Морфофункциональные изменения в печени при токсическом поражении и при его коррекции 06. 02. 01 диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена на кафедре анатомии, физиологии и микробиологии ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия».

Доктор ветеринарных наук, доцент Томитова Е.А.

1. 
   ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
   

Функции печени в организме очень разнообразны: в ней вырабатывается желчь, имеющая большое значение для пищеварения, печень задерживает и ассимилирует продукты переваривания, в ней протекает синтез и расщепление пуриновых тел, аминокислот, белков, жиров, накапливаются витамины и микроэлементы. Этот орган способен фиксировать скрытые повреждения, которые проявляются в ближайшие или отдаленные сроки. Огромное значение играют барьерные функции печени – задерживаются или изменяются и выводятся вместе с желчью многие ядовитые вещества эндогенного и экзогенного происхождения. При заболеваниях печени падает её окислительная способность и уменьшается обезвреживающая функции (Кудрявцев А.П., 1984; Зайцев С.Ю., 2004). Значительная роль печени в синтезе и сохранении ферментов. Такв этом органемаксимальная активность фермента глутатионпероксидазы, которая напрямую зависит от обеспеченности организма селеном.

В Иркутской области недостаток селена, так же как и недостаток йода в почве, является эндемической патологией (КудрявцевА.П., 1984; Ильина О.П., 2000). Для предотвращения патологий, связанных с недостатком селена (Se), в животноводстве используют препараты, в которых Se содержится в виде синтетических комплексов селенита натрия или селен-метионина, что часто является причиной селенозов животных (Решетник Л.А., 1999).

Селен (Se) привлекает внимание животноводов как биотический элемент, выполняющий в исчезающее малых количествах важные биохимические функции, а также как высокотоксичный элемент, неорганические соединения которого более ядовиты, чем соединения молибдена, мышьяка и ванадия (Георгиевский В.И., 1979; Синдирева А.В.,2012). Биологическая активность селена обусловлена его участием в регуляции образования антиоксидантов. Существует тесная корреляция между уровнем в организме селена и активностью селен-содержащего фермента глутатионпероксидазы, который является фактором антиоксидантной защиты (Зайцев С.Ю., Конопатов Ю.В., 2004; Георгиевский В.И.,1979; Решетник Л.А., 1999).

В последние годы развивается новый подход к получению терапевтических препаратов, основанный на иммобилизации лекарственных средств на полимерных носителях. Это позволяет улучшить их фармакологические свойства и снизить токсичность.

Одной из важных и актуальных тенденций в развитии фармакологической терапии является создание нанокомпозитных систем направленной доставки веществ в органы и ткани, повышающих эффективность действия лекарственного вещества на организм человека или животных (Зубов В.П. с соавт., 1999; NiemeyerC. M., MirkinC.A., 2004; KubikTeyal., 2005; TorchilinV., 2006; BharadBushan, 2007; EhudG., 2007; ClaudioN., 2008; Ткачук В. А. с соавт., 2008; Цыб А. Ф., 2008; Швец В. И., 2008).

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи

1. 
   Оценка антиоксидантной активности нанокомпозитногопрепарата селена invitro.
   
2. 
   Установление степени токсичности нанокомпозитного препарата селена.
   
3. 
   Определение концентрации факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), малоновогодиальдегида (МДА) на модели токсического гепатита и на фоне введения нанокомпозитного препарата селена.
   
4. 
   Определение факторов антиоксидантной защиты (АОЗ): супероксиддисмутаза (СОД), антиоксидантная активность (АОА), глутатионпероксидаза(GSH), витаминов А и Е.
   
5. 
   Установлениесаногенетического эффектананокомпозитного препарата селена на морфологическую структуру печени.
   

Установлено, что нанокомпозитный препарат селена (наноразмерныйSe в решетке арабиногалактана) в выбранной нами дозе 2мг/100гр массы животного не оказывает повреждающего действия на организм животных, а оказывает выраженное протекторное действие на печень. Проявляет антиоксидантную активность, о чем свидетельствует снижение уровня маркеров ПОЛ и повышение активности глутатиона. Доказано, что применение нанокомпозитного препарата селена в экспериментальной профилактике отравления тетрахлорметаном способствует уменьшению метаболических и морфологических нарушений.

Таким образом установлено, что Se, взятый в наноразмерном состоянии, не проявляет повреждающего действия на организм животных. Нанокомпозитный препарат селена, благодаря сродству арабиногалактановой матрицы к асиалогликопротеиновым рецепторам (с мембранотропными свойствами) гепатоцитов, макрофагов, ретикулоцитов позволяет изучаемому данному терапевтическому средству внедрять Se в эти клетки путем рецепторно-обусловленного эндоцитоза. На основании анализа литературных данных и собственных исследований разработана концептуальная схема протекторного действия нанокомпозитного препарата селена при интоксикации тетрахлорметаном, важнейшим элементом которой является ингибирование активности ПОЛ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные являются доклиническим обоснованием применения нанокомпозитного препарата Se для профилактики и лечения заболеваний животных, вызванным недостатком этого микроэлемента, особенно в недостаточных по селену зонах. А так же для защиты печени от повреждающего действия эндо- и экзотоксикантов.

Предложенная концептуальная схема является доклиническим обоснованием для дальнейшего изучения действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных.

Препарат может применяться в экспериментальной и ветеринарной практике для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний.

Основные результаты исследования представлены на международной Байкальской научно – практической конференции по проблемам ветеринарной медицины «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» Иркутск, 15-16 марта 2011г.; на региональной научно – практической конференции «Актуальные проблемы АПК» Иркутск, 20-22 апреля 2011г.; в I Международной научно-практической конференции «Перспективы развития научных исследований в 21 веке» г.Москва 2013 г.; на международной научно-практической конференции молодых ученых «научные исследования и разработки к внедрению в АПК» 17-18 апреля 2013 г; международной научно-практической конференции, посвященной 60 летию аспирантуры ИрГСХА 3-5 декабря 2013 г.; в семинаре «Научно-практические аспекты применения лекарственных растений в производстве пищевых продуктов 19-20 декабря 2013 г., Казахстан, г. Семей.

Материалы по экспериментальному исследованию нанокомпозитного препарата селена используются в учебном процессе и научной работе ФГБОУ «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» при чтении дисциплин «Ветеринарная патофизиология» и «Ветеринарная экология» на кафедре анатомии, физиологии и микробиологии (протокол №2 от 23.09.2013 г);используются в учебном процессе и научной работе на кафедре патанатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» (протокол №19 от 11.12.2013); используются в учебном процессе по курсу «Внутренние болезни животных», «Токсикология», «Фармакология» ФГБОУ ВПО Алтайский государственный аграрный университет (протокол №11 от 17.12.2013); используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры патологии, морфологии и физиологии, факультета ветеринарной медицины и зоотехнии ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» (протокол №4 от 16.12.2013); приняты к внедрению в производство или к использованию в разработках на кафедрах института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина (от 18.12.2013); приняты к использованию в учебном процессе кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии, а также используются в научно-исследовательской работе Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины КрасГАУ (протокол №6 от 27.11.2013); используются в учебном процессе кафедры «Внутренние незаразные болезни и акушерство» ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (протокол №4 от 15.12.2013); приняты к внедрению в учебный процесс и научную работу кафедры морфологии и физиологии животных Сельскохозяйственного института ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова» (протокол №6 от 27 декабря 2013г).Получена приоритетная заявка на изобретение «Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения»: заявление от 30.12.2013; регистрационный № 2013159311.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации результатов диссертации на соискание степени кандидата наук, и получена 1 приоритетная заявка на изобретение РФ.

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, собственные исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений и рекомендаций, и списка литературы и приложений; иллюстрирована 8 таблицами и 23 рисунками. Указатель литературы включает 179 источников, из них 118 работы отечественных и 61 – зарубежных авторов.

1. 
   Новый нанокомпозитный препарат селена в экспериментах invitro обладает антиоксидантным действием.
   
2. 
   В исследованиях invivo изучаемый препарат достоверно снижает негативные эффекты перекисного окисления липидов, усиливает систему антиоксидантной защиты.
   
3. 
   В условиях эксперимента при токсическом повреждении, обеспечивает более раннюю регенерацию клеток печени и меньшее повреждение в данном органе.
   

На первом этапе работы определяли антиоксидантную активность invitro в ИИХ СО РАН. Использовали спектрофотометрический метод в котором радикал-катион 2,2'-азинобис(3-этилбентиозолин-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS^+•), имеющий характерное поглощение в области 600-850 нм, генерировали персульфатом калия и измеряли процент ингибирования поглощения добавляемыми антиоксидантами (ReR., PellegriniN., ProteggenteA., PannalaA., YangM., Rice-EvansC. , 1999).

Затем все эксперименты были проведены на белых нелинейных крысах массой 180-220 г, разводимых в виварии Ангарской государственной Технической Академии (ветеринарное удостоверение 238 № 0018942 от 22 ноября 2011 г), токсикологическое исследование проводили на белых нелинейных мышах, массой 20-22 г, разводимых в виварии научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (ветеринарный сертификат 254 №0336050 от 28.07.2010).

Исследования выполнены в соответствии с этическими требованиями по работе с экспериментальными животными, изложенными в следующих нормативно-правовых документах: «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу МЗ СССР №775 от 12.08.1977 г.), «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005), «правила лабораторной практики» (приложение к приказу МЗ РФ №708н от 23.08.2010 г.)

Нанокомпозитный препарат селена(нано-Se) был синтезирован в Иркутском Институте Химии им. А.Е. Фаворского. Нанокомпозитный препарат селена представляет собой порошок оранжевого цвета, хорошо растворим в воде.

Методы исследования острой токсичности

Исследования проводили согласно Руководству по экспериментальному (доклиническому) исследованию новых фармакологических веществ (Хабриев, 2005). Исследования проведены на 60 мышах (30 самцов, 30 самок), массой 20-22 г. Животные были разделены на 6 групп. Все животные получали препараты, разведенные водой, peros; первые 6 ч после дачи препарата за животными вели непрерывное наблюдение. Животные первой группы получали селенит натрия в дозе 4,56 мг Se/кг (токсическая доза селенита натрия) - контрольная группа, животные второй группы получали 9,12 мг Se/кг (летальная доза селенита натрия согласно литературным данным), животные третей группы – 9,50 мг Se/кг. Исследуемый препарат давали, начиная с дозы 9,12 мг Se/кг и далее увеличивали дозу в 2 раза, то есть 4 группа получала нано-Se в дозе, эквивалентной смертельной дозе по содержанию селена в препарате селенита натрия (9,12 мг Se/кг); 5 группа – нано -Se (20 мг Se/ кг); 6 группа – нано - Se (40 мг Se/кг). За животными вели наблюдение 14 дней.

Распределение животных по группам в зависимости от применения препаратов приведено в таблице 1.

После декапитации животных в сыворотке крови проводили определение содержания двойных связей (Дв.св.) конъюгированных диенов (ДК), ТБК-активных продуктов (ТБК-АП), общую антиокислительную активность (АОА), токоферол, и ретинол. В клеточном содержимом крови проводили определение активности супероксиддисмутазы (СОД), cодержание окисленного (GSSG) и восстановленного (GSH) глутатионов и их соотношение. Исследования крови и ее компонентов на содержание компонентов системы пероксидации липидов-антиоксидантной защиты (ПОЛ-АОЗ) проводили в Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН, согласно применяемой в этом учреждении лабораторной технологии (Колесникова Л. И. 1993. – 39 с.).

Материалом служили головной мозг, легкие, печень, желудок, почки, селезенка крыс. Органы фиксировали в 10% нейтральном формалине, после чего осуществляли проводку и заливку в парафин+воск. С каждого блока получали серийные срезы (5 мкм) на микротоме С. Reichert. w. ien№ 2281 и окрашивали их гемотоксилин-эозином по Карачи (Меркулов Г.А., 1969). Морфометрию проводили с помощью окуляра-микрометра LOMOMOB -1-16^* на микроскопе LOMOМикмед -1.В нефиксированных срезах печени, приготовленных в криостате (10 мкм), методом гистохимического анализа определяли содержание общих липидов по Лизону(судан черный), гликоген (по методу ШабадашаА.Л., 1947) контроль проводили с диастазой, активность ЩФ (по Берстону) сукцинатдегидрогеназы (СДГ, по Нахласу). Патоморфологические исследования проведены в отделе токсикологии НИИ биофизики ФГБОУ ВПО «Ангарская государственная техническая академия».

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью лицензионного пакета прикладных программ STATISTICA 6.1. (StatsoftInc., США); правообладатель лицензии ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения РАМН (г. Иркутск).

Статистическую обработку проводили параметрически с учетом t-критерия Стьюдента, причем разность различий средних арифметических признавали значимой при Р ≤ 0,05.

2.3. Результаты токсикологического исследования

Исследование острой токсичности показало, что изучаемый нанокомпозитный препарат селена (арабиногалактан + нано-Se) в дозе 9,12 мг Se/кг не вызвал смерть ни одной мышки; в дозе 20 мг Se/кг – все мыши опытной группы остались живы; доза 40 мг Se/кг также не явилась летальной для животных. Препарат сравнения, селенит натрия, вызывает 100% гибель мышей в дозе 9,50 мг Se/кг.

При определении антиоксидантного действия нанокомпозитного препарата селена invitro, установили, что чистый АГ (является матрицей-носителем наноселена) не обладает каким-либо антирадикальным действием, а исследуемый нанокомпозитный препарат селена обладает антирадикальной активностью. Поскольку исходный АГ не способен ингибировать ABTS•⁺, можно полагать, что АРА композита определяется наличием в нём Se. При этом нанокомпозитный препарат не уступает известному антиоксиданту - аскорбиновой кислоте.

На втором этапе эксперимента изучали антиоксидантное действие нано-Se на организм лабораторных животных. Полученные данные показали, что во все сроки эксперимента (7, 14, 21 сутки) содержание промежуточных продуктов (ДК, мкМ/л) в группе нано-Se ниже, чем в других опытных группах и приближается к показателю группы интактных животных (рис 1). Достоверность р <0,05.
Рисунок 1 - Изменение содержания продуктов ПОЛ в сыворотке крови
Представляется закономерным, что наноселен, введенный в матрицу арабиногалактана, оказывает положительный эффект и при генерации так называемых ТБК-активных продуктов, которые могут ингибировать биологически активные амины, которые вносят значительный вклад в генерацию эндогенной интоксикации (Зайчик А. Ш., Чурилов Л. П., 2001).

Не исключено, что определенная защитная функция от вводимого токсиканта обусловлена и арабиногактаном, который может обладать этим эффектом в серии экспериментов через 21 сутки, когда потери наночастиц селена значительны, а освободившаяся органическая матрица может проявить гепатопротекторные свойства (Колесникова Л.И., 2011; Чистяков Ю.В. 2007).

Анализ такого интегрального показателя, как величина общей АОА (усл.ед.), показывает, что при введении экспериментальным животным нанокомпозитного препарата селенауже на 7 день эксперимента этот показатель практически не изменяется по сравнению с таковым для интактных крыс (20,26±1,664 и 19,90±1,784 соответственно); кроме того, статистически значимо он превышает аналогичные данные для арабиногалактана (13,50±1,726) и особенно для четыреххлористого углерода (9,020±1,630). А к 21 дню эксперимента величина АОА в группе нано-Seсхожа с показателями группы интактных животных (20,22±1,616 и 20,00±1,363 соответственно).

Содержание витамина Е в сыворотке крови крыс после воздействия токсиканта и дачи АГ и нано-Se превышало содержание в сыворотке крови интактных крыс на 69,5% и 28,3% соответственно. Через неделю, после отмены токсиканта и действия препаратов, уровень витамина Е в группах АГ и нано-Se всё также выше, чем у интактных животных на 35,4% и 12,3% соответственно. На 21 сутки эксперимента картина содержания витамина изменяется: в группе АГ он остается на прежнем уровне, но в группе нано-Se содержание витамина Е падает на 35,8% по сравнению с интактными животными. Подобная картина наблюдается и при изучении содержания витамина А в сыворотке крови животных всех опытных групп.Такой эффект мы связываем с тем, чтоSe и витамин Е обладают синергетическим действием, но к 21 дню эксперимента, как уже было сказано, потери наночастиц селена значительны.

Изменения в содержании СОД имеют явный характер на 7 день эксперимента. Так при действии тетрахлорметана, содержание СОД снижалось на 34,15%, в группе животных, которым давали чистый АГ – снижалось на 17,96%, а в группе нано-Se – на 1,038%. На 14 день эксперимента содержание СОД в сыворотке крови интактных животных практически не изменился, также остался на прежнем уровне ив группе АГ (1,343±0,040 (ус.ед) и 1,390±0,083(ус.ед) на 7 и 14 день соответственно), и увеличивается на 7,72% в группе нано-Se по сравнениию с интактными животными (1,730± 0,097(ус.ед) и 1,606±0,118(ус.ед)соответственно).

На 21 день эксперимента содержание СОД в группах животных «интактные», «АГ» и «нано-Se» остается практически на прежнем уровне, а в группе CCl₄, где содержание этого фермента всегда было ниже, начинает увеличиваться и приближаеться к показателям интактной группы. Известно, что СОД обладает самой высокой скоростью каталитической реакциии быстро разрушается. Из экспериментов становится видно, что действие токсина истощает содержание этого прооксиданта, а АГ и нано-Se, снижая образование ТБК-активных продуктов, способствуют сохранению СОД в клетках.

Глутатион восстановленный (GSH) является важнейшим внутриклеточным антиоксидантом и его активность зависит от наличия в организме элементного селена, а также витамина Е. В клетках же GSH, восстанавливая дисульфидную связь, превращается в GSSG. Содержание GSH в группе нанo-Se на 7 день эксперимента достаточно высокое (1,826±0,069 мМ/л) и приближается к показателям группы интактных животных (2,013±0,172 мМ/л). Уровень восстановленного и окисленного глутатиона в группе нано-Seво все сроки эксперимента близок к показателям группы интактных животных и выше, чем в группах сравнения. Это говорит о высоком уровне антиоксидантной защиты клеток во все сроки эксперимента.

Вместе с тем, при введении препарата наноселена на фоне затравки экспериментальных животных четыреххлористым углеродом, величины активности СОД и концентрация окисленного и восстановленного глутатионов были близки к соответствующим показателям животных интактной серии.

Так же о защитном действии нанокомпозитного препарата говорит и наступление окислительного стресса, о чем свидетельствует показатель «коэффициент окислительного стресса». Коэффициент окислительного стресса (КОС) рассчитывается соотношение продуктов ПОЛ к показателям АОЗ (патент № 2011617323). При КОС>1 регистрируют развитие окислительного стресса.
КОС = (ДК_i/ ДК_n) * (КД-СТ_i/ КД-СТ_n)*(ТБК-АП_i/ ТБК-АП_n)

(СОД_i/ СОД_n)*(GSH_i/GSSG_n)*(E_i/E_n)*(A_i/A_n)

Достоверными считали различия при р ≤0,001.

Сильный окислительный стресс наступает в группе животных CCL₄ (КОС = 87,807±28,8; 414,554±181,377; 113,49±42,424 на 7,14 и 21 сутки эксперимента; р≤0.005). Поэтому интересным представилось сравнить КОС опытных групп животных с интактными.

Рисунок 2 - Изменение КОС
Из рисунка 2 видно, что у интактных животных отсутствует окислительный стресс. АГ сначала оказывает защитное действие на организм животных. Однако, обладая гепатопротекторным действием, он не обладает антирадикальной активностью, то КОС увеличивается со временем, превышая уровни КОС интактных животных и не достигая уровней КОС группы CCL_4, где явное наличие сильного окислительного стресса (р ≤0,005).

Композитный препарат наноселена проявляет мощное защитное действие на организм. На 7 сутки исследования КОС практически сравним с КОС интактных животных (р ≤0,005). На 14 день – наблюдается небольшое увеличение КОС. Возможно, это связано с тем, что на данном сроке происходит активная регенерация органов и тканей, усиление метаболических процессов с активным расходованием Se. Получается, что к 21 суткам потери наночастиц селена значительны. Однако КОС остается <1, значит, окислительного стресса нет, и организм животного пришел в нормально физиологическое состояние не только по биохимическим показателям, но и по морфологическим.

В печени на 7 день эксперимента после воздействия токсиканта отмечена крупнокапельная жировая дистрофия в области центральных вен, что подтверждается гистохимическими исследованиями.

При микроскопическом исследовании на 7 день эксперимента в группе CCL₄ в печени отмечены проявления выраженной жировой дистрофии гепатоцитов в области центральных вен, что подтверждается гистохимическими исследованиями. Гепатоциты увеличены в размере, с округлыми вакуолями различных размеров со смещением ядра к клеточной мембране. Большинство гепатоцитов с практически опустошенной цитоплазмой, пикнотичными и гиперхромными ядрами, что свидетельствует о состоянии паранекроза. По периферии этих очагов гепатоциты были меньшего размера с гиперхромным ядром (рисунок 1а).

На 7 день эксперимента в группе нано- Se в печени отмечается средне- и мелкокапельная жировая инфильтрация вокруг центральных вен (рисунок 1б). Размер гепатоцитов практически соответствовал интактным животным. Встречаются лишь отдельные гепатоциты в состоянии паранекроза с опустошенной цитоплазмой и гиперхромным пикнотичным ядром. Биллиарный эпителий не был изменен, воспалительных инфильтратов не отмечено, также не отмечено застойного полнокровия в магистральных сосудах и капиллярах.

A.	Б.
В.	Г.
Рисунок 1 -Печень крысы; а. - ССL4 (7 сутки эксперимента); б. – CCl4 + нано-Se (7 сутки эксперимента) небольшое расширение синусоидов, отсутствует гемодинамическое расстройство. В цитоплазме выявляются вакуоли (м.б. гидропическая дистрофия); в. - ССL4 (14 сутки эксперимента); г. - CCl4 + нано-Se (14 сутки эксперимента). Окр. Гематоксилин-эозин. Ок. 10. Об. 40.

Так же выявленное скопление липидов было подтверждено гистохимическим исследованием (рисунок 2а, б). На 7 сутки эксперимента при исследовании на общие липиды в группе CCL₄ –очаги ярко-выраженной жировой инфильтрации. При введении нано-Se – очаги инфильтрации липидов значительно меньших размеров и не так явно выражены. Содержание общих липидов на 14 сутки (рисунок 2б) - выраженное отсутствие образования липидов в клетках печени при коррекции препаратом нано-Se токсического поражения печени (рисунок 2 б-2)

А

Б

В

Г

Рисунок2- 1 – группа CCl₄; 2 –. опытная группа нано-Se. (А, Б) - выраженное скопление липидов в области центральных вен на 7 и 14 сут. эксперимента соответственно. Окраска суданом черным. (В, Г) - определение активности ЩФ на 7 и 14 сут. эксперимента соответственно. Окр. методом азосочетания. Ок. 10. Об. 40.

Поскольку арабиногалактан сам обладает мембранотропными свойствами и оказывает протективное действие на гепатоциты (Гуцол Л.О. 2006; Медведева С.А. 2002), представилось интересным сравнить действие чистого арабиногалактана на гепатоциты, в сравнение с препаратом нано-Se, где элементный Se встроен в решетку арабиногалактана.

Содержание гликогена в печени в обеих группах на 7 день эксперимента оставалось выше, чем в группе ССL₄. В группе АГ и нано-Se отмечено диффузное снижение гликогена. На 14 день эксперимента гликоген приходит в норму. В группе АГ все так же заметное его снижение по сравнению с интактными животными. Однако в группе нано-Se содержание гликогена на 14 день эксперимента даже значительно выше, чем у интактных животных (рисунок 3а, б).

Активность сукцинатдегидрогеназы заметно увеличена в группе АГ (рисунок 3В-2) по сравнению с группой ССl₄ (рисунок 3В-1).

А. 7 сутки

Б. 14 сутки

В.
Рисунок 3 - 1. – действие нано-Se; 2 – действие арабиногалактана. (А, Б) - гликоген. Окр. методом Шабадаша. (В) - определение СДГ по Нахласу. 1 - выраженное снижение активности сукцинатдегидрогеназы в печени при воздействии CCl₄. 2 – АГ. Ок. 10. Об. 40.

Подробный анализ литературы данных, результаты исследований, проведенных нами с применением биохимических и морфологических методов в комплексе, стали основанием для создания концептуальной схемы биологического влияния нанокомпозитного препарата селена на основные биохимические звенья при токсическом действии тетрахлорметана. Сущность концепции заключается в том, что ведущим саногенетическим звеном нанокомпозитного препарата селена является ингибирующее действие на ПОЛ.
Снижение уровня естественных антиоксидантов

Образование свободных радикалов и усиление ПОЛ

Нарушение структуры и проницаемости клеточных мембран, высвобождение активных ферментов, аутолизис.

Нарушение окислительного фосфорилирования

Нарушение белковообразовательной функции

CCL₄

Токсический шок, поражение нервной системы

Острая печеночная и почечная недостаточность

Тромбозы, геморрагии в легких, в органах брюшной полости.

Летальный исход

Нано-Se – антиоксидантный эффект

Нано-Se - мембранопротекторный эффект


Рисунок 4 -Концептуальная схема влияния нанокомпозитного препарата селена на основные саногенетические механизмы при отравлении четыреххлористым углеродом (по данным литературы и результатам собственных исследований): прямая линия – взаимодействие, объемная линия – протекторное действие.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. 
   В исследованиях invitro показано, что нанокомпозитный препарат арабиногалактан + нано-селен обладает антирадикальным действием, причем действие это выражено именно за счет наличия селена в препарате. Антиоксидантная активность селена сохраняется при его диспергировании (размер 40-100 нм), и хорошо выражена в нанокомпозитном препарате селена.
   
2. 
   Нанокомпозитный препарат селена в дозе 2 мг /100 г массы животного не оказывает токсического действия на организм. Таким образом, диспергированные и стабилизированные арабиногалактановой матрицей молекулы селена имеют меньшую токсичность по сравнению с элементным селеном.
   
3. 
   Полученный антиоксидантный эффект на организм животных сильнее выражен в группе животных, получавших нанокомпозитныйпрепарат селена, что связано с наличием селена.
   
4. 
   Оценка показателя коэффициент окислительного стресса подтверждает защитное, антиоксидантное действие изучаемого препарата. КОС в группе нано-Se на 21 день эксперимента 0,164±0,496, в то время как в группе животных CCl₄ этот показатель равен 87,807±28,8, АГ – 7,312±1,721. В группе интактных животных – 1,095±0,598 (р<0,05)
   
5. 
   Нанокомпозитный препарат селена в значительной степени снижает токсическое воздействие CCl₄ на печень, что проявляется в меньшей степени дегенерации гепатоцитов, уменьшении жировой дистрофии и нормализации активности ферментов в цитоплазме гепатоцитов. Количество двуядерных гепатоцитов увеличивалось на 3,1% по сравнению с интактными животными, что указывает на регенерацию ткани печени.
   
6. 
   В восстановительном периоде (14 сутки после воздействия) морфологически структура печени, а также метаболические процессы (активность СДГ, ЩФ, содержание гликогена и общих липидов) при введении нано-Se в незначительной степени отличались от интактных животных.
   

Результаты исследования являются изучением нового наноструктурированого композитного препарата селена и могут быть использованы в следующих областях:

1. 
   Полученные результаты исследований можно использовать при написании учебных пособий и монографий.
   
2. 
   Предложенная концептуальная схема является доклиническим обоснованием для дальнейшего изучения действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных.
   
3. 
   В экспериментальной и ветеринарной практике для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний.
   

1. 
   Карпова, Е. А.Патоморфологическая оценка биологического действия препарата наноселена при токсическом поражении печени / Карпова Е.А., Щукина О. Г., Бенеманский В. В., Ильина О. П.// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2013. – Т. 93, №5. – С. 141-145.
   
2. 
   Карпова, Е.А. К вопросу о токсичности препаратов на основе наноселена / Е.А. Карпова, О.К. Демиденко, О.П. Ильина // Вестник КрасГАУ. – 2014. – №4. – С. 207-210.
   
3. 
   Карпова, Е.А. Коэффициент окислительного стресса при патологии печени и применении нового нанокомпозитного препарата селена / Е.А. Карпова, О.П. Ильина // Вестник ИрГСХА. – 2014. –выпуск 61, апрель. - С. 78-82
   
4. 
   Карпова, Е.А. Проблема – стресс / Е.А. Карпова, О.П. Ильина // Материалы XI международной Байкальской научно – практической конференции по проблемам ветеринарной медицины «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» Иркутск, 15-16 марта 2011г. – стр. 117-120.
   
5. 
   Карпова, Е. А. Патоморфологические аспекты стресса /Е.А. Карпова, О.П. Ильина // Материалы региональной научно – практической конференции «Актуальные проблемы АПК» Иркутск, 20-22 апреля 2011г. – стр.
   
6. 
   Карпова Е.А. Влияние нанопрепарата селена на состояние системы ПОЛ-АОЗ при токсическом поражении печени /Е.А. Карпова, Б.Я. Власов, О.П. Ильина // Материалы 1-й Международной научно-практической конференции «Перспективы развития научных исследований в 21 веке» (31 января 2013 г.) / НИЦ «Апробация» - Москва. Издательство Перо, 2013. – с. 230-233.
   
7. 
   Карпова Е.А. Нанокомпозитные материалы. Перспективы использования в ветеринарии / Е.А. Карпова // Научные исследования и разработки к внедрению в АПК: международная научно-практическая конференция молодых ученых 17-18 апреля 2013 г. Иркутск. – Иркутск: Изд-во ИрГСХА, 2013.
   
8. 
   Карпова, Е. А. Морфофункциональная оценка биологического действия нанопрепарата селена при токсическом поражении печени / Е.А. Карпова // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию профессора Василия Родионовича Филиппова (27-29 июня 2013г, г. Улан-Удэ). Часть I. - Улан-Удэ: Изд-во БГСХА им. В.Р. Филиппова, 2013. – с. 12-15
   
9. 
   Карпова Е.А. Морфологические изменения в почках при токсическом поражении организма и при коррекции поражения нанокомпозитным препаратом селена / Е.А. Карпова, Р.В. Рыхальский// Экологическая безопасность и перспективы развития аграрного производства Евразии: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 60 летию аспирантуры ИрГСХА (3-5 декабря 2013 г.). Часть I. – Иркутск: Изд-во ИрГСХА, 2013. – с. 185-189.
   
10. 
    Карпова Е. А. Перспективы использования нанокомпозитного препарата арабиногалактан+селен/ Карпова Е.А., Ильина О.П.// «Научно-практические аспекты применения лекарственных растений в производстве пищевых продуктов 19-20 декабря 2013 г., Казахстан, г. Семей. – стр. 107- 110.
    
11. 
    Карпова Е.А. Определение острой токсичности нового нанокомпозитного препарата селена / Е.А. Карпова // Современные проблемы и перспективы развития АПК: Материалы региональной научно-практической конференции с междунар. участием, посвященной 80-летию ФГБОУ ВПО ИрГСХА (25-27 февраля 2014г.), Часть I. – Иркутск: Изд-во ИрГСХА, 2014. – С. 40-43.
    
12. 
    Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения: Заявка на изобретение от 30.12.2013 регистрационный № 2013159311.