Девясил высокий ( Inula helenium L.) на Южном Урале: популяционная структура и вопросы охраны 03. 00. 16. экология 03. 00. 15 генетика

03.00.15 - генетика

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пермь - 2010

Работа выполнена на кафедре общей биологии и химии Зауральского филиала ФГОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»

Научный руководитель:	доктор биологических наук Редькина Нина Николаевна
Научный консультант:	доктор биологических наук, доцент Янбаев Юлай Аглямович
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, доцент Федоров Николай Иванович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Пименова Маргарита Егоровна
Ведущая организация:	Пермская государственная фармацевтическая академия

Защита состоится 15 апреля 2010 г. в 16-00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.189.02 при Пермском государственном университете по адресу: 614990, г. Пермь, ГСП, ул. Букирева, 15, зал заседаний Ученого совета.

Адрес сайта: https://www.psu.ru

E-mail: novoselova@psu.ru

Факс: (342) 237-16-11
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Пермского государственного университета.
Автореферат разослан 10 марта 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, доцент

Л.В. Новоселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Истощительная и все возрастающая эксплуатация биологических ресурсов планеты обусловила включение задачи сохранения биологического разнообразия в один ряд с такими глобальными проблемами человечества, как экологический кризис, регулирование роста народонаселения, обеспечение его энергоресурсами и др. (Розенберг, 1998). Сохранение генетической компоненты биологического разнообразия, реализуемого, в первую очередь, на популяционном уровне, имеет первостепенное значение для выживания организмов и адаптации к условиям постоянно меняющейся среды (Gregorius, 1989). Однако до сегодняшнего дня наблюдается дефицит знаний о генетическом разнообразии и структуре популяций многих видов растений, в том числе редких и исчезающих, особо чувствительных к антропогенной трансформации природных экосистем (Hamrick et al., 1992). Это обуславливает актуальность исследований состояния генофонда популяций редких и исчезающих видов и, на этой основе, необходимость разработки научно обоснованных и действенных мер сохранения их генетических ресурсов в естественных условиях и вне природных местообитаний.

Цель и задачи исследований. Цель данной работы - исследование популяционной структуры девясила высокого Inula helenium L. и разработка принципов его охраны на Южном Урале. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: 1) выявить изоферментные системы, информативные в качестве молекулярных маркеров; 2) исследовать факторы, формирующие структуру популяций, их разнообразие и дифференциацию по аллозимным локусам; 3) предложить меры по охране вида на Южном Урале в естественных условиях и сохранению его генетических ресурсов вне природных местообитаний.

Научная новизна работы. Выявлены полиморфные изоферментные маркеры локусов девясила высокого, информативных при характеристике генофондов популяций. Установлено, что популяции вида имеют сравнительно небольшой уровень подразделенности по частотам аллелей, за исключением малых популяций с невысокой плотностью особей. Это обстоятельство упрощает выбор объектов для охраны в природных условиях. Показано, что при выращивании I. helenium L. ex situ формируется генофонд, не характерный для природных популяций. Негативные последствия этого процесса можно преодолеть за счет использования популяционного подхода при интродукции девясила высокого.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для уточнения мер охраны девясила высокого в Республике Башкортостан, а также при разработке необходимых для этого нормативных документов. Материалы диссертационной работы применяются при проведении учебных занятий в Башкирском государственном аграрном университете.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявленные полиморфные изоферментные системы являются эффективными молекулярными маркерами для исследования популяционной структуры девясила высокого.

2. Популяции I. helenium L. на Южном Урале обладают сравнительно высокой общностью генофондов, что необходимо учитывать при охране вида в регионе.

3. Для разработки и реализации мер охраны, а также при сохранении генетических ресурсов вида вне природных местообитаний и при искусственном выращивании рекомендуется использовать популяционный подход.

Литературный поиск (в том числе с помощью электронной системы «PubMed» на https://www.pubmed.gov, являющейся базой медико-биологических публикаций в рецензируемых журналах мира) позволил сделать вывод о том, что для видов девясила популяционная структура ранее не исследовалась. Получение таких сведений для объекта исследований - девясила высокого - необходимо для оптимизации охраны и рационального использования данного ценного лекарственного растения на Южном Урале.

На основе анализа научной литературы разработаны цель, задачи и программа исследований.

2. Район, объект, материал и методы исследований
Приведена характеристика природно-климатических условий Республики Башкортостан и ботанико-географического районирования его территории. По литературным данным приведено описание объекта исследований. Девясил высокий - ценное лекарственное растение, имеющее отхаркивающее, мочегонное, противовоспалительное, антимикробное, бактерицидное, противогрибковое, вяжущее, кровоостанавливающее, спазмолитическое, противоаллергическое, потогонное и гипотензивное действия (Государственная фармакопея…, 1989; Лекарственные растения, 1991; Кучеров и др., 1990).

Растение насекомоопыляемое, вид диплоидный с 2n=20 (Флора Сибири, 1987). Он имеет дизъюнктивный евро-азиатский ареал (Атлас ареалов..., 1976), захватывающий лесную, лесостепную и степную зоны европейской части России и Западной Сибири. Распространение I. helenium L. в Башкортостане приурочено к поймам небольших озер, к берегам рек, ручьев, к местам выхода грунтовых вод, к влажным лугам и лесным опушкам (Красная книга Республики Башкортостан, 2001). Обитает большей частью в Предуральской части региона, где охватывает лесостепную и степную зоны, а также на западном макросклоне южно-уральских гор. Изолированная часть ареала отмечена в Башкирском Зауралье (Кучеров, Галеева, 1991). Девясил высокий в Республике Башкортостан находится под охраной государства - Постановлением Кабинета министров субъекта Федерации № 231 от 11 сентября 2001 г. «О Красной книге Республики Башкортостан» занесен в «Красную книгу» (2001) субъекта Федерации по 3-ей категории редкости. К этой группе относят таксоны, представленные небольшими популяциями, которые в настоящее время не находятся под угрозой исчезновения и не являются уязвимыми, но рискуют стать таковыми.

Пробные площади закладывались по общепринятым методам в местообитаниях, наименее затронутых антропогенным влиянием, представляющих типичные места произрастания в регионе, а также отражающих разные экологические условия их обитания. Для репрезентативного выбора мест отбора растительных образцов с использованием гербарных материалов Института биологии Уфимского научного центра РАН были построены карты местонахождений в пределах Южного Урала. Исследованы 22 выборки (рис. 1) на территории 13 административных районов региона (Баймакский, Благовещенский, Бурзянский, Гафурийский, Зианчуринский, Зилаирский, Ишимбайский, Кармаскалинский, Кугарчинский, Кушнареновский, Куюргазинский, Мелеузовский и Хайбуллинский районы), включающих местообитания Башкирского Предуралья (Blag, Kush, Kar, Kum-1, Kum-2), горно-лесной зоны РБ, в т.ч. западного макросклона южно-уральских гор (Arch, Gaf, Ish-1, Ish-2, Mel-1, Mel-2, Bur, Kug) и Башкирского Зауралья (Baj-1, Baj-2, Baj-3, Baj-4, Zil, Cha-1, Cha-2, Zia-1, Zia-2). На рис. 1 точками изображены ранее описанные местообитания девясила высокого (сведения получены нами в гербарной Института биологии Уфимского научного центра РАН, а также по публикациям его сотрудников).

В качестве молекулярных маркеров популяционного разнообразия выбраны изоферменты, позволяющие решать широкий круг популяционных задач (Левонтин, 1978; Политов, 2007). Для разделения изоферментов использован полиакриламидный диск-электрофорез ферментов в щелочном разделяющем геле с рН разделяющего геля 8.9 (Ornstein, 1964; Davis, 1964) в вертикальных блоках. Гистохимическое выявление изоферментов после их разделения проводили по стандартным методам (Корочкин и др., 1977), адаптированным к объекту изучения. Исследуемая ткань – этиолированные побеги, образованные в темноте при комнатной температуре из корневищ отдельных растений, помещенных в периодически увлажняемую смесь песка и чернозема в соотношении 1:1.

В качестве основных молекулярных маркеров первоначально рассматривались изоферменты аспартатаминотрансферазы (ААТ, кодовый номер фермента 2.6.1.1), алкоголдегидрогеназы (АDH, 1.1.1.1), лейцинаминопептидазы (LAP, 3.4.11.1), неспецифических эстераз (EST, 3.1.1…), глутаматдегидрогеназы (GDH, 1.4.1.2), формиатдегидрогеназы (FDH, 1.2.1.2), флуоресцентной эстеразы (FE, 3.1.1.1…), шикиматдегидрогеназы (SKDH, 1.1.1.25), аланинаминопептидазы (AAP, 3.4.11.2), диафоразы (DIA, 1.6.4.3), кислой фосфатазы (APH, 3.1.3.2), малатдегидрогеназы (MDH, 1.1.1.37).

Скрининг изменчивости ферментных систем выявил мономорфность некоторых из них, нестабильное проявление в гелях отдельных зон. Поэтому для популяционного анализа применены изоферменты изменчивых ААТ, АDH, EST и LAP.

Интерпретация полиморфизма фенотипов изоферментов и объяснение механизмов их наследования предложены на основе анализа пространственной разобщенности зон активности ферментов в гелях и образования гибридных изоферментов у гетерозигот, статистического тестирования различий наблюдаемых и теоретически ожидаемых частот генотипов, изучения литературных данных о генетическом контроле изоферментов.

Объемы изученных выборок составили, кроме случаев выполнения отдельных задач, по 32 особи или 64 аллеля (Pons, Chaouche, 1995).

пробных площадей

Для изучения пространственной структуры популяций с применением буссоля и геодезической мерной ленты определены координаты растений. Для анализа структурированности генотипов в пространстве в пределах местообитания использована программа автокорреляционного анализа Spatial Genetic Software или SGS (Degen, Scholz, 1998). В качестве меры сходства генотипов выбран индекс Морана (Sokal, Wartenberg, 1983).

Сравнение популяций по морфологическим признакам растений (высота растения, число побегов, число прикорневых, нижних и срединных листьев, число соцветий на особь, длина и ширина прикорневых и срединных листьев и др.) проведены с применением программы “STATISTICA 6.0”, а также MS EXCEL. С их помощью вычислялись средние значения параметров и их арифметические ошибки, пределы изменений признаков, коэффициенты вариации и корреляции, осуществлялись построение и определение форм распределений признаков, сравнивались средние значения выборок и их групп, проводился кластерный анализ и т.д.
3. Результаты исследований

3.1. Генетическое разнообразие Inula helenium L.

Электрофоретический анализ выявил, что у девясила высокого мономорфными являются исследованные зоны GDH-1, FDH-1, AAT-2, ADH-1, SKDH-1, Lap-2, FE-3, MDH-1. Сделано предположение, что каждая из этих пространственно разобщенных в гелях областей активности кодируются своими мономорфными аллозимными локусами. Для определения уровня подразделенности изученнных популяций использованы полиморфные локусы (табл. 1) аспартатаминотрансферазы (димерный фермент у объекта исследований), лейцинаминопепдидазы (мономер), алкогольдегидрогеназы (димер) и неспецифических эстераз (мономер). Один из изменчивых локусов Est-2 с тремя аллелями и ожидаемой гетерозиготностью =0.151 нами не использован для массовых популяционных анализов из-за нестабильного проявления его изоферментов у всех исследованных образцов. С учетом изменчивых и 7 мономорфных локусов Inula helenium L. на уровне вида имеет следующие показатели генетического разнообразия: =41.7 %, =1.67, =0.117. Несмотря на то, что для их определения использованы лишь 12 локусов, полученные средние значения оказались очень близки к данным для всех травянистых растений с длительным циклом жизни (Hamrick, Godt, 1992) - =41.7 %, =1.67, =0.117. В то же время они намного выше, чем у редких и исчезающих видов растений в целом, как показывает обзор литературы. Кроме того, изменчивость большинства полиморфных локусов редких и исчезающих видов имеет такую особенность, что доминирует по частоте, как правило, один из аллелей, а остальные относятся к категории относительно редких.

Таблица 1

Частоты аллелей в популяциях Inula helenium L.

Таблица 2

Разнообразие полиморфных аллозимных локусов в популяциях

Inula helenium L.

Выборки
Zia-1 Zia-2 Kug Kum-1 Kum-2 Mel-1 Mel-2 Ish-1 Ish-2 Gaf Blag Kush Kar Arch Сha-1 Сha-2 Zil Baj-1 Baj-2 Baj-3 Bur	50 75 75 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 75 75 50 75 75 50 50	1.8±0.5 1.8±0.3 2.0±0.4 2.3±0.3 2.5±0.5 2.5±0.5 2.3±0.3 2.5±0.5 2.3±0.3 2.0±0.0 2.0±0.0 2.0±0.0 2.0±0.0 2.0±0.0 1.8±0.3 1.8±0.3 1.5±0.3 1.8±0.3 1.8±0.3 1.5±0.3 1.5±0.3	0.213±0.133 0.279±0.106 0.278±0.138 0.341±0.132 0.344±0.095 0.367±0.099 0.305±0.087 0.367±0.107 0.266±0.073 0.500±0.102 0.308±0.087 0.452±0.111 0.553±0.018 0.288±0.079 0.356±0.184 0.197±0.112 0.087±0.051 0.346±0.142 0.183±0.114 0.125±0.076 0.231±0.137	0.169±0.102 0.245±0.093 0.295±0.121 0.444±0.032 0.343±0.094 0.361±0.092 0.375±0.081 0.358±0.100 0.274±0.075 0.419±0.057 0.296±0.068 0.406±0.066 0.468±0.021 0.290±0.084 0.271±0.136 0.377±0.126 0.189±0.118 0.330±0.114 0.240±0.128 0.220±0.127 0.227±0.133

Распределение общей генетической изменчивости на внутри- и межпопуляционные компоненты показало, что первая из них составила = 0.155 и изменялась между локусами в пределах 0.098 (Est-1), 0.109 (0.109), 0.175 (Lap-1) и 0.263 (Aat-1). Этот уровень, по литературным сведениям, минимум в 2-3 раза меньше, чем межпопуляционная подразделенность большинства редких и исчезающих видов растений. Об этом же свидетельствует генетическое расстояние Нея - =0.082±0.004.

Каких-либо выраженных географических закономерностей (рис. 2) в пространственном размещении выборок не обнаружено; это же заключение сделано при анализе кластеризации популяций на дендрограмме (рис. 3). Определенная пространственная закономерность в дифференциации популяций на уровне тенденции начинает выявляться лишь при объединении выборок по принадлежности к отдельным южно-уральским крупным геоморфологическим образованиям – Башкирскому Зауралью, Башкирскому Предуралью, горно-лесной части Южного Урала. Для соответствующих групп выборок были подсчитаны внутригрупповые величины расстояний Нея и параметра межпопуляционной подразделенности . Они меньше, чем при анализе одновременно всех выборок. У первой группы =0.089, в среднем =0.0480.008, с изменениями в пределах =0.013-0.092. В пределах обширной зоны (рис. 1) равнинного Предуралья дифференциация популяций выражена на таком же уровне – в =0.080, =0.0790.017, изменения от =0.050 до =0.109. Лишь в выборках из экологически более контрастных условий горно-лесной зоны Южного Урала и восточного макросклона южно-уральских гор межпопуляционная подразделенность выражена (=0.157, в среднем =0.0900.008, значения расстояния Нея доходят до =0.325). Уровень дифференциации исследованных популяций горно-лесной зоны существенно снижается (до =0.086, =0.0460.008, изменения в пределах =0.005-0.120) при исключении из анализов растений трех местообитаний (рис. 4.), вносящих основной вклад в различия популяций и образующих >0.250.

Одна из этих выборок (Mel-2) представляет небольшие, удаленные друг от друга группы особей, со средней плотностью 0.04 особи на один квадратный метр. Между тем, в большинстве местообитаний обычная плотность размещения составляет 0.45-2.25 растений на 1 квадратный метр. В двух других пробных площадях густота растений в пределах отдельных групп высока, но общая численность популяций – не более нескольких десятков особей. При изоляции и малой эффективной численности популяции высока вероятность дрейфа генов и появления «эффекта основателя», которые могут существенно изменить аллельные частоты. Для доказательства этого утверждения в одном из таких местообитаний проведен автокорреляционный анализ. Неслучайное распределение аллелей в двумерном пространстве в пределах местообитания выявлено по двум из трех локусов, взятых в анализ (не исследован Aat-1 из-за его слабой полиморфности в выборке). Значения индекса Морана у них закономерно снижаются с увеличением дистанции между растениями и выходят за пределы 95%-ного доверительного интервала (рис. 4.). По локусу Adh-2 эта динамика в разных классах дистанций не носила статистически достоверный характер.

Попытка группирования выборок по приуроченности к разным экологическим условиям с целью выявления их различий по уровню разнообразия аллозимных локусов не дала положительных результатов. Диапазон разнообразия в «экологических» группах был близким, как и средние для групп параметры.

Рис. 2. Зависимость расстояния Нея от географического расстояния

между выборками Inula helenium L.

Рис. 3. Кластеризация выборок Inula helenium L. по расстоянию Нея

Однако такая рекомендация не исключает охрану генофонда в природных условиях путем отбора наиболее типичных и ненарушенных популяций, например, в формах малых ООПТ и заказников. Генетическое сходство многих южно-уральских популяций I. helenium, а также слабое воздействие экологических условий обитания на их генофонд позволяют при выборе объектов охраны in situ ориентироваться в большей степени не на популяционно-генетические, а на экономические, организационные и другие стороны этой деятельности. Однако при этом следует избегать отбора объектов с нехарактерной генотипической структурой.

Важность популяционного подхода при введении девясила высокого в культуру показана при сравнении генетической структуры выборки растений, выращиваемых в коллективных садах г. Сибай. Сравнение ее генотипической структуры с природными популяциями показало, что локус Adh-1, изменчивый у растений из природных местообитаний (частота основного аллеля изменяется от 0.154 до 0.846), у культивируемой выборки мономорфен. Электрофоретически инвариантным является и локус Aat-1, полиморфный у многих природных популяций. По этой причине генетическое разнообразие искусственной популяции низкое - =1.8±0.5, =0.50, =0.110±0.078, =0.106±0.093. В парах с природными популяциями среднее генетическое расстояние было равно =0.253, с максимальным значением =0.573. Эта часть полученных результатов показывает, что отсутствие популяционного подхода при интродукции девясила высокого приводит к формированию культур с нехарактерным генофондом.

ВЫВОДЫ
1. Аллозимы полиморфных локусов Est-1, Lap-1, Aat-1 и Adh-2 являются информативными молекулярными маркерами при характеристике структуры популяций Inula helenium L. на Южном Урале.

2. Девясил высокий на Южном Урале обладает относительно высоким уровнем изменчивости аллозимных локусов, что нехарактерно в целом для категории редких и исчезающих видов растений.

3. Для южно-уральских популяций девясила высокого выявлена относительно невысокая генетическая подразделенность, связанная с существованием интенсивного генетического потока между ними; влияние экологических условий на уровень дифференциации и формирование популяционных структур не выражено.

4. Генофонд Inula helenium L. на Южном Урале находится в благополучном состоянии и не требует принятия срочных мер по охране на видовом уровне. С учетом результатов исследования популяционных структур, имеющихся сведений о запасах девясила высокого в регионе, а также ряда его биоэкологических параметров, рекомендовано не включать вид в новое издание Красной книги Республики Башкортостан.

5. При сохранении и использовании генетических ресурсов девясила высокого на Южном Урале вне природных условий необходимо использование популяционного подхода и проведение отбора популяций с наиболее типичным генофондом.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. 
   Редькина Н.Н. Популяционная структура девясила высокого на Южном Урале / Н.Н. Редькина, Р.Ю. Муллагулов, С.С. Киньябулатов, Ю.А. Янбаев // Аграрная наука. – 2008. - №8 – С. 18-20.
   
2. 
   Редькина Н.Н. О необходимости популяционного подхода при введении дикорастущих растений в культуру / Н.Н. Редькина, С.С. Киньябулатов, Ю.А. Янбаев, Р.Ю. Муллагулов // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2009. - № 6 (100). – С. 308-309.
   

3. 
   Киньябулатов С.С. Проблемы сохранения и рационального использования растений рода INULA L. / С.С. Киньябулатов, Р.Ю. Муллагулов // Научные доклады региональной конференции «Неделя науки - 2006» Ч. 1 / Изд-е Сибайского института БашГУ. – Сибай, 2007. – С. 7-10.
   
4. 
   Редькина Н.Н. Полиморфные изоферментные системы девясила высокого / Н.Н. Редькина, Р.Ю. Муллагулов, С.С. Киньябулатов // Научные доклады региональной конференции «Неделя науки - 2006» Ч. 1 / Изд-е Сибайского института БашГУ. – Сибай, 2007. – С. 88-91.
   
5. 
   Киньябулатов С.С. Генетическая структура популяций Inula helenium L. в южных районах Республики Башкортостан / С.С. Киньябулатов // Научные доклады региональной конференции «Неделя науки - 2007». Ч. 1 / Изд-е Сибайского института (филиала) БашГУ. – Уфа: РИЦ БашГУ, 2007. – С. 103-109.
   
6. 
   Редькина Н.Н. Обоснование принципов сохранения популяционного разнообразия девясила высокого на основе изоферментного анализа / Н.Н. Редькина, Р.Ю. Муллагулов, Ю.А. Янбаев, С.С. Киньябулатов // Башкирский экологический вестник. – 2008. - № 1. – С. 36-38.
   
7. 
   Киньябулатов С.С. Inula helenium L. – перспективное лекарственное растение в условиях Башкирского Зауралья: распространение, биологические запасы и проблема сохранения / С.С. Киньябулатов // Уральский регион Республики Башкортостан: человек, природа, общество: материалы региональной научно-практической конференции (8 октября 2009 г.). – Уфа: Зауральский филиал ФГОУ ВПО «Башкирский ГАУ», 2009. – С. 243-247.
   

Подписано в печать 05.03.2010 г.

Формат 60х84/16. Усл. печ. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ № 23

450074, РБ, г. Уфа, ул. З. Валиди, 32.

Отпечатано на множительном участке РИЦ

Сибайского института (филиала) БашГУ