Биологически активные вещества каллусной ткани наперстянки пурпурной

Отечественной и зарубежной химической промышленностью синтезирован ряд химических аналогов данных веществ, но, как правило, эти вещества содержат сопутствующие примеси, проявляющие негативное действие на организм человека и животных. Кроме того, многие специфические биологически активные вещества, такие как сердечные гликозиды, являются продуктами отдаленного синтеза у растений и их искусственное получение затруднено в связи с многостадийностью процесса, низким выходом основного продукта и его дороговизной.

В настоящее время перед биотехнологией как наукой и отраслью промышленности стоит актуальная задача поиска альтернативных источников биологически активных веществ растительного происхождения, применяемых в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине и разработки методов их получения.

Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea L.) служит природным источником стероидных соединений карденолидов, которые широко применяются в современной фармакотерапии и не имеют синтетических аналогов.

Листья наперстянки пурпурной содержат различные глюкозиды сердечной группы: пурпуреаглюкозид А, пурпуреаглюкозид В, дигитоксин, гитоксин, гиталоксин, гиторин, дигиталеин, дигиталин, дигипрозид и ряд других глюкозидов; ряд стероидных сапонинов: дигитонин, гитонин, тигонин; флавоноиды лютеолин и дигитолютеин, кофейную кислоту, холин и другие вещества [3].

Наперстянку назначают для урегулирования деятельности сердца при нарушении кровообращения, при клапанных пороках сердца, мерцательной аритмии, застойных явлениях, гипертонии и в качестве мочегонного при отеках [5].

Выход сердечных гликозидов из растения является непостоянной величиной и зависит от климатических условий, срока вегетации растения, от времени суток, в которое производится сбор. Наперстянка пурпурная является двулетним растением, поэтому требует постоянного рекультивирования. Календарные сроки уборки ограничены. Исходя из этих фактов, экономически интересным и перспективным представляется создание технологии, при которой осуществлялось бы круглодичное, независимое от внешних факторов культивирование клеток растения, и получение гликозидов на его основе.

Одним из решений этой проблемы является культивирование тканей и клеток высших растений in vitro с целью их промышленного использования для получения соединений специализированного обмена. [2].

Культуры растительных клеток могут синтезировать самые разнообразные по химической природе вещества. Среди них эфирные масла, фенольные соединения, алкалоиды, стероиды, терпеноиды и др. Содержание практически важных вторичных метаболитов в высших растениях определяется активностью их синтеза, эффективностью транспорта и депонирования в органах запаса растения. Все эти признаки определяются генетически, находятся под контролем развития организма и максимально реализуются в оптимальных внешних условиях.

Неотселектированные, дедифференцированные клетки накапливают, как правило, незначительное, по сравнению с интактным растением, количество веществ специализированного обмена. Только благодаря правильно разработанной стратегии получения высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем [4].

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток. Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами [6].

Целью данной работы было введение в культуру наперстянки пурпурной и исследование содержания биологически активных веществ в полученной каллусной ткани.

Первоначальным этапом для получения культуры клеток является подбор оптимальных режимов стерилизации для получения стерильных пробирочных растений [1].

Необходимость введения в культуру in vitro стерильных маточных растений наперстянки обусловлена трудностями, связанными с инициацией образования и развития стерильной недифференцированной ткани (каллуса) и разработки условий её культивирования.

Семена наперстянки пурпурной стерилизовали при различных условиях и высаживали на агаризованную питательную среду с различным минеральным составом.

Результаты стерилизации семян оценивали по количеству стерильных эксплантов после стерилизации, в % от исходного количества стерилизуемых семян – коэффициенту стерилизации, и коэффициенту всхожести – количеству проросших семян к общему количеству, в %.

В ходе эксперимента были использованы разные условия стерилизации и выбраны оптимальные условия, не препятствующие каллусогенезу и органогенезу.

Если стерильность семян составляет менее 100 %, в дальнейшем можно использовать только культивирование каждого семени отдельно, так как в противном случае может произойти массовое заражение других семян. Применение сильных стерилизующих агентов, таких как перманганат калия, гипохлорит натрия, сулема, диацид, обеспечивало 100 % соблюдение асептических условий, однако приводило к очень низкому (1-5 %) коэффициенту всхожести. Поэтому нами была применена поэтапная схема стерилизации.

В работе использовали следующие сочетания стерилизующих агентов: этиловый спирт 70 % - 0,1 % раствор диацида; этиловый спирт 70 % - слабый раствор перманганата калия.

В результате наиболее эффективной схемой стерилизации оказалась следующая: семена обрабатывались сначала 70 % этанолом в течении 1 минуты, а затем 0,1 % раствором диацида в течении 10 минут. Далее семена пятикратно отмывались дистиллированной водой.

При данной схеме стерильность семян составляла 100 %, в то время как коэффициент всхожести достигал 80,3 %.

Стерильные семена переносили на агаризованные питательные среды с различным минеральным составом без добавления гормонов и с 3 % содержанием сахарозы.

Как показал анализ литературных данных, для введения растений в культуру in vitro чаще всего используются питательные среды с минеральной основой по Мурасиге и Скугу, Блейдза, Гамборга, Уайта, Шенка-Хильдебранта, Серлиса [8]. В данной работе были использованы среды с минеральной основой по Мурасиге и Скугу, Блейдза, Гамборга, Уайта.

В процессе культивирования семян оценивали коэффициенты всхожести, ризогенеза и каллусогенеза, а также общее состояние растений.

Полученные результаты приведены в таблице 1.

Название среды	Коэффициент всхожести, %	Коэф. каллусообра зования, %	Коэф. ризогенеза, %	Качественная характеристика растений
Мурасиге и Скуга	80,30	2,00	73,50	Ярко-зеленые, с крупными листьями
Гамборга	4,42	1,12	59,54	Бледно-зеленые с крупными листьями
Блейдза	23,44	1,05	12,45	Бледно-зеленые, этиолированные
Уайта	15,03	1,06	10,00	Бледно-зеленые с небольшими листьями

Таблица 1. Влияние минерального состава питательных сред на всхожесть и качественные характеристики растений наперстянки пурпурной
В результате было обнаружено, что минеральный состав среды, при одних и тех же фото- и температурных режимах и одинаковом органическом фоне, влияет на процессы приживаемости, роста и регенерации введенных in vitro эксплантов.

На всех средах наблюдался ризогенез. Самой высокой всхожестью и коэффициентом ризогенеза обладали проростки на среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу.

В результате эксперимента было также установлено, что процесс образования каллусной ткани протекает также на средах, без добавления гормонов, хотя и с низким коэффициентом 1-2 %.

Так как накопление сердечных гликозидов у наперстянки пурпурной происходит в листьях [9], следующим этапом исследований являлось получение каллусной ткани из листьев асептических проростков.

Для каллусогенеза были использованы среды с минеральной основой по Мурасиге и Скугу с различным добавлением гормонов.

Листочки пробирочных растений наперстянки, с надрезами вдоль центральной жилки, помещали на агаризованные среды и пассировали поверхностным способом с периодом субкультивирования 30-32 сут.

Результаты приведены в таблице 2.

Концентрация фитогормона, мг/л	Частота каллусогенеза, %	Качественные характеристики каллусной ткани
1	2	3
Без гормонов	2	Каллус бледный, плотный
2,4-Д, 0,1	80	Каллус бледный рыхлый, оводненный
2,4-Д, 0,3	40
2,4-Д, 0,5	30
КИН, 0,1	35	Каллус плотный, ярко зеленый
КИН, 0,3	20
КИН, 0,5	10
1	2	3
α-НУК, 1- 6-БАП 0,1	40	Каллус плотный, бледный
α-НУК, 0,5- 6-БАП 0,1	30
α-НУК, 0,1-6-БАП 0,1	15

Таблица 2. Влияние фитогормонов на каллусогенез наперстянки пурпурной.
По результатам исследований можно сделать выводы, что понижение концентрации 2,4-Д и кинетина в среде усиливало каллусогенез. Обратная зависимость наблюдалась при понижении концентрации α-НУК – чем ниже концентрация, тем ниже была частота каллусогенеза.

Большое значение для синтеза вторичных метаболитов имеет цвет и структура каллусной ткани. Научно доказано, что синтез сердечных гликозидов непосредственно связан с наличием в клетках хлоропластов [7], поэтому наибольший интерес представляла каллусная ткань, полученная на средах с кинетином, так как она имела ярко-зеленый цвет.

Данные по химическому составу каллусной ткани и растения наперстянки пурпурной приведены в таблице 3:

Как видно из таблицы 3, содержание витаминов в каллусной ткани ниже чем в растении. Содержание хлорофилла также понижено примерно в два раза. Однако наблюдается увеличение содержания флавоноидов (0,184 % относительно 0,051 % у растения) и сапонинов (0,750 % относительно 0,240 %).

Среди вторичных метаболитов наибольший интерес представляют гликозиды. Содержание гликозидов в каллусной ткани незначительно ниже чем в растении и составляет 0,280 %.

Проведенные исследования содержания биологически активных веществ показали, что каллусная ткань Digitalis purpurea L. является перспективным объектом для биотехнологии и может быть рекомендована в качестве потенциального сырья для получения биологически активных веществ.

1. 
   Артамонова, Г. М. Лабораторно-практические занятия по сельскохозяйственной биотехнологии: Методические указания/ Г.М. Артамонова, С.И. Герасимова, С.В. Дегтярев, Е.З. Кочиева, Д.В. Калашников, И.К. Блиновский, Л.И. Хрусталева. Под ред. акад. ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи. - М.: Изд-во МСХА, 1991. – С. 115.
   
2. 
   Бутенко Р.Г. Культура тканей и клеток растений/ Р. Г. Бутенко. - М.: Знание, 1971. – С. 2.
   
3. 
   Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений/ В. П. Георгиевский, Н. Ф. Комиссаренко, С. Е. Дмитрук.- Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1990. – С. 246-247.
   
4. 
   Запрометов, М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений/ М. Н. Запрометов. - М.: Наука, 1981. - С. 37-50.
   
5. 
   Коваленко, В. Н. О биологической активности некоторых видов наперстянки/ В. Н. Коваленко// Фармакология и токсикология.- 1954. - №3. – С. 18-22.
   
6. 
   Муромцев, Г.С. Основы химической регуляции роста и продуктивности растений/ Г. С. Муромцев, Д. И.Чекаников, О. Н. Кулаева, К. З. Гамбург. - М.: Агропромиздат, 1987. - С. 316-322.
   
7. 
   Hagimory, M. Effect of light and plant crowth substances on digitoxin formation by undifferention cells and shoot-forming cultures of Digitalis Purpurea L./ M. Hagimory, T. Matsumoto, Y. Obi//Plant Phisiology. – 1982. - V. 69. – P. 653-656.
   
8. 
   Helmold, H/ Sterols in cells culture of Digitalis/ H. Helmold// Planta Med. – 1978. - V. 33. - P. 185-187.
   
9. 
   Kreis, W. Cardenolide biosinthesis in foxglove/ W. Kreis, A. Hensel, U. Stuhlemmer// Planta Med. – 1998. - V. 64. - P. 491-499.