Анализ длины теломер

Для определения средней длины теломер лимфоцитов периферической крови пожилых респондентов применяли метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР), описанный Каутоном (Cawthon, 2002). С целью получения абсолютных значений средней длины теломер на геном использовали синтезированные олигонуклеотиды (O’Callaghan et al., 2008).

Оборудование: термоциклер АНК32 (ИАП РАН)

Реактивы: коммерческий набор «ПЦР Буфер Б» ЗАО «Синтол».

Tel1: 5’-ggt ttt tga ggg tga ggg tga ggg tga ggg tga ggg t-3’

Tel2: 5’-tcc cga cta tcc cta tcc cta tcc cta tcc cta tcc cta-3’

Реакционную смесь переносили в пробирки объемом 0,2 мл для проведения кПЦР. После добавления всех компонентов реакционную смесь перемешивали на вортексе, капли собирали коротким центрифугированием.

95^оС (5 мин)

5^оС (2 мин)

30 циклов

95^оС (15 сек)
Состав реакционной смеси для амплификации гена 36В4 (15 мкл):

1) деионизированная H2O	5,1мкл
2) 10хПЦР буферБ (500 мМ KCl, 150 мМ Трис-HCl (pH 8,8), 0,5% глицерин, 0,1% Твин-20)	1,5мкл
3) 2,5 мМ дНТФ	1,5мкл
4) 25 мМ MgCl2	1,5мкл
5) Праймер 36B4u	0,04мкл (300нМ)
6) Праймер 36B4d	0,07мкл (500нМ)
7)краситель SYBR® Green I	0,05 мкл
8)Taq ДНК-полимераза (5ед/мкл)	0,2мкл
9) ДНК-матрица (10нг/мкл)	5мкл

Последовательности праймеров к единичному гену 36B4:

36B4u: 5’-cag caa gtg gga agg tgt aat cc-3’

36B4d: 5’-ccc att cta tca tca acg ggt aca a-3’

Реакционную смесь переносили в пробирки объемом 0,2 мл для проведения кПЦР. После добавления всех компонентов реакционную смесь перемешивали на вортексе, капли собирали коротким центрифугированием.

9^оС (5 мин)

58^оС (1 мин)

95^оС (15 сек) 35 циклов

Параллельно с исследуемыми образцами ставились пробы с синтезированными олигонуклеотидами заданной длины и последовательности:

36B4: ACC CCA TTC TAT CAT CAA CGG GTA CAA ACG AGT CCT GGC CTT GTC TGT GGA TTA CAC CTT CCC ACT TGC TGA A

Tel: TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG

Среднюю длину теломер в пробе (в т.п.н.) рассчитывают исходя из калибровочного графика для последовательных разведений контрольного образца – синтетического олигонуклеотида заданной длины, несущему теломерную последовательность (O’Callaghan, 2008) (рис. 1). Расчёт средней длины на 1 геном проводят посредством нормировки числа копий теломерных повторов на число копий гена рибосомального фосфопротеина РО 36B4 (T/S), локализованного на 12 хромосоме и представленного в единичной копии (Boulay, 1999).

Анализ проводили с использованием набора DAKO Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry (DAKO, Дания) согласно инструкции. В качестве внешнего контроля использовали специальную клеточную линию Т-лимфобластной лейкемии 1301 (HPA Culture Collections, Великобритания), которая характеризуется стабильной длиной теломер (Hultdin, 1998). Данную культуру поддерживали в среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина и пенициллин/стрептомицина 100 мкг/мл (HyClone, США).

Клетки исследуемого образца и контрольной линии 1301 выравнивали по количеству после отмывки в PBS с добавлением 0,1% BSA. Одну часть образца и 1301 ресуспензировали в 300 мкл гибридизацинного раствора с пептидо-нуклеиновым зондом, меченным флюорохромом FITC и комплементарным теломерной последовательности ДНК, другую – без зонда. Далее проводили денатурацию ДНК при 82 ºС в течение 10 мин и гибридизацию в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Затем дважды осуществляли отмывку клеток с инкубацией в отмывочном буфере DAKO при 40 ºС в течение 10 мин. На следующем этапе клетки ресуспендировали в растворе DAKO для окраски ДНК (буфер, содержащий пропидиум йодид и РНКазу А) и выдерживали в течение 30 мин при 37 ºС в темноте.
Рис. 2. Пример измерения длины теломер с использованием логарифмических шкал FS, FL3 и FL1. Верхний ряд – проба без зонда, нижний – с зондом.


Пробы анализировали на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) с длиной волны 488 нм. Для выделения клеток на стадии клеточного цикла G₀/G₁ использовали логарифмическую шкалу FL3 (рис. 2). Относительную длину теломер (ОДТ) образца в процентах от длины теломер контрольной линии 1301 с учетом их тетраплоидности высчитывали следующим образом:

ОДТ = (П – А)_{образец} * (2 * 100)/(П – А)₁₃₀₁,