гены выделяют из природного вещества, содержащего ДНК, получают химическим синтезом, ферментативным или комплексным методом.

Толчком для дальнейшего развития генной инженерии стали работы по применению метода распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот.

Искусственный перенос гена проводят с использованием так называемого вектора, когда генетический материал из одной структуры переносят в генетическую структуру организма другого вида.

Например, ген млекопитающего пересаживают в геном бактерии, где донорская молекула ДНК должна давать выход массы донорского гена. Такими векторами служат рекомбинантные молекулы ДНК-плазмид, которые сочетают в себе гены разных плазмид или несут гены, выделенные из хромосом разных видов. Выделенный или синтезированный ген, предназначенный для изменения наследственности каких-то клеток, должен быть доставлен и внедрен в эти клетки.

Для создания рекомбинантных плазмид требуются многие ферменты типа рестриктаз, липаз, нуклеаз, ДНК – полимераз и др.

С помощью рекомбинантных плазмид можно проводить множественное копирование молекул ДНК, необходимых для синтеза разнообразных белков.

Этим путем были синтезированы гормоны роста человека и животных, гены инсулина человека, глобины кроликов и др.

Смесь фрагментов ДНК клетки – донора образует новую, так называемую рекомбинантную молекулу ДНК, в которую вставлен нужный ген, перенесенный с помощью плазмиды в геном микроорганизма кишечной палочки.

Существенное значение методы генной инженерии приобретают в связи с синтезом интерферонов, необходимых для борьбы с различными инфекциями.

Процесс синтеза интерферона химическим способом из крови животных сложен и продолжителен. Поэтому использовали микроорганизмы (E. Coli), полученные методом генной инженерии, способные продуцировать интерфероны человека, которые активизируют процессы, влияющие на противовирусную устойчивость.

Методами генной инженерии в промышленных условиях были получены инсулин, гормон роста человека, интерферон. Находятся в разработке способы синтеза альбумина, разных вакцин, некоторых ферментов, гормона роста с.-х. животных.

На основе генной инженерии создается генотерапия, позволяющая исправлять наследственные дефекты путем введения в организм полноценных генов. Этим путем получены мыши-гиганты. В их геном «встроили» ген гормона роста.

Одним из важных направлений клеточной инженерии является гибридизация соматических клеток.

Сущность ее заключается в соединении клеток с хромосомными наборами весьма далеких видов.

При соматической гибридизации используют способность клеток в культуре соединяться в одну и образовывать ядро, содержащее хромосомы разных геномов. Осуществляется это при помощи вируса Сендай.

В настоящее время получены гибридные культуры клеток десятков далеких видов (мышь х курица; мышь х обезьяна; кролик х обезьяна; соя х горох; соя х кукуруза и т.д.).

Оказалось возможным соединение в одной клетке и таких далеких форм, как курица х дрожжи и др.

Однако, межвидовая несовместимость остается законом и при соматической гибридизации.

Со временем в гибридной культуре происходит разделение на клетки того и другого вида, которые не содержат хромосомы второго вида.

Это обстоятельство оказалось крайне ценным для изучения локализации и характера действия тех или иных генов.

Эмбриональная инженерия. К этому направлению относится трансплантация эмбрионов. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеет особое значение. Крупный рогатый скот относится к одноплодным видам млекопитающих. В лучшем случае, от каждой коровы получают одного теленка в год, в то время как в яичнике содержится сотни тысяч незрелых половых клеток – ооцитов, представляющих огромный генетический резерв.

Кардинальное решение проблемы ускоренного воспроизводства скота состоит в том, чтобы перейти к нетрадиционным способам увеличения плодовитости. В перспективе биотехнология рассматривается как основа ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных и целых популяций.

К методам биотехнологии, применяемым в практике воспроизводства, относят искусственное осеменение, глубокое замораживание и длительное хранение спермы быков, вызывание половой охоты и ее синхронизация, регулирование времени отелов.

В последнее время наряду с этими традиционными биотехническими методами приобрела практическое значение трансплантация эмбрионов, которая рассматривается как эффективный метод биотехнологии ускоренного размножения высокоценных племенных животных.

Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота – это новый биотехнический метод ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных, который значительно повышает роль маточного поголовья, представляет собой составную часть программы селекции и является одним из способов интенсификации использования генетического потенциала коров-рекордисток. Трансплантация эмбрионов эффективна только при использовании генетически ценных животных, проверенных по качеству потомства и признанных улучшателями.

Если учесть, что от одного донора можно получать эмбрионы 4-5 раз в год, то уже на современном этапе развития биотехники трансплантации очевидна реальная возможность ежегодного получения 20-25 телят от одной коровы рекордистки. Используя 20 коров-рекордисток в качестве доноров эмбрионов, в течение 2-3 лет можно создать высокопродуктивное молочное стадо в 200-300 коров. Традиционным способом от тех же 20 коров за этот период можно получить не более 30 телок и 30 бычков.

Коров, телок, которым пересаживают эмбрионы, принято называть реципиентами, а коров, от которых получают эмбрионы – донорами. Эффект от трансплантации в значительной мере определяется выбором коров. В качестве доноров используют лучших, а в качестве реципиентов – худших по селекционным признакам коров или телок.

Чем выше различия в качестве между донором и реципиентом, тем целесообразнее применение метода трансплантации, базирующегося на использовании в качестве доноров коров с рекордно высокой продуктивностью. Для осеменения коров-доноров используют семя лучших быков, оцененных по качеству потомства.

Наиболее важное значение метод трансплантации эмбрионов может иметь при выведении и отборе выдающихся по племенной ценности производителей, так как увеличивается возможность отбора бычков от матерей с рекордно высокой продуктивностью.

Получение бычков-трансплантантов от выдающихся родителей не снижает проблему их последующей оценки по качеству потомства, но значительно повышает вероятность отбора (за счет повышения селекционного дифференциала матерей) выдающихся улучшателей для использования в племенных заводах и в условиях крупномасштабной селекции.

Применение метода трансплантации эмбрионов ставит всю селекционную работу на новый интенсивный путь развития пород, обеспечивая повышение продуктивности за счет получения и широкого использования производителей с высокой комбинационной способностью.

Трансплантация эмбрионов развивается быстрыми темпами, а сам метод за рубежом используют в коммерческих целях. В США создано более 80 коммерческих центров по пересадке эмбрионов. В этой стране, где трансплантация эмбрионов поставлена на прочную технологическую основу, получают ежегодно более 100 тыс. телят. Аналогичные коммерческие организации по трансплантации эмбрионов созданы и в других развитых странах Западной Европы. В СССР разработки по трансплантации эмбрионов были начаты в середине 70-х годов.

Цель трансплантации состоит в следующем:

- создание пород, линий, семейств или специализированных типов животных;

- консолидация или совершенствование существующих пород, линий, семейств животных;

- скрещивание пород, линий, семейств и межвидовой гибридизации;

- регулирование многоплодия сельскохозяйственных животных;

- проведение научных исследований и подготовка специалистов (как учебный процесс).

Отбор доноров и проведение полиовуляции.

Наиболее важным критерием на первых этапах отбора коров-доноров служит их высокая племенная ценность, т.е. способность передавать гены высокой продуктивности своим потомкам. Племенная ценность донора должна подтверждаться не только высокой продуктивностью самой коровы, но и ее родственников. В группу доноров, отобранных в качестве матерей будущих быков-производителей, включают лучших коров племенных стад.

Сначала племенную ценность коровы-донора определяют по молочной продуктивности с законченной лактацией продолжительностью 305 дней, содержанию жира и белка в молоке, пригодности коров к машинному доению, крепости конституции и экстерьеру.

При подборе, к донорам предъявляют общие и специальные требования. К общим требованиям относятся следующие:

- животное должно быть клинически здоровым;

- донор должен быть оценен по типу нервной системы, экстерьеру и конституции;

- донор должен быть оценен по воспроизводительным качествам (развитию и физиологическому состоянию половых органов, величине сервис-периода, качеству и жизнеспособности приплода);

- на каждого донора должно быть оформлено ветеринарное свидетельство с указанием его клинического состояния.

К специальным относят требования, способствующие достижению конечной цели трансплантации эмбрионов, при этом необходимо учитывать следующее:

- донор должен быть типичным представителем породы, линии, семейства по экстерьеру, конституции и хозяйственно полезным признакам;

- донор должен быть оценен по племенным признакам с использованием биометрических методов;

- характерные хозяйственно полезные признаки донора должны быть оценены на возможность их фенотипической совместимости в планируемых генотипах животных.

Высокие затраты на получение телят путем трансплантации эмбрионов обуславливают необходимость отбирать таких доноров, от которых регулярно можно получать большое количество эмбрионов. Предпочтение следует отдавать коровам, сохранившим в течение трех отелов стабильную воспроизводительную способность. От коров-доноров с хорошими и устойчивыми воспроизводительными способностями можно регулярно получать через каждые 2 месяца эмбрионы.

Если исходить из общепринятого положения, что от коровы нужно получать одного теленка в год, то межотельный период в среднем не должен превышать 365 дней. Следовательно, получение от каждой коровы по одному теленку за 365 дней является основным показателем ее хорошей воспроизводительной способности.

Для оценки воспроизводительной способности можно использовать индекс воспроизводительной способности ИВС, который определяется по формуле ИВС= (п-1)  365  100  Д, где п- число полученных телят, Д – число дней между первым и последним отелами. При стабильной воспроизводительной способности индекс не должен превышать 100.

Продолжительность эмбрионального периода у коров в среднем составляет 285 дней, следовательно, оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. В этот период корова должна быть оплодотворена.

После отбора коров-доноров приступают к множественной овуляции (полиовуляции). Этот метод был разработан советским эмбриологом М.М. Завадовским и его сотрудниками. Ими было доказано, что если ввести в кровь самки гонадотропные гормоны, то это приводит к стимулированию созревания дополнительного количества фолликулов. В качестве гонадотропного гормона использовалась сыворотка жеребых кобыл (СЖК).

Важным звеном в современной биотехнологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота является гормональное вызывание суперовуляции у коров-доноров. В группу доноров переводят только тех коров, которые положительно реагируют на введение гормонов.

Для стимуляции множественной овуляции используют гонадотропин СЖК в сочетании с простагландинами и другими биологически активными веществами. Этот способ позволяет вызвать полиовуляцию примерно у 70 % коров. Оптимальным результатом полиовуляции является выход из яичника в воронку яйцевода 10-20 яйцеклеток. Среднее число овуляций составляет около 10, а оплодотворяемость яйцеклеток достигает 80%.

Оптимальными донорами можно считать коров, которые после многократных полиовуляций имеют хорошую реакцию яичников и производят большое число пригодных для трансплантации эмбрионов за одно вымывание.

Однако лишь небольшая часть доноров обнаруживает повторную реакцию яичников после вызывания полиовуляции. В основном коровы-доноры нерегулярно отвечают на повторную гормональную обработку, т.е. один раз реагируют хорошо, а в другой раз – плохо. Поэтому количество овуляций и выход эмбрионов не являются стабильными.

На полиовуляцию влияют и такие факторы, как стадия лактации, мертворождаемость или трудные отелы, время проявления эструса, доза СЖК, месяц отела, порода, хозяйственные условия, живая масса донора, стрессы, уровень и качество кормления и т.д.

Выявлено, что удлинение периода лактации способствует лучшей реакции коров на вводимую СЖК. Оптимальным сроком для вызывания полиовуляции у лактирующих коров черно-пестрой породы является период с 60-го дня после отела.

Для оптимизации полиовуляции и получения биологически полноценных эмбрионов необходимо обеспечить полноценное кормление донора, сбалансированное по всем питательным веществам.

Оптимальная доза для коров-доноров СЖК – 2500-3000 ИЕ. При инъекции такой дозы получают в среднем 9 овуляций на одного положительно реагирующего донора.

Наивысший эффект полиовуляции достигают при введении СЖК между 10-12 сутками эстрального цикла (середина лютеальной фазы) и через 2-ое суток простагландина, вызывающего регрессию желтого тела, половую охоту и овуляцию. В течение 48 часов после инъекции простагландина у 95 % коров-доноров происходит полиовуляция со всеми признаками эструса.

Многократная полиовуляция подвержена большой изменчивости. Поэтому не все коровы-доноры имеют одинаковую предрасположенность к многократной овуляции. Для эффективной многократной полиовуляции необходим тщательный отбор доноров по ряду показателей.

Отбор производителей.

При отборе быков их оценивают по кариотипу с целью исключения хромосомных аномалий. Потомство отобранных производителей не должно иметь экстерьерно-конституциональных дефектов.

В подавляющем большинстве случаев подбор производителей и доноров проводится по плану заказного спаривания в соответствии с селекционной программой. Сперма производителей, отбираемых для осеменения доноров, должна характеризоваться наивысшей оплодотворяемостью, не ниже 85-90 %.

Основной критерий воспроизводительной способности производителей – показатель оплодотворяющей способности их спермы. Так, для оценки проверяемого производителя (быка, хряка, барана) по оплодотворяющей способности спермы организуют контрольное спаривание. Для этого отбирают из разных стад три-четыре группы коров (800-1000 гол.).

Если оплодотворяющая способность спермы проверяемого быка составляет 60 % и менее, то такого быка выбраковывают. На практике этот показатель определяется количеством (процентом) коров, оплодотворившихся от первого осеменения. Оплодотворяемость устанавливают по отсутствию половой охоты в течение 60-90 дней после осеменения.

Методы искусственного осеменения позволяют значительно раньше определить оплодотворяющую способность спермы. Так, интенсивность браковки быков по половой активности и качеству спермы составляет 25-30 %. Значительное количество спермы (20-30 %) бракуется при оценке свеже- полученных эякулятов, 10-15 % - при биологическом контроле спермы через 24 часа после замораживания.

Осеменение коров-доноров.

Эффективность полиовуляции в последующем определяется эффективностью искусственного осеменения доноров. Результаты многочисленных исследований показывают, что только 60-65 % получаемых эмбрионов пригодны для пересадки реципиентам. Остальные 35-40 % составляют яйцеклетки или дегенерированные эмбрионы.

Для искусственного осеменения коров-доноров необходимо использовать сперму только выдающихся быков-производителей, достоверно оцененных по качеству потомства.

Требования к оценке оплодотворяющей способности спермы быков, предназначенной для осеменения коров-доноров, должны быть значительно выше, чем при оплодотворении остальных коров. Оплодотворяющая способность спермы таких быков должна составлять не ниже 70 % при высокой точности ее оценки.

Для повышения оплодотворяемости доноров и выхода эмбрионов, наряду с использованием высококачественной спермы, необходимо определить сроки половой охоты для своевременного проведения искусственного осеменения. Многие признаки полиовуляции свидетельствуют о том, что лишь короткий период является наиболее благоприятным для эффективного оплодотворения и получения биологически полноценных эмбрионов.

Имеются разные мнения специалистов о времени и кратности осеменения коров с гормонально вызванной половой охотой. Как правило, таких коров осеменяют дважды: первый раз в начале появления половой охоты и второй – через 12-24 часа.

В нашей стране коров-доноров осеменяют искусственно дважды в день с интервалом 10-12 ч. каждый раз двумя-тремя дозами замороженной спермы.

Для искусственного осеменения коров-доноров применяют три способа: визуальный (с использованием влагалищного зеркала); маноцервикальный (введение во влагалище руки в перчатке и укороченной пипетки); ректоцервикальный (с фиксированием шейки матки и контролем продвижения осеменительной пипетки с помощью руки, введенной в прямую кишку).

Самую высокую эффективность искусственного осеменения коров-доноров обеспечивает ректоцервикальный способ, позволяющий контролировать состояние половых путей донора. День, в который проводится искусственное осеменение коровы-донора, считается датой оплодотворения.

Моноклональные антитела – это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток.

Перспективна гибридизация раковых и нормальных клеток на основе которой получают гибриды – гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела.

Под гибридомой понимают гибридную клетку, полученную на основе слияния продуцирующей антитела клетки с раковой клеткой, придающей гибридоме способность неограниченного размножения при культивировании in vitro.

В этом случае гибридомы наследуют от нормальной родительской клетки способность вырабатывать ценное биологическое вещество антитело, а от раковой клетки – способность к неограниченному росту и образованию моноклона.

Под антителом понимают белок, синтезируемый иммунной (защитной) системой организма, связывающийся специфически с антигеном.

В результате защитной реакции на антиген (чуродный белок) образуется целая комбинация различных антител представляющих неделимую смесь.

Поэтому изолировать в чистом виде нужное антитело невозможно традиционных методом.

Получить чистые антитела определенной линии можно в том случае, если изолировать клетку продуцирующую нужное нам антитело и из нее образовать клон.

Антиобразующие клетки на способны расти в питательной среде. Следовательно, их надо слить (т.е. соединить) с миеломными (раковыми клетками) клетками способными к неограниченному делению в питательной среде и продуцированию моноклональных антител.

Способы извлечения эмбрионов и их оценка.

Эффективность метода трансплантации во многом определяется способом извлечения эмбрионов. Существуют разные способы извлечения эмбрионов. Наиболее простой – убой донора. Его применяли на первых этапах развития трансплантации для демонстрации в качестве учебной практики и для научных целей. Время между убоем донора и вымыванием эмбрионов не должно превышать 30-40 мин., т.е. эмбрионы должны быть получены до начала процесса клеточного переваривания в половых органах. В настоящее время из-за потери генетически ценной коровы-донора он не применяется.

Извлечение эмбрионов хирургическим способом применяли в 70-е годы. Эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения. При вымывании можно получить в среднем 5 эмбрионов от каждого донора. Разработаны три приема: извлечение эмбрионов через разрез верхнего свода влагалища; лапаротомия по белой линии живота (под наркозом донора); лапаротомия в области голодной ямки с применением местной анастезии. Хирургический способ извлечения эмбрионов более трудоемок; необходимы высокая квалификация хирурга, операционный зал и стерильные условия. Поэтому он применяется в редких случаях, только в научных целях.

Катетерный (нехирургический) способ извлечения эмбрионов практически не вызывает каких-либо осложнений в организме животного. Катетерным способом можно успешно извлекать эмбрионы в животноводческом помещении. Эффективность способа высока, многократна. С помощью катетерного способа получают в среднем 4,3 нормального эмбриона от 86 % коров-доноров. В среднем, из вымытых яйцеклеток, до 25 % оказываются неоплодотворенными или дегенерированными. Вымывают эмбрионы на 7-8-е сутки после осеменения. Для вымывания используют питательную среду Дюльбекко. Продолжительность манипуляции 20-50 минут.

Для получения эмбрионов этим способом разработаны специальные катетеры. Промывную среду вводят в рога матки 5-8 раз и удаляют из них с помощью шприца. Промывание рогов матки обеспечивает извлечение до 76 % эмбрионов от числа овуляций. Основную часть эмбрионов, более 50 %, извлекают в первых трех-четырех смывах находящихся на стадии морулы или бластоцисты при 32-х или 64-х бластомерах.

После вымывания эмбрионов в матку вводят раствор антибиотиков с целью антисептики.

Перед пересадкой эмбриона реципиенту, необходимо оценить его качество и определить способ пересадки. Оценивают эмбрионы различными методами: морфологический, прижизненное окрашивание, цитологический и др.

Считается, что степень точности морфологического метода может быть доведена до 90 % и более. Эмбрионы из яйцевода в матку поступают на 3-5-е сутки, однако в пределах 10-15 % могут поступать и через 6-8 суток. Эмбрионы, не достигшие определенной стадии развития в указанное время, как правило погибают. В этой связи качество эмбрионов оценивается на 7-8-е сутки по степени их развития до бластоцисты.

При морфологической оценке особое внимание обращают на внешнюю форму зиготы, состояние зоны пелюцида, число бластомеров, равномерность дробления, выраженность эмбриобласта и трофобласта, четкость в очертании клеток, вакуолизацию цитоплазмы – просветление ее переферии, деструкцию цитоплазмы (сбивание в комок), целостность клеточной мембраны и выход цитоплазмы наружу.

На ранних стадиях дробления особое значение придается конфигурации бластомеров. Нормальная конфигурация обеспечивает тесный контакт с наибольшим количеством клеток при минимальном объеме. Неправильное дробление клеток эмбрионов приводит к нарушению пространственного расположения бластомеров, что приводит к нарушению в последующих стадиях развития. Эмбрионы коров оцениваются на 7-8-й день после первого осеменения под микроскопом при 100-160 – кратном увеличении.

В России принята 5-ти бальная школа оценки качества эмбрионов, учитывающая: целостность прозрачной оболочки, равномерность дробления, состояние цитоплазмы, прозрачность перевителинового пространства, соответствие стадии развития. Наиболее пригодны для пересадки эмбрионы, оцененные 4 – 5 баллами, находящиеся в стадии поздней морулы или бластоцисты.

Для улучшения морфологической оценки дополнительно используют флуоресцентную окраску, позволяющую отличить живых эмбрионов от погибших.

Оценка качества эмбрионов методом их окраски основана на способности красителей окрашивать морфологические структуры живой и мёртвой клетки. Прижизненную окраску эмбрионов производят нетоксичными красителями.

Идеальный эмбрион должен быть компактным, сферической формы, с однородной окраской, с клетками одинаковой величины, с гладкой, плоской и равномерно сформированной зоной пеллюцида, без включений в перевителиновом пространстве.

Важным критерием для оценки качества эмбрионов является интенсивность развития стадий. Эмбрионы с замедленным развитием не используются для пересадки, замораживания и др.

Выбраковке подлежат дегенерированные неоплодотворённые яйцеклетки, которые можно обнаружить при извлечении эмбрионов. Непригодные для трансплантации эмбрионы имеют дефектную морулу или бластоцисту, признаками которых являются дефекты прозрачной оболочки, распад бластомеров, разная величина бластомеров, нарушение межклеточной связи.

Кратковременное культивирование криоконсервация и хранение эмбрионов.

Кратковременное хранение и культивирование (развитие) эмбрионов дает возможность транспортировать их в другие хозяйства. В настоящее время широкое распространение получил метод краткосрочного хранения эмбрионов in vitro. Установлено, что эмбрионы коровы могут продолжать свое развитие до определенных стадий при температуре тела животного в специальных культивируемых (питательных) средах и в определенных атмосферных условиях.

После извлечения и оценки на жизнеспособность, эмбрионы переносят в питательные среды с температурой 37⁰С. Разработано несколько питательных сред для кратковременного хранения эмбрионов in vitro (95 ч). Наиболее часто в качестве питательных сред для культивирования эмбрионов используют: ТС-199; Хэма F-10; Игла, солевые растворы Дюльбека, Бринстера с различными биологическими и синтетическими добавками. Для поддержания оптимальных условий развития эмбрионов используют газовую среду, содержащую 90 % азота, 5 % кислорода и 5 % углекислого газа. Культивирование эмбрионов в пробирках или соломинах является более простым методом, позволяющим транспортировать эмбрионы на дальние расстояния.

Второй метод кратковременного хранения эмбрионов осуществляется при температуре 8-12 ⁰С, продолжительность 3-4 сут. Скорость охлаждения медленная во избежания температурного шока. Для этого используют синтетические среды с различными белковыми добавками: бычий сывороточный альбумин (БСА), сыворотку крови хряков кастратов (СКХ), и нормальную сыворотку бычков кастратов (НСБК).

Третий метод кратковременного хранения эмбрионов протекает in vivo, т.е. в половых органах промежуточного реципиента (кроликов, мышей и др.) для транспортировки на дальнее расстояние.

Метод основан на высокой толерантности (терпимости) слизистой половых путей самки в период течки и охоты к чужеродным белкам. Для этого, в 1982г. была сконструирована специальная камера хранения эмбрионов у реципиентов в брюшной полости. В такой камере эмбрионы сохраняются в течение 72 ч.

Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре – 196 ⁰С. Этот метод значительно расширяет возможности трансплантации и является надежной биотехнологической основой селекции животных.

При хранении замороженных эмбрионов (-196⁰С) имеется ряд преимуществ, которые позволяют проводить пересадку эмбрионов в любое время, создавать «банк» эмбрионов от высокоценных племенных животных, малочисленных и исчезающих пород, транспортировать эмбрионы в любое время года.

Для замораживания эмбрионов используют автоматические программные замораживатели УОП-12. Чтобы уберечь эмбрионы от разрушения при замораживании и оттаивании, применяют специальные криозащитные вещества, легко проникающие в клетку, – криопротектор глицерин.

Перед замораживанием эмбрионы помещают в криопротектор с возрастающей концентрацией веществ для уравновешивания осмотического давления. Существует быстрый способ криоконсервирования: охлаждение от +20 ⁰С до – 6 ⁰С со скоростью 1 ⁰С/мин. Последующее охлаждение до -35 ⁰С со скоростью 0,3 ⁰С/мин. Далее, перенос эмбриона в жидкий азот.

Размораживают эмбрионы при 25 или 37 ⁰С в течение 10-12 с. Затем их отмывают от криопротектора и оценивают. Выживаемость эмбрионов должна быть не ниже 80%, стельность 55-60%, в этом случае трансплантация зоотехнически и экономически рентабельна.

Отбор, подготовка и пересадка эмбрионов реципиентам.

В среднем на одного донора отбирают 5-6 реципиентов, с учетом возможной последующей выбраковки из-за непригодности их к воспроизводству. Коровы-реципиенты должны быть не старше 7 лет с отсутствием гинекологических отклонений, хорошими племенными кондициями и воспроизводительными качествами. Телки-реципиенты должны быть 16-18 месячного возраста с живой массой 350-380 кг.

Результаты пересадки эмбрионов у коров бывают высокими только в том случае, если день овуляции у доноров и реципиентов совпадает по времени, тогда слизистые половых органов доноров и реципиентов находятся в идентичных физиологических состояниях.

Для этого проводят групповую синхронизацию половой охоты. Расхождения в синхронизации не должно превышать  12 ч. Запаздывание охоты у реципиентов на 10-12ч достоверно снижает процент проживляемости эмбрионов, а опережение охоты на 12 ч не влияет на эффективность приживляемости трансплантантов.

При правильной синхронизации можно достичь 90% стельности реципиентов, тогда как расхождение в проявлении половой охоты между донором и реципиентом более чем на 24 ч, снижает отельность до 50% и ниже.

Разработаны способы пересадки эмбрионов реципиентами – хирургический и нехирургический. При хирургическом способы пересадки эмбрионов применяют лапаратомию по белой линии живота или в области подвздоха. Лапаратомия проводится под общим наркозом при спинном положении животного. Длина разреза по белой линии живота составляет 10 см.

До 70-х годов для извлечения и пересадки эмбрионов крупного рогатого скота использовали в основном хирургический способ. Однако, он требует больших затрат средств. Поэтому в последние 10-15 лет пересадку эмбрионов в основном осуществляют нехирургическим способом.

Основным преимуществом нехирургического способа пересадки эмбрионов, кроме простоты большой экономичности, является возможность многократного использования реципиента. Разработано несколько способов, но все они основаны на одном принципе – введении эмбриона в рог матки через шейку, вследствие чего этот способ назван цервикальным. Катетер, в котором находится пайета с эмбрионом, осторожно вводят до шейки матки и под ректальным контролем проводят через цервикальный канал, глубоко в рог матки ближе к его верхней части и выталкивают эмбрион вместе со средой в просвет рога матки.

На 60-е сутки после пересадки эмбрионов, реципиентов проверяют на наличие стельности методом ректальной пальпации. Этот метод является классическим и дает большую точность.

Внедрение методов трансплантации эмбрионов и увеличения многоплодия коров обуславливает необходимость определения происхождения телят. Для этого используют группы животных с их антигенами. Одинаковые группы крови возможны лишь у однояйцовых близнецов. Определение и уточнение происхождения телят необходимы в связи с тем, что могут быть ошибки при ведении племенного учета, использования спермы разных быков. Группы крови животных определяют в специальных лабораториях моноспецифическими сыворотками.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизма экстракорпорального оплодотворения ооцитов, или оплодотворения in vitro (т.е. вне животного организма), позволяющего более интенсивно использовать в воспроизводстве высокоценных в племенном отношении коров, что позволит резко увеличить генетический прогресс в популяции.

В настоящее время разработаны методы, позволяющие выделить из яичников коров до 200 ооцитов, культивировать их и оплодотворять in vitro. Однако выход полноценных эмбрионов остается крайне низким, поэтому продолжаются исследования направленные на разработку новых и совершенствование прежних методик.

Оплодотворение ооцитов in vitro достигнуто у 20 видов млекопитающих, в т.ч. и у человека, в 1981 г. получено нормальное потомство. Процесс оплодотворения гамет проходит экстракорпорально и в контролируемых условиях. Окончательной оценкой истинного оплодотворения ооцитов in vitro является пересадка зиготы реципиенту и рождение живого животного.

Культивирование ооцитов in vitro.

Экстракорпоральному оплодотворению предшествует культивирование ооцитов in vitro.

Под культивированием ооцитов in vitro понимают процесс созревания незрелых ооцитов в искусственных питательных средах, в которых незрелые ооциты проходят мейотическое созревание до метафазы второго деления, т.е. до стадии готовности к оплодотворению.

Для выделения ооцитов из фолликулов, как правило, используют яичники от убитых коров и реже яичники, извлеченные оперативным путем. После извлечения, лучшие яичники (диаметром 2-6 мм) отбирают, остальные выбраковывают. Наиболее приемлем метод извлечения ооцитов из фолликулов путем рассечения их лезвием. Под контролем стерео микроскопов МБС-9 и МБС-10 отбирают ооциты с компактными кумулюсом.

Для оценки ооцитов по жизнеспособности разработано несколько методов, наибольшее распространение из которых получил морфологический.

К основным морфологическим признакам, характеризующим биологическую полноценность ооцитов, относят структуру клеток кумклюса и самого ооцита.

Ооцит размером 2-6 мм окружен клетками кумулюса. Компактный, многослойный, плотно прилегающий к ооциту кумулюс служит критерием устойчивости к атретическим изменениям в фолликуле, из которого извлечен ооцит.

Ооциты, пригодные для культивирования, должны отвечать следующим требованиям: форма округлая; ооплазма мелкозернистая, гомогенная, равномерно заполняет весь ооцит; прозрачная оболочка равномерная по ширине, опалесцирует, округлой формы; кумулюс компактный, многослойный, плотно прилегающий к ооциту, однородный.

Жизнеспособность ооцитов определяют с помощью флюоресцентных красителей. Нежизнеспособные клетки окрашиваются через 7-10 мин, в то время как жизнеспособные не окрашиваются. Ооциты, отвечающие необходимым требованиям ставят на культивирование.

Разработано несколько способов культивирования ооцитов. Основные из них: культивирование в закрытых сосудах; в чашках Петри питательной среде покрытой слоем вазелинового масла. При любых способах культивирования необходимы: стерильность на всех этапах работы; газовой стера; температура 39 ⁰С при максимальной влажности.

Для культивирования ооцитов млекопитающих в зависимости от вида животных используют культурные среды двух видов: простые и синтетические.

Во всех средах с указанными добавками (ЛГ, ФСГ и др.) 80 % ооцитов достигают стадии метафазы второго деления созревания. Таким образом, во время созревания ооцитов in vitro полностью завершается первое мейотическое деление, а второе деление созревания большинства ооцитов заканчивается стадией мейоза метафазы II. Окончательное завершение мейоза происходит после оплодотворения.

Изменения в белковом синтезе ооцитов связаны не с ядерным, а с цитоплазматическим созреванием, имеющим решающее значение для нормального оплодотворения и раннего эмбрионального развития вплоть до имплантации эмбриона в стенку матки реципиента.

Капацитация спермиев.

Чтобы спермии могли оплодотворять яйцеклетку, в них должны произойти изменения, характеризующие капацитацию, т.е. их готовность к оплодотворению.

Под капацитацией (созреванием) спермиев понимают комплекс физиологических и физико-химических изменений, в результате которых спермии преобретают способность проникать через блестящую оболочку, пенетрировать и оплодотворять яйцеклетку.

В естественных условиях капацитация происходит во время прохождения спермиев по генитальному тракту самки, где они отдельно от семенной плазмы. Капацитация может осуществляться in vitro, если спермии будут находиться в определенных культурной и газовой средах.

Для капацитации спермиев крупного рогатого скота разработаны культуральные среды: Кребса-Рингера, Тироде, Бринстера. Продолжительность капацитации спермиев в этих средах составляет 8 часов.

Для экстракорпорального оплодотворения применяют глубокозамороженную сперму, упакованную в пакеты.

Особую проблему представляет объективная оценка капацитации спермиев. Для доказательства капацитации используют акросомную реакцию. После прикрепления спермиев к зоне пеллюцида яйцеклетки происходит акросомная реакция.

Акросома представляет собой органеллу спермия, богатую различными ферментами и расположенную под плазматической мембраной, окружающей головку спермия. При акросомной реакции освобождаются ферменты, обуславливающие оплодотворяющую способность спермиев. Ферменты разрушают зону пеллюцида, что позволяет спермию продвинутся в ооплазму ооцита. Из множества проникших сквозь зону пеллюцида ооцита спермиев лишь один сливается с плазматической мембраной яйцеклетки и оплодотворяет ее. Возникает зигота.

Экстракорпоральное оплодотворение in vitro созревших ооцитов сводится к следующему. Ооциты коров, достигшие стадии созревания метафазы II, оплодотворяют капацитированными спермиями. У ряда видов с.-х. животных в зависимости от качества созревших in vitro гамет оплодотворяемость составляет 50-70 %. Основной причиной снижения способности к эмбриональному развитию in vitro оплодотворенных яйцеклеток является несовершенство культуральных сред для ранних эмбрионов, вследствие чего развитие эмбрионов блокируется на стадии 8-16 бластомеров.

Получение эмбрионов из оплодотворенных in vitro ооцитов.

Конечная цель экстракорпорального оплодотворения созревших in vitro ооцитов – получение эмбрионов пригодных для трансплантации. При культивировании ранних эмбрионов крупного рогатого скота в большинстве случаев эмбриональное развитие блокируется на стадии 8-16 клеток, т.е. когда в естественных условиях эмбрионы переходят из яйцевода в матку. Лишь единичные эмбрионы развиваются до стадий поздней морулы и бластоцисты, пригодных для трансплантации.

Инкубацию эмбрионов проводят двумя способами: в яйцеводе кролика, овцы или коровы и в культурных средах, таких как ТС-199; ХЭМ-Ф-10; МРМ, солевые растворы Дюльбекко, Брингстера с различными биологическими и синтетическими добавками.

Первый контроль за развитием зародыша проводят через 24 часа после оплодотворения. Сингамия, т.е. вступление в тесный контакт пронуклеусов, в результате чего происходит окончательное слияние мужской и женской гамет, наблюдается через 19 часов после экстракорпорального оплодотворения и образование двухклеточного эмбриона через 22 часа.

В 1983 г. родился первый теленок из дозревшего in vitro фолликулярного ооцита после его экстракорпорального оплодотворения. Несмотря на существенные положительные результаты по экстракорпоральному оплодотворению ооцитов и получению эмбрионов in vitro, многие проблемы, такие, как совершенствование культивирования ооцитов in vitro, капацитации сперматозоидов и др. остаются нерешенными.

Клонирование животных

Термин «клон» (побег) был впервые использован в 1903 г. Вебером (Германия) применительно к растениям, размножающимся вегетативным путем и означал, что дочерние растения клона генетически идентичны материнскому.

Методы получения генокопий:

1. Пересадка ядер соматических клеток в энуклеированную яйцеклетку;

2. Индуцирование партеногенеза (андрогенез, гиногенез), позволяющего полностью передавать потомкам генотип или матери име отца.

Дифференцированная соматическая клетка содержит полный набор генов свойственных данному организму. Кариотип таких клеток не отличается ничем от кариотипа оплодотворенной яйцеклетки (зиготы).

У животных в соматических клетках после их дифференциации (7-8 день) происходит стабильная репрессия или инактивация части генома, что ограничивает использование ядер дифференцированных клеток в клонировании.

Этапы клонирования:

1. 
   Извлечение ядер (бластомеров у 8-16 клеточного эмбриона);
   
2. 
   Разделение яйцеклетки-реципиента на ядросодержащий и безъядерный фрагменты (получение энуклеированной яйцеклетки);
   
3. 
   Слияние энуклеированной яйцеклетки с ядром (бластомерам) с помощью инактивированного вируса Сендай или электрического поля;
   
4. 
   Помещение реконструированной зиготы огаровый цилиндр;
   
5. 
   Культивирование эмбрионов в яйцеводах промежуточных реципиентов до стадии бластоцисты (7-8 дней);
   
6. 
   Пересадка бластацисты конечному реципиенту.
   

С генетической точки зрения химеры – это продукт объединения 2 и более ранних эмбрионов, вследствие чего они обладают сложным комбинированным генотипом.

Разработан В. Тарковским (1961) и Б. Минцем (1962) при получении химерных мышей.

Из яйцеводов самок извлекают эмбрионы на 4-5 день после оплодотворения (8-16 бластомеров), обрабатывают ферментом проназой с целью освобождения от прозрачной оболочки и сближают их с помощью стеклянной микроиглы или толчков струн из микропипетки в питательной среде под слоем парафинового масла на обогреваемом столике микроскопа (t⁰ +37⁰С). Объединенные эмбрионы культивируют в течение 24-48 часов до завершения агрегации.

Инъекционный метод создания химер

Разработан Р. Гарднером (1968).

При этом используют эмбрионы на стадии бластоцисты (7-8 дней). Эмбрион удерживают всасывающей пипеткой, закрепленной на манипуляторе, путем прокалывания прозрачной оболочки делают отверстие 2 стеклянными иглами и растягивают его. В образованную щель вводят третью иглу и с ее помощью щель превращается в отверстие – формы, в которое инъекционной пипеткой впрыскиваются внутренняя клеточная масса эмбриона – донора.

Получение трансгенных животных.

Современные методы селекции с.-х. животных базируются на использовании внутривидовой генетической изменчивости. Как правило виды генетически изолированы друг от друга, т.е. не скрещиваются между собой, т.к. этому препятствуют так называемые механизмы репродуктивной изоляции:

а) презиготические – препятствуют образованию зигот;

б) постзиготические – снижение жизнеспособности и плодовитости животных.

Преодолеть биологические границы видов и использовать межвидовую генетическую изменчивость для создания новых форм животных можно с помощью переноса генов.

Под переносом чужеродных генов понимают пересадку вне организма рекомбинантных молекул ДНК в клетке другого животного, вне зависимости от видовой принадлежности.

Если чужеродный ген интегрировался в геноме другого животного, то такой ген обозначается как трансген, а животные называются трансгенными. Кодируемый трансгеном белок носит название трансгенного продукта. Если животные передают трансгены своим потомкам, то образуются трансгенные линии.

Если произошла интеграция чужеродного гена в клетках высших животных, то они становятся носителями новых наследственных свойств и продуцируют новые для них вещества.

1. 
   Микроинъекцию рекомбинантной ДНК в пронуклеус зиготы;
   
2. 
   Использование ретровирусов в качестве векторов;
   
3. 
   Инъекцию трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион.