Моделирование и коррекция психомоторных расстройств новорожденных 03. 03. 01-физиология

03.03.01-физиология

Санкт-Петербург

2011

Диссертационная работа выполнена в Физиологическом отделе им. И.П. Павлова Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

доктор биологических наук

академии наук Институт

эволюционной физиологии и

биохимии имени И. М. Сеченова РАМ

Защита диссертации состоится 26 мая 2011 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д001.022.03 Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский проспект, 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН, 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12.

Ученый секретарь Диссертационного совета Л.В. Пучкова

профессор, доктор биологических наук


характеристика работы

Актуальность проблемы. В структуре причин перинатальной заболеваемости и смертности одно из ведущих мест занимают гипоксические повреждения головного мозга плода. Гипоксические поражения центральной нервной системы в антенатальный период жизни вызывают широкий спектр отдаленных психомоторных расстройств у детей: синдром дефицита внимания, детский церебральный паралич с двигательными, коммуникативными и интеллектуальными расстройствами (Saigal et al., 2000; Hack, Fanoroff, 2000; Delobel-Ayoub et al., 2006; Барашнев, 2007; Савельева и соавт., 2008; Berger et al., 2009).

Одной из главных причин перинатальных гипоксических поражений является плацентарная недостаточность, которая имеет мультифакторную природу (Шниткова и соавт., 2000; Радзинский и соавт., 2007). Многочисленные этиологические факторы реализуют свое действие на плод через нарушение кровообращения первоначально в плаценте, а в последующем и у плода. Морфофункциональные изменения в плаценте клинически проявляются внутриутробной гипоксией и задержкой развития плода (Кулаков и др., 2004; Rees, Jnder, 2005). Группу риска развития плацентарной недостаточности составляют больные с невынашиванием беременности, гестозами, экстрагенитальными и нейроэндокринными заболеваниями, недостаточностью питания, перенесшие или находящиеся в состоянии стресса (Стрижаков и соавт., 2000; Чернуха, 2001; Кошелева и соавт., 2002; Sibai, 2003; Jackson et al., 2004; Ananth et al., 2006).

При осложненной беременности (преэклампсии, невынашивании, сахарном диабете, анемии) в плаценте наблюдается тканевая гипоксия, обусловленная явлениями окислительного стресса. Гипоксия любого генеза реализуется через активацию процессов перекисного окисления мембранных фосфолипидов и снижения активности антиоксидантных систем защиты. Физиологическое значение перекисного окисления липидов многогранно: активные формы кислорода являются вторичными посредниками регуляторных влияний (пролиферации, апоптоза и дифференцировки, участвует в процессах обновления мембранных клеточных структур). Механизм перекисного окисления липидов лежит в основе синтеза тканевых регуляторов – простагландинов и лейкотриенов. Накопления продуктов переокисления приводят к повреждениям мембран отдельных клеток, тканей и целого органа, что вызывает морфофункциональные изменения в плаценте и развитие патологических состояний в последующем у плода (Erez et al., 2008; Амиров и Фролова, 2009; Сидорова и Унанян, 2009; Haque et al., 2010). Окислительный стресс приводит к повреждению эндотелия сосудов, мембран форменных элементов крови, нарушению реологических и коагуляционных свойств крови, микроциркуляции, что вызывает поражение плаценты и головного мозга плода (Wang, Alexanderb, 2000; Roberts, Hubel, 2004; Лехович и соавт., 2006). Параллельно с этими изменениями возникает нарушение синтеза и дисбаланс простаноидов материнского и плодового происхождения (простагландины класса Е и F, простациклин, тромбоксан). Возникающий дисбаланс определяется концентрацией вазоактивных веществ (недостаточная продукция простациклина и простагландинов класса Е или гиперпродукция тромбоксана и простагландинов класса F) сопровождается спазмом сосудов в маточно-плацентарно-плодовом комплексе, вносит существенный вклад в нарушение кровотока между матерью и плодом и, следовательно, влияет на весь ход обменных процессов между ними (Крукиер, 2008; Мозговая и Зайнулина, 2008).

Для снижения перинатальной заболеваемости и отдаленных последствий гипоксических поражений мозга наиболее актуальными становятся своевременная диагностика развивающихся при беременности осложнений, лекарственная терапия и проведение профилактических мероприятий. Традиционные методы профилактики и лечения часто не дают должного эффекта, в связи с чем одной из актуальных задач современного акушерства и перинатологии является поиск новых методов предупреждения и терапии данной патологии.

Для испытания и выбора новых методов лечения нами разработана модель психомоторных поражений у новорожденных детей, реализуемая путем введения амниотической жидкости женщин с осложнениями беременности или сыворотки крови их детей беременным крысам, что вызывает морфофункциональные нарушения у потомства. С целью профилактики и коррекции осложнений, возникающих при беременности и гипоксических поражений мозга плода, мы провели исследование влияния курса введений ω-3 полиненасыщенных жирных кислот (ω-3 ПНЖК) в эксперименте, а также в клинике на показатели акушерских и перинатальных исходов. Основные эффекты влияния данных веществ обусловлены тем, что они участвуют в нейрогенезе, подавляют активность перекисного окисления липидов, повышая активность ферментов антиоксидантной системы защиты крови, оказывают мембраностабилизирующее действие, нормализуют реологические и коагуляционные свойства крови, и тем самым улучшают кровоток в системе «мать-плацента-плод» (Bourre, 2004; Мозговая и Зайнулина, 2008; Громова и соавт., 2009; Кошелева и соавт., 2009).

Цель работы: изучение эффективности применения ω-3 ПНЖК в эксперименте на крысах и в клинике для профилактики и коррекции психомоторных нарушений новорожденных, родившихся от матерей с осложненным течением беременности.

В задачи исследования входило:

1. Воспроизвести на потомстве крыс модель психомоторных нарушений новорожденных детей, родившихся от матерей с осложненным течением беременности, путем введения беременным самкам амниотической жидкости женщин или сыворотки пуповинной крови их детей.

2. Оценка эмбрионального развития, морфологических изменений моторной области коры и психомоторного поведения экспериментальных крысят в постнатальный период.

3. Исследование эффективности пренатального воздействия ω-3 ПНЖК для коррекции и предотвращения структурных и функциональных нарушений у крысят в модели психомоторных нарушений новорожденных детей.

4. Изучение эффектов включения ω-3 ПНЖК в комплексную терапию беременных женщин для снижения частоты и тяжести осложнений, возникающих при беременности и перинатальной заболеваемости.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Внутриамниотическое введение крысам на 14-й день эмбриогенеза амниотической жидкости женщин с осложненным течением беременности (невынашиванием, гестозом, плацентарной недостаточностью) или сыворотки крови их новорожденных детей с церебральной ишемией вызывает у крысят эмбриологические, морфологические и психомоторные нарушения.

2. Введение крысам ω-3 ПНЖК на 14-й, 15-й и 16-й дни беременности при моделировании психомоторных нарушений новорожденных, корригирует структурные и функциональные нарушения у крысят. Профилактическое введение в рацион беременных крыс ω-3 ПНЖК, т. е. на 9-й, 12-й, 13-й и 14-й дни беременности, оказывает выраженное нейропротективное действие.

3. Включение ω-3 ПНЖК в комплексную терапию осложнений беременности у женщин (невынашивание, гестозы, плацентарная недостаточность) способствует снижению частоты и тяжести осложнений гестационного периода и улучшению перинатальных исходов.

Экспериментальная часть работы выполнена на 145 белых крысах (самки и самцы) породы Вистар массой 180-200 г. и на их потомстве (899 крысят). Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище, исследования проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986).

В работе использовали амниотические жидкости 21-й беременной женщины и сыворотки пуповинной крови их новорожденных детей, которые получали из родильных домов № 9, 13, 16, 18 и НИИ акушерства и гинекологии РАМН имени Д.О. Отта Санкт - Петербурга. У 11 женщин имело место физиологическое течение беременности и родов, оценка новорожденных по шкале Апгар 8-9 баллов. У 10 женщин беременность протекала с осложнениями (гестозом, угрозой прерывания беременности, предлежанием плаценты). Оценка новорожденных по шкале Апгар составила 5-7 баллов (у одного новорожденного), 6-7 баллов (у двух новорожденных), 6-8 баллов (у семи новорожденных). Биологические жидкости центрифугировались в течение 15 минут со скоростью 3000 об /минуту, хранились при -18ºС.

Метод оценки эмбриотоксического эффекта и действие на постнатальное развитие крысят

Самок на стадии эструс-проэструс подсаживали к самцам в соотношении 3:1 во второй половине дня (после 17-18 часов). Критерием 1-го дня беременности у крыс считали наличие сперматозоидов во влагалищном мазке (Чеботарь, 1985). На 14-й день беременности крыс оперировали и в каждую амниотическую полость рога матки вводили по 0,03 мл амниотической жидкости женщины или сыворотки пуповинной крови новорожденных. Детали проведения методики описаны ранее (Абдаладзе и соавт., 1994). После эвтаназии и вскрытия самок на 20-й день беременности оценивали эмбриотоксический эффект. Определяли число живых и погибших плодов, массу тела плодов, пороки развития (Чеботарь и соавт., 1995). Для обнаружения внешних видимых аномалий развития все живые плоды обследовали под бинокулярным микроскопом типа МБС (Хабриев, 2005). Для выявления патологии внутренних органов исследование проводили по методике Вильсона в модификации А. П. Дыбана (Отдел эмбриологии НИИЭМ АМН СССР) (Чеботарь, 1985; Хабриев, 2005). 20-ти дневные плоды фиксировали в жидкости Буэна не менее 1-й недели, затем переносили в 70° спирт. Перед проведением исследований плоды в течение 10 минут отмачивали в дистиллированной воде и затем подвергали микроанатомическому сечению. Для целей исследования плоды разрезали бритвой по 9-ти сагиттальным срезам, которые изучали под бинокулярной лупой (Дыбан, 1967). В постнатальном периоде жизни наблюдали за физическим развитием потомства. У родивших самок подсчитывали число живых и мертвых новорожденных крысят, измеряли массу тела крысят на 1-е, 4-е и 21-е сутки жизни (Котин, 1985; Методические указания по изучению эмбриотоксического действия фармакологических веществ и влияния их на репродуктивную функцию, 1986; Хабриев, 2005). Для оценки физического развития определяли индексы жизнеспособности, лактации, прироста массы тела. Индекс жизнеспособности (ИЖ) - отношение числа живых крысят на 4-е сутки жизни к числу родившихся крысят (в процентах). Индекс лактации (ИЛ) - отношение числа живых крысят на 21-е сутки жизни к числу живых на 4-е сутки (в процентах). Индекс прироста массы тела (ИПМТ) – отношение массы крысенка на 21-е сутки жизни к его массе на 4-е сутки жизни (в процентах).

Морфологический анализ больших пирамидных нейронов V слоя моторной области коры мозга крысят, подвергшихся воздействию сывороткой крови новорожденных детей в раннем онтогенезе, проводили на 23-е и 46-е сутки жизни, с использованием 2-х методов – количественного и качественного. Для количественной оценки больших пирамидных нейронов использовали метод, основанный на ретроградном аксональном транспорте пероксидазы хрена. Детали проведения анализа описаны ранее (Обухова и соавт., 1992). 30% раствор пероксидазы хрена («Олайна») в объеме 2 мкл вводили билатерально в люмбальное утолщение. Через 2 суток животное подвергали эвтаназии, мозг фиксировали in situ путем перфузии физиологическим раствором, а затем 2,5%-ым раствором глутаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4). Мозг фиксировали в этом растворе течение 5 часов при +4^ºС затем его перекладывали на 48 часов в 30%-й раствор сахарозы на фосфатном буфере. На микротоме изготавливали серию фронтальных срезов мозга толщиной 60 мкм. Пероксидазу хрена выявляли по методике М.М. Мезулам (Mesulam, 1982). По атласу фронтальных срезов мозга крысы, в моторной области коры отбирали уровни, соответствующие представительству задних лап (Paxinos, Watson, 1982; 2005). Подсчитывалось количество нейронов на 3-х уровнях в правом и левом полушариях мозга, отдельно по каждой крысе и суммарно по всем крысам.

Для анализа, отражающего развитие дендритной системы больших пирамидных нейронов, был применен метод Гольджи-Копш (Озирская и Туманова, 1992; Мелик-Мусян и Фанарджян, 2003). Мозг 23-х и 46-ти суточных крысят фиксировали смесью формалина и 3,5%-го бихромата калия в течение 3-4 суток. После серебрения 0,75%-ным раствором нитрата серебра в течение 3-х суток мозг животных заливали целлоидином и изготавливали на микротоме серии фронтальных срезов толщиной 100-120 мкм из моторной области коры мозга крысят, соответствующей представительству задних конечностей. С препаратов сделаны рисунки 82-х больших пирамидных нейронов при увеличении в 400 раз. Рисунки были морфометрически проанализированы на специальном приборе МОР-30. Определяли следующие характеристики больших пирамидных нейронов V слоя моторной области коры: площадь дендритного ареала, длину апикального дендрита, суммарную длину дендритов и суммарное число ветвлений дендритов для каждого нейрона.

Метод оценки психомоторного поведения крысят

Анализ психомоторного поведения животных проводили по ранее разработанной в лаборатории методике (Атаева и др., 1993). На 21-30-е сутки жизни контрольные и экспериментальные крысята тестировались на переходных сооружениях. Установка включала две одинаковые площадки размером 20x20 см, расположенные на высоте 35 см, между которыми помещались различные переходные сооружения длиной 120 см:

а) лестница, изготовленная из металлической проволоки диаметром 0,2 см, шириной 1,0 см, с расстоянием между ступенями 2 см; б) рельсы, состоящие из 2 параллельных металлических реек, шириной 0,3 см, расстоянием между рейками 2 см; в) эстакада – рейка шириной 1 см.

На одной из площадок находился съемный домик с норковым отверстием и пищевым подкреплением, который переставлялся в зависимости от направления движения животного. Животным предоставляли последовательно усложняющиеся варианты перехода с одной площадки на другую (лестница, рельсы, эстакада). Каждый тест проводился 4 раза в день в течение 3-х дней. Во время эксперимента регистрировали следующие показатели: время от начала опыта до начала пробежки по переходным сооружениям (латентный период), время пробежки крысят по переходным сооружениям, количество срывов лапок.

Для коррекции структурных и функциональных нарушений у крысят, вызванных введением амниотической жидкости женщин с осложнениями беременности или сыворотки крови новорожденных детей с церебральной ишемией, использовали эпаден. Препарат разработан в НИИ биотехнологий (Москва), представляет собой 30% концентрат ω-3 ПНЖК, содержащий эйкозапентаеновую и докозагексаеновую кислоты. Жирные кислоты, входящие в состав препарата, участвуют в нейрогенезе, являются естественными элементами функционирования клеток, обладают антиагрегационной, антитромботической активностью и мембраностабилизирующим действием, оказывают антиоксидантное воздействие, улучшают микроциркуляцию и метаболизм в тканях. Препарат утвержден Госкомсанэпиднадзором России, сертификат № 63 от 10. 11. 1993 г. Регистрационное удостоверение № 002600. Р. 643.02.2001 от 21.02. 2001 г. выдан Министерством здравоохранения Российской Федерации.

Беременным крысам ω-3 ПНЖК вводили внутрижелудочно в дозе 0,5 мл. Использовали 2 варианта введения: 1-й вариант – после воздействия амниотической жидкости или сыворотки крови новорожденных, на 14-й, 15-й и 16-й дни беременности и 2-й вариант – до воздействия амниотической жидкости или сыворотки крови, на 9-й, 12-й, 13-й и 14-й дни беременности. Контрольную группу составили крысята, матерям которых в те же сроки беременности и тем же способом вводили физиологический раствор.

Клинические исследования. Обследованы 149 женщин с осложнениями, возникшими при беременности, в возрасте от 18 до 34 лет, которые были разделены на 2 группы. 1-я группа – 97 беременных, получили только традиционное лечение. 2-я группа – 52 беременных, получили комплексную терапию, т. е. одновременно с традиционной терапией принимали эпаден. В каждой капсуле содержится 300 мг эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислоты. Беременные получали препарат с их письменного информированного согласия по 2 капсулы 3 раза в день или 1,8 г/сутки. Проводилось 2 курса лечения – с 20 по 24 неделю и повторно через 1,5 месяца с 30 по 34 недели беременности. Обследование беременных женщин включало клинический и биохимический анализы крови, ультразвуковое исследование, кардиотокографию, допплерометрию маточных, плацентарных и плодовых сосудов.

Клиническое обследование новорожденных детей включало оценку состояния по шкале Апгар и неврологический осмотр. Оценку тяжести состояния ребенка при рождении проводили с использованием критериев, предложенных В. Апгар (Шабалов и соавт., 2003; Володин, 2007). Оценивали по балльной системе каждый из 5-ти показателей: частота сердечных сокращений, дыхание, мышечный тонус, рефлексы, цвет кожи в конце 1-й и 5-й минуты после рождения. Согласно шкале, при отсутствии сердечных тонов, дыхания, мышечного тонуса, рефлексов, бледности кожи ставили оценку «0» баллов. При частоте сердцебиения в 1 минуту менее 100 ударов, нерегулярном и медленном дыхании, умеренно сниженном мышечном тонусе (слабые движения), легкой гримасе на лице, цианотичности конечностей по «1» баллу. Сердцебиение в 1 минуту более 100 ударов, регулярное дыхание, активные движения, физиологическая поза новорожденного, громкий крик, розовые кожные покровы оценивали на «2» балла. В зависимости от суммарной оценки по шкале Апгар в конце 1-й минуты жизни выделяли умеренную и тяжелую формы асфиксии. Оценку 7 баллов и более через 1 минуту после рождения имели здоровые новорожденные дети, что свидетельствовало об отсутствии асфиксии, 4 - 6 баллов – признак умеренной асфиксии, 1 - 3 балла – тяжелая асфиксия.

При неврологическом осмотре проводили оценку поведенческого состояния, коммуникабельности, мышечного тонуса, спонтанной двигательной активности, физиологических рефлексов периода новорожденности, сухожильных рефлексов, активности сосания и глотания, наличия патологических симптомов. Лабораторные исследования заключались в изучении клинического анализа крови, общего анализа мочи, определении величины гематокрита, содержания глюкозы в крови, показателей кислотно-основного состояния и газов крови, нейросонографии, компьютерной томографии. Все дети до 1 года жизни находились под наблюдением невропатолога и неонатолога.

Методы статистической обработки данных. Оценку достоверности данных эмбриологических изменений, морфометрии, психомоторного поведения, в том числе показатели срывов лапок проводили с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок. Частоты появления той или иной патологии у беременных женщин и новорожденных детей, приведенные в таблицах 4, 5, 6, 7 сравнивали путем анализа таблиц сопряженности с использованием точного метода Фишера (Бююль, Цёфель, 2002). Все статистические расчеты проводили с помощью компьютерной программы SPSS 11.5. Результаты оценивали как статистически значимые при р≤0,05.
Результаты исследования и их обсуждение

Эмбриотоксический эффект и постнатальное развитие крысят

Оценка показателей эмбриотоксического эффекта и постнатального развития крысят показала, что введение амниотической жидкости женщин с физиологическим течением беременности не оказывало эмбриотоксического и тератогенного эффектов и не влияло на физическое развитие крысят (группа А) (табл. 1 и 2). Воздействие амниотической жидкостью женщин с осложнениями беременности (группа Б) вызывало внутриутробную гибель, аномалии развития и снижало массу плодов (табл. 1).