Комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для клинического применения

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

Астрелина Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук

Бубнова Людмила Николаевна - доктор медицинских наук, профессор

Санкт-Петербург

2014г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

1. 
   Преимущества и недостатки пуповинной крови, как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток……………………………………..12
   
2. 
   Создание банков пуповинной крови…………………………………………..16
   
3. 
   Сбор и обработка пуповинной крови…………………………………………18
   
4. 
   Тестирование концентратов пуповинной крови…………………………….22
   
5. 
   Криоконсервирование и долгосрочное криохранение
   

1. 
   Криопротекторы………………………………………………………………..28
   
2. 
   Этапы замораживания и долгосрочное криохранение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови………………………………………………..31
   
1. 
   Размораживание криоконсервированных клеток пуповинной крови………………………………………………………………………………..….33
   
2. 
   Клиническое применение криоконсервированных
   

2.1. Материал исследования………………………………………………………..40

2.2. Методы исследования………………………………………………………….46

2.3. Статистическая обработка результатов……………………………………….49

3.1. Биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®»……………………………………………………………….51

3.2. Влияние отечественного криопротектора ДМСО+реополиглюкин

на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови……………...67

3.3. Анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра и эффективность подборов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в городе Москве…………………………………………………………………………71

3.4. Алгоритм работы общественного банка-регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови ……………………………………………………………89

Эффективность первых аллогенных трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК) пуповинной крови (ПК) у пациентов с различными заболеваниями привела к широкомасштабному развитию клинических исследований в данной области (Gluckman Е., 2009; Kurtzberg J., 1994, 1996; Wagner J.E., 1996; Rubinstein Р., 2009; Broxmeyer, H.E., 2011).

Благодаря уникальным свойствам клеток ПК, относительной простоте и безопасности их заготовки, на сегодняшний день ПК стала одним из наиболее востребованных альтернативных источников гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) во многих странах мира (Gluckman Е., 2011; Ballen K., 2013). Ежегодно в мире проводится более 3000 алло-ТГСК ПК пациентам с различными заболеваниями (Rocha V., Broxmeyer H.E., 2010).

С целью обеспечения систематической заготовки гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) ПК для длительного криохранения и использования их в клинической практике было создано 160 успешно функционирующих банков ПК, в которых на криохранение находится более 600 000 тестированных образцов ПК (Rubinstein P. 2009; Welte K., 2010; Lauber S. et al, 2010; Wagner J.E., Gluckman E., 2010; URL:https://www.bmdw.org/). Современная система банков ПК позволяет в короткие сроки накопить большое количество тестированных образцов ПК, создать общественный регистр) и подобрать подходящего донора для большинства пациентов, нуждающихся в проведении алло-ТГСК (Navarrete C., 1998; Armitage S., 1999; Brown J., 2000; Davey S., 2004, Бубнова Л.Н., 2008).

Успех алло-ТГСК ПК во многом зависит от качества криоконсервированных ГСК ПК (Wagner J.E., 2002; Gluckman Е., 2005; Абдулкадыров К.М., 2006).

Для оценки качества ГСК ПК в США, Италии и Японии были проведены исследования, которые продемонстрировали высокий процент сохранения ГСК во время криохранения (Вroxmeyer H.E. 2003, 2011; Zinno F., 2011). Рядом зарубежных авторов были показаны преимущества криохранения концентратов пуповинной крови в автоматизированном системе «BioArchive» и «mini-Bioarchive» (Rubinstein P., 2004; Miura J., 2008). В России аналогичные исследования единичны. В 2012 году были представлены данные по оценке сохранности CD45+, CD45+/СD34+ клеток, колониеобразующей способности ГСК ПК и длины теломер в зависимости от различных способов криоконсервирования (программное и неконтролируемое замораживание) и краткосрочного криохранения (Карпова Н.С, 2012). Также было проведено исследование по изучению влияния метода выделения ядросодержащих клеток (ЯСК) на ГСК ПК (сохранность и жизнеспособность CD45+, CD45+/СD34+ клеток) до и после криохранения в течение 7,0 ±0,42 месяцев (Хурцилава О.Г., 2012).

Одним из наиболее перспективных направлений является поиск оптимального комбинированного криопротектора, способного сохранить качество ГСК ПК для дальнейшего клинического применения (Cilloni D., 1999; Galmes A., 1999; Halle P., 2001; Bakken A.M., 2003). В России было проведено только одно исследование по оценке влияния стандартного комбинированного криопротектора ДМСО в сочетании с декстраном 40 (Pall, Великобритания) на качество ГСК ПК (Смолянинов А.Б., 2009).
Степень разработанности темы.

Вышеизложенные данные не охватывают весь комплекс по оценке качества ГСК ПК, необходимый для более полной характеристики трансплантационного материала. Не завершены исследования, направленные на поиск новых оптимальных комбинированных криопротекторов с использованием отечественных материалов, которые обеспечивали бы достаточное количество и функциональную сохранность ГСК ПК после криохранения. Востребовано постоянное получение новых данных о распределения частоты HLA - гаплотипов в регистре банков ПК для целенаправленного поиска доноров ПК, что особенно актуально для многонациональной России. Все это обуславливает актуальность настоящего исследования.

Оценить качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови, находящихся на длительном хранении в автоматизированном системе «BioArchive®», для клинического применения.

1. 
   Изучить клеточный состав концентрата пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток (количество CD45+/СD34+ клеток, жизнеспособность СD45+ клеток, колониеобразующую активность) до и после длительного криохранения.
   
2. 
   Определить влияние методов обработки, концентрации гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
   
3. 
   Исследовать влияние отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, на качество криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
   
4. 
   Проанализировать иммуногенетические характеристики общественного регистра и эффективность подбора гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в г. Москве.
   
5. 
   Разработать алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT (International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release).
   

Впервые в России представлена комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови (биологические и иммуногенетические характеристики), находящихся на длительном криохранении в автоматизированной системе «BioArchive®».

Изучение клеточного состава концентрата пуповинной крови и биологических характеристик гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» показало, что общее количество ядросодержащих клеток незначительно снижается, преимущественно за счет фракции гранулоцитов, колониеобразующая активность гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови сохраняется на достаточно высоком уровне. Это позволяет использовать клеточный концентрат пуповинной крови в качестве альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток.

Выявлено, что на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» влияют метод выделения, величина гематокрита после лейкоконцентрации и концентрация гемоконсерванта CPDA в концентрате пуповинной крови перед криохранением.

Установлено, что отечественный комбинированный криопротектор ДМСО+реополиглюкин позволяет сохранять высокое качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови во время криохранения и может использоваться для длительного криохранения.

Впервые проанализирован характер распределения HLA-гаплотипов в общественном регистре гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москвы и показано, что характер распределения в целом соответствует славянам центральной и восточной Европы, а частота вероятности совместимости пары донор - реципиент по 3- генам HLA - системы (локусы А, В, DRB1) составляет 1:218.

Впервые разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD - FACT.
Теоретическая и практическая значимость

Криоконсервированные гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®» являются качественным материалом и могут быть использованы в клинической практике.

В результате проведенного исследования установлены факторы, влияющие на клеточный состав концентратов пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток после криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», которые необходимо учитывать при использовании клеточных концентратов пуповинной крови в клинической практике: метод выделения ядросодержащих клеток, величина гематокрита после процесса лейкоконцентрации и содержание гемоконсерванта CPDA до криохранения.

Иммуногенетические особенности общественного регистра гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови Московского банка стволовых клеток позволяют проводить целенаправленный поиск совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для пациентов из различных регионов России.

Предложенный алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD -FACT позволит усовершенствовать работу в подобных учреждениях.
Методология и методы исследования

В работе были использованы общенаучные (анализ проспективный и ретроспективный, обобщение данных) и частные научные методы (лабораторные, клинические), а так же методы математической статистики.

На первом этапе исследования были изучены клеточный состав концентрата пуповинной крови и биологические характеристики гемопоэтических стволовых клеток до и после длительного криохранения в автоматизированной системе «BioArchive®», было выявлено влияние методов обработки, содержания гемоконсерванта CPDA, величины гематокрита на качество гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови после криохранения. Далее была установлена целесообразность использования отечественного комбинированного криопротектора ДМСО+реополиглюкин, предложенного в Московском банке стволовых клеток, при заготовке пуповинной крови для длительного криохранения. Был проведен анализ иммуногенетических характеристик общественного регистра, включающий характер распределения HLA-гаплотипов и эффективность подбора совместимых образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови г. Москве. На заключительном этапе проведенной работы был разработан алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT.
Положения, выносимые на защиту

1. 
   Предложенный комплекс по оценке биологических характеристик криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в автоматизированной системе «BioArchive®» всесторонне характеризует качество трансплантационного материала. Методы обработки пуповинной крови, концентрация гемоконсерванта CPDA и величина гематокрита перед криохранением оказывают влияние на биологические характеристики криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
   
2. 
   Комбинированный отечественный криопротектор ДМСО+реополиглюкин, предложенный в Московском банке стволовых клеток, является эффективным криоконсервирующим раствором и может использоваться для длительного криохранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови.
   
3. 
   Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT, усовершенствует работу общественных регистров гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови в подобных учреждения.
   

Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки.

Апробация диссертации проведена 4 марта 2014 г. на расширенном заседании Проблемной комиссии №3 ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства».

Материалы диссертации доложены на: XV конгрессе педиатров России с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Москва, 2011г.), международном симпозиуме «ACUTE LEUKEMIAS XIII Biology and Treatment Strategies» (Мюнхен, 2011г.), 37 Международном симпозиуме Европейской группы EBMT (Париж, 2011г.), на V международном симпозиуме «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей и взрослых памяти Раисы Горбачевой» (Санкт-Петербург, 2011г.), на V научно-практической конференции «Современная гематология. Проблемы и решения» (Москва, 2011г.), на Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии» (Беларусь, 2011г.), на XXXIX сессии «Мультидисциплинарный подход к гастроэнтерологическим проблемам» (Москва, 2013г.), на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013г.), 8^th East-West «Immunogenetics conference» (Вена, 2014).

Результаты исследования были внедрены в практику работы Государственного Бюджетного Учреждения Здравоохранения «Банка стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы» и Научно-Исследовательского института детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М.Горбачевой Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова (ИДГиТ СПГМУ МЗ и СР РФ им. академика И.П. Павлова).

Результаты диссертационной работы войдут в Методические рекомендации “Алгоритм взаимодействия Московского банка стволовых клеток с клиническими центрами, адаптированный к условиям организации здравоохранения в Российской Федерации и с учетом международных рекомендаций NETCORD-FACT”.

ГЛАВА I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток за последние 50 лет прочно вошла в практическую медицину как эффективный метод лечения заболеваний крови, иммунной системы, нарушений обмена веществ и онкологических заболеваний [46;69]. Во всем мире ежегодно количество проведенных трансплантаций увеличивается, а показания к данному виду терапии расширяются. Во многом эффективность алло-ТСГК зависит от наличия гистосовместимого донора ГСК и скорости его подбора. При этом, чем выше результаты индивидуальной совместимости пациента и донора по генам HLA-системы, тем меньше риск отторжения трансплантата в связи с преодолением биологической несовместимости тканей [14;17]. «Золотым» источником ГСК для алло-ТГСК является костный мозг (КМ) от гистосовместимого родственного донора, но вероятность найти внутри семьи HLA – идентичных сиблингов составляет лишь 25%, а найти подходящего неродственного донора, несмотря на наличие более 20 млн. зарегистрированных добровольных доноров костного мозга во всем мире [URL:https://www.bmdw.org/], удается не более чем в 30% случаев [15;21]. Для представителей некоторых групп эта возможность еще меньше, так как часть встречаемых HLA - аллелей и гаплотипов являются общими для этнических популяций; а другие преимущественно принадлежат какой-то одной популяционной группе [7]. Поэтому поиск неродственного HLA-совместимого донора – это весьма трудоемкий и длительный процесс, связанный с существенными временными и финансовыми трудностями. В среднем подбор донора может занимать около 3-4 месяцев, и зачастую пациент просто не доживает до трансплантации [1;51;59;63;80;118].

Другими серьезными проблемами являются тяжелые посттрансплантационные осложнения, которые существенно ограничивают успех алло-ТГСК костного мозга и вызваны несовместимостью иммунокомпетентных клеток донора и реципиента. В первую очередь это отторжение трансплантата и развитие острой реакции «трансплантат против хозяина» (о. РТПХ). Зачастую они носят жизнеугрожающий характер, становясь основными причинами неудач и нежелательных отсроченных явлений.

Перечисленные ограничения применения клеток костного мозга привели к поиску альтернативных источников ГСК, и одним из наиболее перспективных является пуповинная кровь (ПК). В течение последних 25 лет ПК активно используется во многих странах мира для лечения пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями [57].

Благодаря впервые успешно выполненной родственной алло-ТГСК предварительно криоконсервированной цельной ПК ребенку с анемией Фанкони от HLA-идентичного донора [64] удалось доказать, что одна единица ПК, ранее считавшаяся «биологическим отходом», содержит достаточное количество ГСК и ранних предшественников гемопоэза, способных восстановить кроветворение после миелоаблативной терапии. При этом было показано, что стволовые клетки ПК сохраняют свои биологические характеристики после криоконсервации [35;64].

На сегодняшний день в мире было выдано более 30 000 образцов ПК от родственных и неродственных доноров для проведения алло - ТГСК [21] пациентам с различными заболеваниями (Таблица 1) [27;45;49;50;52;73;77;83;87;89;107;128;135].

1. 
   Преимущества и недостатки пуповинной крови, как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток
   

В-лимфоциты ПК в основном презентируют пустые молекулы HLA - антигенов второго класса, в то время как В-лимфоциты взрослых нагружены пептидами. Синтез противовоспалительного интерлейкина-12 мононуклеарными клетками (МНК), являющимся ключевым цитокином для усиления клеточно-опосредованного иммунного ответа и инициации, существенно снижен при сравнении с другими источниками ГСК [130].

Однако в ходе проведенных клинических исследований по применению ГСК ПК [23;64;113] был выявлен и ряд недостатков, который в настоящее время сдерживает ее широкое использование.

Прежде всего, это ограниченное количество ГСК в одном образце криоконсервированной ПК и отсутствие возможности повторного сбора клеток у донора. Это существенно ограничивает использование ПК у пациентов с массой тела более 20 кг.

Во-вторых, было отмечено увеличение периода миелотоксического агранулоцитоза и тромбоцитопении после алло-ТГСК ПК по сравнению с другими источниками ГСК, что сопряжено с высоким риском развития оппортунистических инфекций [58;113;121].

И в-третьих, отсутствие возможности трансфузии донорских лейкоцитов.

Безусловно, выявленные недостатки ограничивают широкое использование ПК в качестве альтернативного источника ГСК. Однако уникальные свойства ее клеток, усовершенствование методов обработки и криоконсервации, внедрение единых стандартов в работу банков ПК, улучшение подборов образцов ПК для клинического применения, возможность использования нескольких единиц ПК при недостаточном количестве ГСК, позволяют надеяться, что некоторые из этих проблем будут разрешены в ближайшем будущем. Во многих лабораториях мира продолжаются многочисленные исследования, направленные на изучение микроокружения и взаимодействия между собой стволовых клеток ПК, идет поиск путей увеличения количества ГСК в одном образце ПК, как за счет усовершенствования методов забора, так и за счет разработки методов их экспансии in vivo и/или ex vivо [39].

2. 
   Создание банков пуповинной крови
   

История развития банков ПК началась с лаборатории микробиологии и иммунологии штата Индиана (США) под руководством профессора Broxmeyer H.J., который стал инициатором развития данной программы. В его лаборатории на хранение были заложены первые образцы ПК от родственных доноров. Были разработаны методы сбора и хранения цельной ПК, которые продемонстрировали возможность транспортировки образцов ПК между различными центрами, оценили биологические свойства ГСК и их пролиферативный потенциал [16;31].

В последующем, с ростом числа алло-ТГСК ПК, для расширения коллекции криоконсервированных образцов ПК и улучшения качества подборов пары донор-реципиент, появилась необходимость развития программ по безвозмездному донорству и открытию государственных банков ПК [119]. Первые государственные банки ПК появились в начале 90-х годов Нью-Йорке, Милане и Дюссельдорфе [20], а в последующем и во многих странах мира. В Нью-Йоркском центре крови под руководством Р. Rubinstein, был разработан первый протокол по обработке, криоконсервированию, хранению и разморозке криоконсервированных образцов ПК [120], который до настоящего времени является основным документом при заготовке ПК во многих странах мира.

Сегодня по данным Всемирной организации доноров костного мозга (Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW) в различных странах мира насчитывается 158 государственных банков ПК где на криохранении находится более 600 000 полностью тестированных образцов ПК [URL:https://www.bmdw.org/; 87;102;124;136].

В связи с появлением большого числа банков ПК в 1998 году была учреждена группа NETCORD, призванная обеспечить соблюдение условий криохранения ПК, в соответствии со стандартами GMP (Good Medical Practice), создать международную сеть и облегчить поиск доноров ГСК ПК, улучшить качество трансплантационного материала и стандартизировать их в международном масштабе, и, что особенно важно, установить процедуры аккредитации банков ПК совместно с Международным Фондом Аккредитации Клеточной Терапии (FACT) [URL:https://www.netcord.org/].

В 2000 году группой NETCORD-FACT впервые были разработаны международные стандарты для аккредитации банков ПК по сбору, обработке, тестированию, заготовке, подбору и выдачи образцов ПК для клинического применения – International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release [URL:https://www.factweb.org/]. В настоящее время в мире 18 банков ПК уже получили аккредитацию в NETCORD-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации [URL:https://www.netcord.org/,109].

Таким образом, на сегодняшний день вся информация о доступных криоконсервированных образцах ПК, заготовленных в банках ПК, содержится в двух взаимосвязанных международных регистрах: в NETCORD - информация только о криоконсервированных образцах ПК, и во всемирной организации доноров костного мозга (BMDW), где содержится информация как о донорах костного мозга, так и о доступных единицах ПК [102].

Первостепенной задачей, которая стоит перед современными банками ПК является усовершенствование методов забора, выделения, криоконсервирования, хранения и разморозки ПК, с соблюдением контроля качества на каждом этапе согласно стандартам NETCORD, чтобы обеспечить трансплантационные центры высококачественным и безопасным материалом с максимальным количеством жизнеспособных стволовых клеток. Это приведет к дальнейшему прогрессу в области клеточной терапии и позволит улучшить клинические результаты [110].

3. 
   Сбор и обработка пуповинной крови
   

Как правило, объем ПК, подлежащей обработке и дальнейшему криоконсервированию, устанавливается в каждом банке индивидуально в соответствии с программами их работы и требованиями трансплантационных центров [102]. Однако, учитывая, что скорость восстановления гемопоэза после трансплантации ГСК ПК напрямую зависит от количества заготовленных ГСК [62;135], большинство банков ПК предпочитают оставлять на долгосрочное криохранение образцы с чистым весом более 40-70 г и количеством выделенных ядросодержащих клеток (ЯСК) не менее 3х10⁷/кг [58;64;135].

Сбор ПК осуществляется после получения информированного согласия роженицы, рождения ребенка и отделения его от последа в закрытые системы для сбора крови с гемоконсервантом CPDA (цитрат-фосфат-декстроза-аденин) [URL:https://www.netcord.org/; 120]. На сегодняшний день в литературе практически отсутствуют данные о влиянии гемоконсерванта CPDA на качество ГСК ПК. Единственное исследование, которое было проведено польскими исследователями, выявило умеренную токсичность CPDA на CD45+/CD34+ клетки при увеличении времени его взаимодействия с ПК [93].

Транспортировка ПК должна осуществляться при температуре от +4С до +22С; обработка полученных образцов проводится не позднее, чем через 24 часа от момента сбора, так как при увеличении сроков хранения жизнеспособность ГСК существенно снижается [URL:https://www.netcord.org/; 13;31;32;126]

Первоначально, для обработки ПК и выделения ЯСК использовали протоколы, разработанные для выделения МНК КМ. При этом ПК подвергалась криоконсервированию без предварительной обработки сразу после добавления криоконсерванта ДМСО. Это позволяло сохранить до 100% ЯСК [31], однако привело к ряду существенных проблем [120]:

1. 
   Большой объем заготавливаемого материала требовал большого криогенного хранилища и существенных финансовых затрат.
   
2. 
   Криоконсервирование цельной ПК подразумевало введение больших объемов криопротектора ДМСО, что снижало его защитные функции на стволовые клетки и увеличивало риск развития побочных эффектов при трансплантации ГСК ПК.
   
3. 
   Продукты лизиса эритроцитов и гранулоцитов, образующиеся во время процессов замораживания и размораживания, неблагоприятно влияли на жизнеспособность ГСК.
   
4. 
   Увеличивался риск развития реакции несовместимости между донором и реципиентом по эритроцитарным антигенам.
   

В 1995 году в качестве основного протокола обработки ПК для клинического применения, был предложен неавтоматический метод (ручной способ) сепарации ПК, основанный на увеличении скорости седиментации эритроцитов путем добавления к цельной ПК 6% гидроксиэтилкрахмала с последующим двойным центрифугированием на низких скоростях и сепарацией ЯСК [26;48;71;106;120]. Данный метод позволил сократить объем цельной ПК до 20 - 21 мл с сохранением до 90% ЯСК в жизнеспособном состоянии, существенно сократить объемы вводимого криоконсерванта, уменьшить финансовые затраты на криохранение [86;112;120]. На сегодняшний день ручной способ обработки пуповинной крови остается одним из наиболее распространенных во многих странах мира.

Современным направлением при обработке ПК стало использование автоматических систем для выделения ЯСК, которые значительно сократили время процедуры, практически полностью исключили риск микробиологической контаминации и потери образца. В настоящее время наиболее распространены две технические системы – «Sepax» (Biosafe, Eysins, Switzerland) и «AutoЕхpres» (Termogenesis). Они представляют собой закрытые стерильные системы для обработки образца ПК любого объема. Принцип действия аппаратов основан на сепарации клеточных элементов путем центрифугирования на низких скоростях после добавления гидроксиэтилкрахмала («Sepax») или без него («AutoЕхpres»). Это позволяет разделять компоненты крови в соответствии с их плотностью и размерами. После центрифугирования эритроциты перемещаются в отдельный стерильный мешок, плазма остается в обрабатываемом контейнере, а полученный лейкоконцентрат в объеме 21 мл помещается в специализированный контейнер для дальнейшего криоконсервирования. Автоматический метод с использованием «Sepax» позволяет сократить уровень исходного гематокрита до 36-45%, сохранить до 80-87% ЯСК и до 86% клеток с иммунофенотипом СD45+/CD34+ [URL:https://www.biosafe.ch/; 86;116]. Эти результаты были подтверждены и в работах отечественных авторов при сравнении эффективности автоматического и неавтоматического методов сепарации крови [7].

В проведенных на сегодняшний день исследованиях не достаточно представлены данные о влиянии величины гематокрита после лейкоконцентрации на качество криоконсеврированных ГСК ПК после размораживания. Существует единственная публикация о влиянии величины гематокрита в криоконсервированных образцах ПК на жизнеспособность и пролиферативную активность ГСК после разморозки. В своем исследовании группа ученых показала, что в криоконсервированных образцах ПК с величиной гематокрита 45% пролиферативная активность ГСК снижалась до 40% по сравнению с образцами ПК с величиной гематокрита 23% [108].

В 2012 году отечественными авторами было проведено исследование о влиянии методов двойного центрифугирования (55 образцов ПК) и автоматической сепарации (30 образцов ПК) на качество ГСК ПК после размораживания. Замораживание образцов ПК осуществлялось в программном замораживателе с последующим погружением в дьюар с жидким азотом. В результате исследования при сравнении обеих групп было показано преимущество использования автоматического метода выделения ЯСК. Процент сохранения СD45+ и СD45+/CD34+ клеток составил 91,7% и 91,34% против 82,1% и 85,27% соответственно; жизнеспособность ЯСК 89,3% против 82,7%) [12].

Таким образом, на данном этапе обработки ПК, независимо от применяемого метода лейкоконцентрации, первостепенной задачей является заготовка качественного трансплантационного материала с сохранением максимального количества ГСК в биологически полноценном состоянии [112;117].