Иммунологические и молекулярно-биологические факторы персистирующего течения папилломавирусной инфекции 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология

Мария Александровна

ФАКТОРЫ ПЕРСИСТИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ

ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Челябинск – 2011
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Телешева Лариса Федоровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор	Рябинин Вячеслав Евгеньевич
доктор биологических наук, профессор	Пряхин Евгений Александрович

Ведущая организация: НИИ экологии и генетики микроорганизмов

УрО РАН, г.Пермь

На сегодняшний день папилломавирусная инфекция (ПВИ) является актуальной социально-значимой проблемой. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число инфицированных за последние десять лет увеличилось более чем в 10 раз, достигнув 23,5% [Белокриницкая Т.Е. и др., 2005; Козаченко В.П. и др., 2009]. Чрезвычайно важной представляется проблема ПВИ в связи с онкогенным потенциалом вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, который признан этиологическим агентом рака шейки матки (РШМ) [WHO, 2006]. Несмотря на высокую распространенность и онкогенный потенциал ВПЧ, высокий процент самопроизвольного регресса ПВИ свидетельствуют о том, что инфицирование является необходимым, но недостаточным условием для возникновения РШМ. По данным литературы, главным фактором риска развития неопластической патологии является персистенция онкогенных типов ВПЧ [Кузнецова Ю.Н. и др., 2009; Manavi M. et al., 2008; Castle P.E., 2009; Carcopino X. et al., 2011]. Считается, что канцерогенез является следствием “персистентных инфекций ВПЧ высокого риска” продолжительностью более 6 месяцев [Современные подходы…, 2009; Вакцины для профилактики…, 2011; Woodman C.B. et al., 2007; Koshiol J. et al., 2008; Bhat P. et al., 2011]. Тем не менее, понятие “персистирующая инфекция” – это только условное определение и не включает никакого функционального критерия, который бы опирался на молекулярные события, необходимые для развития канцерогенеза, вызванного ВПЧ. И хотя в настоящее время данный термин широко используется, крайне необходимо дифференцировать клинически значимые фазы течения инфекций ВПЧ высокого риска на основе молекулярных показателей [Doeberitz M. K., 2009].

Большую важность приобретают исследования, направленные на поиск вирусологических маркеров, ответственных за развитие персистирующего течения. В настоящее время, в качестве таких вирусологических факторов рассматриваются инфекция, вызванная онкогенными типами ВПЧ, а также несколькими типами вируса одновременно, высокая вирусная нагрузка, повышенная экспрессия онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ, сверхэкспрессия циклин-зависимых киназ p16INK4a и другие [Мынбаев О.А. и др., 2009; Вакцины для профилактики…, 2011].

Клинические наблюдения, а также данные экспериментальных исследований свидетельствуют о ведущей роли иммунной системы в контроле возникновения, течения и исхода ПВИ [Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2003, Роговская С.И., 2005; Stanley M., 2006]. Поскольку ВПЧ эпителиотропен, особо важное значение имеет состояние факторов местной защиты органов репродуктивного тракта. Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета в защите от ВПЧ, недостаточно изучены механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на формирование персистенции данного вируса. Учитывая тот факт, что персистенция ВПЧ высокого риска является ключевым событием в малигнизации клеток, изучение факторов, инициирующих этот процесс, и, следовательно, способствующих реализации онкогенного потенциала ВПЧ определяет актуальность настоящего исследования.

Установление иммунологических, молекулярно-биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения папилломавирусной инфекции и выявление маркеров персистенции вируса папилломы человека высокого риска.

1. 
   Установить типы вируса папилломы человека высокого риска, ассоциированные с транзиторным и персистирующем течением папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.
   
2. 
   Определить показатели вирусной нагрузки вируса папилломы человека высокого риска при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.
   
3. 
   Изучить иммунологические показатели цервикальной слизи при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.
   
4. 
   Определить взаимосвязь между молекулярно-биологическими и иммунологическими показателями цервикальной слизи при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.
   
5. 
   Установить маркеры персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.
   

Впервые установлен широкий спектр генотипов ВПЧ высокого риска при транзиторном и персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев. Показано преобладание ВПЧ 16 типа независимо от течения и длительности ПВИ. Впервые установлено, что транзиторное течение ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 типом вируса. Персистирующее течение ПВИ характеризуется высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. Установлено, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев определяются 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы ВПЧ высокого риска, в то время как при транзиторном течении ПВИ не установлено случаев инфицирования 35 типом ВПЧ, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев – 39 и 58 типами ВПЧ.

Впервые проведена комплексная оценка иммунологических факторов цервикальной слизи в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Выявлены общие закономерности изменений факторов местного иммунитета, сопровождающие наличие ВПЧ высокого риска в цервикальном канале обследованных женщин: снижение активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличение активности лизосомальных ферментов нейтрофильных гранулоцитов и уровня ИЛ-2. Установлено, что персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризуется снижением лизосомальной активности нейтрофилов и повышением концентрации IgG на фоне высоких уровней ИФН-α и ИФН-γ в цервикальной слизи относительно транзиторного течения ПВИ. Персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев сопровождается снижением интенсивности фагоцитарных реакций нейтрофилов, дефицитом ИНФ-α и повышенными концентрациями sIgA, IgA и IgМ в цервикальной слизи.

Впервые получены данные по показателям вирусной нагрузки в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Установлено влияние вирусной нагрузки на факторы локального иммунитета репродуктивного тракта женщины, определяющее развитие и длительность персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

Впервые с помощью бинарной логистической регрессии определены маркеры риска развития и длительности персистирующего течения ПВИ.

Теоретическая и практическая и значимость

Полученные данные расширяют представление о роли генотипа, концентрации вируса папилломы человека высокого риска и факторов местного иммунитета цервикальной слизи в развитии и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

На основании комплексного молекулярно-биологического и иммунологического исследования оперделены основные маркеры, определяющие риск развития и длительность персистенции ВПЧ высокого риска в репродуктивном тракте женщины.

Положения, выносимые на защиту

1. 
   Транзиторное течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины ассоциировано с вирусом папилломы человека 52 типа и инфицированием 1 генотипом вируса, персистирующее течение папилломавирусной инфекции характеризуется высокой частотой встречаемости микстинфекции вируса папилломы человека высокого риска и моноинфекции вируса папиллома человека 16 типа. Персистирующее течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины сопровождается высокими концентрациями вируса папилломы человека высокого риска и преобладанием случаев вирусной нагрузки выше 5 lg на 10⁵ клеток человека.
   
2. 
   Наличие вируса папилломы человека высокого риска в цервикальном эпителии характеризуется угнетением нейтрофильного звена местного иммунитета, в то время как развитие и длительность персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины определяется состоянием гуморального иммунитета и уровнем интерферонов в цервикальной слизи.
   
3. 
   Развитие персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины сопровождается изменением не только показателей вирусной нагрузки и местного иммунитета, но и взаимосвязей между ними.
   
4. 
   Выявленные особенности молекулярно-биологических факторов и иммунологических показателей цервикальной слизи позволяют определить маркеры риска развития и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.
   

Результаты исследований внедрены в клиническую практику женской консультации МУЗ ГКБ № 2 г.Челябинска, в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, в педагогическую практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, кафедры акушерства и гинекологии № 2 ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на: VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007); VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009); Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2009» (Санкт-Петербург, 2009); II-ом Ежегодном конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); VIII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции c международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010).

По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, в том числе 9 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 155 отечественных и 77 иностранных авторов. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста и включает 12 таблиц, 4 рисунка.

Для решения поставленных задач в период с 2008 по 2010 гг. на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории и Научно-исследовательского института иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» было проведено обследование 152 женщин с наличием ВПЧ высокого риска в цервикальном канале, являющихся пациентками амбулаторно-поликлинического приема женской консультации МУЗ ГКБ № 2 г.Челябинска. Критериями включения пациенток в данное исследование являлись: папилломавирусная инфекция, подтвержденная методом ПЦР; возраст  — от 18 до  45 лет; первая фаза менструального цикла. Критерии исключения: беременность; экcтрагенитальные заболевания в стадии декомпенсации; инфекционные заболевания в стадии обострения; хламидийная, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции урогенительного тракта; опухолевая патология.

Для установления факта персистенции ВПЧ высокого риска всем женщинам проводили повторное ВПЧ-тестирование (выявление, дифференциация и количественное определение ВПЧ высокого риска) методом ПЦР через 6 и 12 месяцев после первичного обнаружения вируса. На основании полученных данных ретроспективно все пациентки были разделены на 3 группы: 1 группу составили 68 пациенток с отрицательными результатами ВПЧ-тестирования через 6 и 12 месяцев после первичного выявления ВПЧ высокого риска (транзиторное течение ПВИ), 2 группу – 32 женщины с персистирующим течением ПВИ, у которых вирус выявлялся через 6 месяцев и не выявлялся через 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев), в 3 группу вошли 52 женщины с положительным ВПЧ-тестом через 6 и 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев).

Контрольную группу составили 32 женщины без ВПЧ высокого риска, клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии.

В группы с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев вошли женщины с эктопией шейки матки, хроническим цервицитом и их сочетанием, цервикальной интраэпителиальной неоплазией (ЦИН) I степени и без клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии. Диагноз выставлен акушерами-гинекологами женской консультаций МУЗ ГКБ № 2 на основании анамнестических, клинических и по показаниям кольпоскопического и морфологического методов исследования. Все пациентки с папилломавирусной инфекцией находились под наблюдением лечащего врача-гинеколога и по показаниям получали лечение в соответствии с установленной патологией. Средний возраст обследованных женщин составил 26,07±0,46 лет. Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и клиническим характеристикам.

Материалом для молекулярно-биологического исследования послужили соскобы эпителиальных клеток цервикального канала. Выявление и дифференциация ВПЧ высокого риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов проводили с помощью тест-системы «АмплиСенс^Ò ВПЧ ВКР генотип-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г.Москва. Количественное определение ДНК ВПЧ высокого риска проводили с помощью тест-системы «АмплиСенс^Ò ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Результаты концентрации ДНК ВПЧ выражались в lg (ВПЧ на 100 тыс. клеток человека) и оценивались следующим образом: вирусная нагрузка менее 3 – малозначимая, от 3 до 5 – значимая и более 5 – повышенная. Исследования проводили методом ПЦР в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия).

Для оценки иммунологических показателей у женщин исследовались цервикальная слизь, в которой определяли:

- общее количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание жизнеспособных нейтрофилов, показатели функциональной активности нейтрофилов с оценкой фагоцитарных реакций и содержания лизосом (Фрейдлин И.С., 1986), кислородозависимый метаболизм в НСТ тесте (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979).

- концентрации иммуноглобулинов A, M, G (IgA, IgM, IgG) определяли с помощью тест-систем ООО «Хема» (г.Москва), секреторного IgA (sIgA) - тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) методом ИФА.

- определение уровней ИНФ-α, ИНФ-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, РАИЛ-1, ФНО-α проводили методом ИФА с использованием тест-систем ООО «Цитокин»(г. Санкт-Петербург).

Результаты оценивали с помощью пакетов «Statistica  6.0» и MedCalc 10.2.0.0 с вычислением  средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m). Анализ количественных признаков производился с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Оценка качественных показателей осуществлялась с помощью  критерия  χ²  и точного  критерия  Фишера. Связь между исследуемыми показателями оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Для оценки диагностической эффективности молекулярно-биологических параметров и иммунологических показателей цервикальной слизи и построения математических моделей использовали бинарную логистическую регрессию. Во всех случаях различия, связи и зависимости считали статистически значимыми при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ частоты встречаемости генотипов ВПЧ высокого риска показал преобладание ВПЧ 16 типа как в группе с транзиторным течением ПВИ, так и в группах с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев (табл.1). Полученные нами результаты согласуются с данными мировых исследований о высокой распространенности ВПЧ 16 типа в популяции [Евстигнеева Н.П., 2007; Видяева И.Г. и др., 2008; Современные подходы…, 2009; Munoz N. et al., 2004; Bosh F.X. et al., 2008]. При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев наравне с ВПЧ 16 типа выявлялся ВПЧ 52 типа.

Характерной особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев было снижение частоты встречаемости ВПЧ 52 типа относительно как группы с транзиторным течением ПВИ, так и группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев. Аналогичные результаты получены Е.А. Золотоверхой и соавт. (2007), в работе которой не было обнаружено ВПЧ 52 типа при персистирующем течении ПВИ. Вероятно, инфицирование 52 типом ВПЧ ассоциировано с элиминацией, либо с краткосрочной персистенцией ВПЧ высокого риска.

У женщин с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев встречались все 12 определяемых типов ВПЧ высокого риска, тогда как при транзиторном течении ПВИ не выявлялся ВПЧ 35 типа, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев – ВПЧ 39 и 58 типов.

Характеризуя частоту встречаемости количества типов ВПЧ высокого риска в исследуемых группах необходимо отметить, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев достоверно чаще выявлялась микстинфекция ВПЧ высокого риска (инфицирование 2 и более генотипами вируса) по сравнению с транзиторным течением ПВИ (р=0,04 и р<0,001, соответственно). Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые в своих работах пришли к выводу, что инфицирование несколькими типами ВПЧ снижает скорость элиминации и обеспечивает менее благоприятный прогноз течения ПВИ [Евстигнеева Н.П., 2009; Современные подходы…, 2009].

Анализ частоты встречаемости типов ВПЧ высокого риска при моноинфекции (инфицирование 1 генотипом вируса) показал, что персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовалось высокой частотой встречаемости ВПЧ 51 типа по сравнению с транзиторным течением ПВИ (р=0,03). При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев отмечена наиболее высокая частота инфицированности моноинфекцией ВПЧ 16 типа относительно групп с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев (р<0,001 и р=0,004, соответственно).
Таблица 1

Распределение генотипов ВПЧ высокого риска у женщин с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции

Тип	Стат. показатели	Группа 1	Группа 2	Группа 3
		Транзиторное течение ПВИ, n=96	Персистирующее течение ПВИ, 6 месяцев, n=54	Персистирующее течение ПВИ, 12 месяцев, n=112
16	n	22	10	28
	%	23,4	18,5	25
18	n	4	6	6
	%	4,3	11,2	5,4
31	n	8	8	14
	%	8,5	14,8	12,5
33	n	8	4	6
	%	8,5	7,4	5,4
35	n	0	2	6
	%	0	3,7	5,4
39	n	8	0	12
	%	8,5	0	10,7
45	n	4	2	10
	%	2,1	3,7	8,9

Каталог: files -> misc
misc -> Вопросы сертификационного экзамена для врачей по специальности «лфк и спортивная медицина»
misc -> Уральская государственная медицинская академия дополнительного образования федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию
misc -> Соматоформные расстройства и основы психосоматики
misc -> Программа по психиатрии и наркологии для 4 курса стоматологического факультета
misc -> Минздрав россии
misc -> Ю. Ю. Шамукрова Тестовые задания для ига ординаторов по специальности Пульмонология
misc -> Научные платформы

Скачать 347.5 Kb.

Поделитесь с Вашими друзьями: