Методические рекомендации гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови список сокращений аа апластическая анемия

Заместитель Министра

здравоохранения и

социального развития

Российской Федерации

Р.А.ХАЛЬФИН

21 марта 2007 г. N 2050-РХ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ АНАЛИЗАТОРЫ. ИНТЕРПРЕТАЦИЯ АНАЛИЗА КРОВИ
Список сокращений
АА Апластическая анемия

АИГА Аутоиммунная гемолитическая анемия

АХЗ Анемия хронических заболеваний

ЖДА Железодефицитная анемия

НТЖ Насыщение трансферрина железом

ОЖСС Общая железосвязывающая способность сыворотки

ОПГА Острая постгеморрагическая анемия

ХПН Хроническая почечная недостаточность

ЭПО Эритропоэтин

эЭПО Эндогенный эритропоэтин

рЭПО Рекомбинантный эритропоэтин

CHr Содержание Hb в ретикулоцитах

CRC Скорректированный подсчет ретикулоцитов

FSC Прямое светорассеяние

HGB Концентрация гемоглобина в крови

HFR Ретикулоциты с высокой флюоресценцией

HLR% Процент незрелых ретикулоцитов

HLR# Абсолютное количество незрелых ретикулоцитов

Ht, НСТ Гематокрит

% Hypo Процент гипохромных эритроцитов

IRF Фракция незрелых ретикулоцитов

LFR Ретикулоциты с низкой флюоресценцией

MCV Средний объем эритроцитов

MCVr (MRV) Средний объем ретикулоцитов

MCH Среднее содержание гемоглобина в эритроцитах

MCHC Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах

MFR Ретикулоциты со средней флюоресценцией

MSRV (MSCV) Средний объем сферических ретикулоцитов

9

PLT Количество тромбоцитов (10 /л)

SSC Боковое светорассеяние

sTfR Растворимые рецепторы к трансферрину

12

RBC Количество эритроцитов (10 /л)

Ret Ретикулоциты

9

RET# Количество ретикулоцитов (10 /л)

RET% Количество ретикулоцитов (%)

RPI Индекс продукции ретикулоцитов

9

WBC Количество лейкоцитов (10 /л)

Высокотехнологические гематологические анализаторы способны измерять более 32 параметров крови, осуществлять полный дифференцированный подсчет лейкоцитов по 5-ти основным популяциям: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты, что делает возможным в случае отсутствия от референсных значений этих показателей не проводить ручной подсчет лейкоцитарной формулы.

Аналитические возможности гематологических анализаторов:

высокая производительность (до 100-120 проб в час)

небольшой объем крови для анализа (12-150 мкл)

анализ большого количества (десятки тысяч) клеток

высокая точность и воспроизводимость

оценка 18-30 и более параметров одновременно

графическое представление результатов исследований в виде гистограмм, скатерограмм.

Гематологические анализаторы имеют систему обозначения - флаги или "сигналы тревоги" - указывающую на отклонение параметров от установленных границ. Они могут касаться как увеличения или уменьшения количества тех или иных клеток, так и изменения их функционального состояния, которое отражается на характеристиках измеряемых прибором клеток. Во всех этих случаях необходим строгий визуальный контроль окрашенных препаратов с соответствующими комментариями.

Диагностические возможности гематологических анализаторов:

оценка состояния гемопоэза

диагностика и дифференциальная диагностика анемий

диагностика воспалительных заболеваний

оценка эффективности проводимой терапии

мониторинг за мобилизацией стволовых клеток из костного мозга.

Несмотря на все достоинства, даже самые современные гематологические анализаторы обладают некоторыми ограничениями, которые касаются точной морфологической оценки патологических клеток (например, при лейкозах), и не в состоянии полностью заменить световую микроскопию.
Преаналитический этап гематологических исследований
Контроль преаналитических факторов в гематологических исследованиях является ключевым для обеспечения качественных результатов тестов. Отклонения от стандартов при взятии пробы, транспортировке и хранении образца, интерферирующие вещества, а также факторы, связанные с пациентом, могут привести к неверным или неточным результатам анализов и, следовательно, к постановке ошибочного диагноза. До 70% лабораторных ошибок связаны именно с преаналитическим этапом исследования крови. За счет снижения числа ошибок на любом этапе преаналитической подготовки можно существенно улучшить качество гематологических анализов, снизить количество повторных проб, сократить расходы рабочего времени и средств на обследование пациентов.

Снижение до минимума возможных ошибок и обеспечение высокого качества гематологических исследований возможно за счет стандартизации преаналитического и аналитического этапов работы.

На точность и правильность результатов оказывает влияние техника взятия крови, используемые при этом инструменты (иглы, скарификаторы и др.), а также пробирки, в которые берется, а в последующем хранится и транспортируется кровь.

- Кровь для клинического анализа берут у пациента из пальца, вены или из мочки уха, у новорожденных - из пятки.

- Кровь следует брать натощак (после примерно 12 часов голодания, воздержания от приема алкоголя и курения), между 7 и 9 часами утра, при минимальной физической активности непосредственно перед взятием (в течение 20-30 мин.), в положении пациента лежа или сидя.

- Взятие материала следует проводить в резиновых перчатках, соблюдая правила асептики.

Венозная кровь. Венозная кровь считается лучшим материалом для клинического исследования крови. При известной стандартизации процессов взятия, хранения, транспортировки венозной крови удается добиться минимальной травматизации и активации клеток, примеси тканевой жидкости, при этом всегда имеется возможность повторить и/или расширить анализ, например, добавив исследование ретикулоцитов.

Достоверность и точность гематологических исследований, проводимых из венозной крови, во многом определяется техникой взятия крови.

Подготовка пациента к взятию крови из вены включает несколько этапов. Место венепункции нужно продезинфицировать марлевой салфеткой или специальной безворсовой салфеткой, смоченной 70 град. спиртом, и подождать до полного высыхания антисептика (30-60 секунд). Применение ватных тампонов и других волокнистых материалов подобного рода может привести к засорению волокнами счетной и гемоглобиновой камер, что влечет снижение точности и воспроизводимости измерения. Не рекомендуется использовать 96 град. спирт, так как он дубит кожу, поры кожи закрываются, и стерилизация может быть неполной.

Не рекомендуется вытирать и обдувать место прокола, пальпировать вену после обработки. Рука пациента должна покоиться на твердой поверхности, быть вытянута и наклонена немного вниз так, чтобы плечо и предплечье образовывали прямую линию. Необходимо следить, чтобы в момент взятия крови кулак пациента был разжат. Жгут следует накладывать не более чем на 1-2 минуты, тем самым обеспечивается минимальный стаз, при котором клетки крови не повреждаются. Игла должна быть достаточно большого диаметра и иметь короткий срез, чтобы не травмировать противоположную стенку вены во избежание тромбоза. После взятия крови необходимо приложить сухую стерильную салфетку к месту венепункции, а затем наложить давящую повязку на руку или бактерицидный пластырь.

- Кровь для гематологических исследований должна поступать

свободным током непосредственно в пробирку, содержащую

антикоагулянт К ЭДТА. Взятие крови шприцом без антикоагулянта с

2

последующим переливанием в пробирку нежелательно из-за

крови необходимо использовать специальные пробирки с ЭДТА для

капиллярной крови.

Рационально применение пробирок для взятия венозной крови небольшого объема (4-5 мл) диаметром 13 и высотой пробирки 75 мм. Взятие венозной крови облегчается применением закрытых вакуумных систем, например, BD Vacutainer (R) производства компании Becton Dickinson. Под влиянием вакуума кровь из вены быстро поступает в пробирку (рис. 1 - не приводится), что упрощает процедуру взятия и сокращает время наложения жгута.

Вакуумная система состоит из трех основных элементов, соединяющихся между собой в процессе взятия крови: стерильной одноразовой пробирки с крышкой и дозированным содержанием вакуума, стерильной одноразовой двусторонней иглы, закрытой с обеих сторон защитными колпачками, и одно- или многоразового иглодержателя (рис. 2 - не приводится). Пробирки, входящие в закрытую вакуумную систему, содержат различные добавки и антикоагулянты, в том числе для проведения гематологических исследований. Метод взятия крови с помощью закрытых вакуумных систем имеет ряд преимуществ, основными из которых являются обеспечение высокого качества пробы и предотвращение любого контакта с кровью пациента, а значит, обеспечение безопасности медицинского персонала и других пациентов за счет существенного снижения риска заражения гемоконтактными инфекциями.

ЭДТА (К ЭДТА или К ЭДТА) - предпочтительный антикоагулянт при

2 3

подсчете форменных элементов крови с использованием автоматических

2

рекомендуется вследствие его плохой растворимости в крови. При

2 3

1 до 4 ч после взятия крови существенных различий результатов

между образцами, взятыми с этими двумя антикоагулянтами, не

зафиксировано. Не следует использовать пробирки с выпаренным

раствором ЭДТА, приготовленные в условиях лаборатории. При

испарении на дне пробирки образуются крупные кристаллы ЭДТА,

которые очень медленно растворяются в крови. Это может приводить к

образованию фибриновых нитей в верхней части пробы крови. Многие

компании выпускают пробирки с сухим напылением ЭДТА (особенно для

капиллярной крови). Особенности технологии приготовления этих

пробирок приводят к равномерному распределению ЭДТА по стенкам.

У некоторых пациентов может наблюдаться небольшая спонтанная агрегация тромбоцитов или реже так называемая ЭДТА-зависимая псевдотромбоцитопения (иммунного характера), причем эти явления прогрессируют по мере увеличения времени, прошедшего после взятия крови. У таких лиц точный подсчет числа эритроцитов может быть осуществлен при взятии крови с цитратом в качестве антикоагулянта.

Следует помнить, что применение в качестве антикоагулянтов гепарина или цитрата натрия сопровождается структурными изменениями клеток и поэтому не рекомендуется для использования как при автоматизированном, так и морфологическом исследовании крови.

Цитрат натрия в основном используется для определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по методу Вестергрена или Панченкова. Для этого венозная кровь набирается в пробирки с 3,8% цитратом натрия в соотношении 4:1. С этой же целью может использоваться венозная кровь, взятая с ЭДТА (1,5 мг/мл) и затем разведенная цитратом натрия в соотношении 4:1. Сразу после заполнения пробирки кровью до указанного на ней объема пробу следует осторожно перемешать плавным переворачиванием и вращением пробирки в течение не менее 2 минут (пробирку с ЭДТА 8-10 раз, пробирку с цитратом натрия для определения СОЭ - также 8-10 раз) (рис. 3 - не приводится). Пробирки нельзя встряхивать - это может вызвать пенообразование и гемолиз, а также привести к механическому лизису эритроцитов.

Для кратковременного хранения и перемешивания проб крови существуют различные приспособления. Одним из наиболее удобных приспособлений является Ротамикс RM-1 фирмы ELMI (Латвия), который позволяет подобрать наиболее оптимальный режим перемешивания проб крови (рис. 4 - не приводится).

Капиллярная кровь. Для гематологических исследований капиллярную кровь рекомендуется брать в следующих случаях:

- при ожогах, занимающих большую площадь поверхности тела пациента;

- при выраженном ожирении пациента;

- при установленной склонности к венозному тромбозу;

- у новорожденных.

Для взятия пробы капиллярной крови используют стерильные

скарификаторы-копья одноразового применения (например, BD

ТМ

Genie фирмы "Becton Dickinson", фирмы "Гем", ЗАО Медикон ЛТД

глубиной прокола имеется прямая зависимость. В связи с этим

скарификатор должен выбираться в зависимости от места прокола и

количества крови, необходимого для выполнения различных

исследований. С этой целью фирма BD выпускает скарификаторы BD

ТМ

Genie с лезвиями разных размеров (рис. 5 - не приводится).

может привести к повреждению кости. У новорожденных кровь берется

из пятки, при этом рекомендуется использовать специальные

ТМ

атравматичные скарификаторы BD Quickheel производства той же

пациента обрабатывается стерильным тампоном, смоченным 70 град.

спиртом. Кожа в месте прокола должна быть сухой, розовой и теплой.

Место пункции необходимо просушить естественным способом для

удаления остатков спирта, поскольку он может вызвать гемолиз.

Применение ватных тампонов и других волокнистых материалов не рекомендовано, поскольку это приводит к засорению волокнами счетных и гемоглобиновой камер. В результате точность и воспроизводимость измерения падает.

Первую каплю крови, полученную после прокола кожи, следует удалить тампоном, поскольку эта капля содержит примесь тканевой жидкости. Капли крови должны свободно вытекать, нельзя давить на палец и массировать зону вокруг прокола, так как при этом в кровь попадает тканевая жидкость, что существенно искажает результаты исследования. После взятия крови к раневой поверхности прикладывается новый стерильный тампон, смоченный 70 град. спиртом. Тампон следует удерживать, пока не прекратится кровотечение.

После прокола капиллярная кровь помещается в специальный

микрокапилляр или специальные пластиковые пробирки одноразового

пользования, обработанные антикоагулянтом К ЭДТА (фирмы

2

"Deltalab", "Sarstedt" , BD Microtainer (R) и др.) (рис. 7, 8 - не

При прикосновении края пробирки к месту пункции капли крови начинают стекать в нее под действием капиллярного эффекта. После завершения сбора крови пробирку следует плотно закрыть. Необходимым условием для обеспечения качественной пробы является ее обязательное немедленное перемешивание с антикоагулянтом осторожным переворачиванием пробирки до 10 раз. В случае последовательного взятия капиллярной крови в несколько микропробирок необходимо соблюдать определенный порядок их заполнения. Последовательность взятия крови такова: в первую очередь заполняются пробирки с ЭДТА, затем с другими реактивами и в последнюю очередь заполняются пробирки для исследования сыворотки крови.

Основные рекомендации при работе с капиллярной кровью:

- При взятии крови в пробирку с антикоагулянтом не допускается стекание крови по коже пальца, стенке пробирки и любой другой поверхности, так как мгновенно происходит контактная активация прогресса свертывания.

- Кровь самотеком из прокола должна попадать прямо в антикоагулянт, перемешиваясь с ним.

- Нельзя выдавливать кровь из пальца во избежание спонтанной агрегации тромбоцитов и попадания в пробу большого количества межтканевой жидкости (тканевого тромбопластина).

Следует отметить, что при взятии капиллярной крови возможен ряд особенностей, которые бывает весьма трудно стандартизировать:

- физиологические - холодные, цианотичные пальцы;

- методические - малый объем исследуемой крови и в связи с этим необходимость разведения образца для анализа на гематологическом анализаторе и др.

Все это приводит к значительным разбросам в получаемых результатах и, как следствие, к необходимости повторных исследований для уточнения результата.

Для обеспечения качественного результата исследований нужно четко контролировать время и условия хранения проб до выполнения анализа.

- Автоматизированное исследование крови необходимо проводить в промежутке 0-5 мин. или через 1 час и позже после взятия крови. В промежутке 5 мин. - 1 час происходит временная агрегация тромбоцитов, что может привести к их ложному снижению в пробе крови.

- Непосредственно после взятия крови исключается возможность спонтанной агрегации тромбоцитов, примерно 25 мин. необходимо для адаптации тромбоцитов к антикоагулянту. При анализе, проведенном позже чем через 6-8 часов после взятия образца, уменьшается достоверность результатов. Более продолжительное хранение крови не рекомендуется, т.к. изменяются некоторые характеристики клеток (сопротивляемость клеточной мембраны), снижается объем лейкоцитов, повышается объем эритроцитов, что в конечном итоге приводит к ошибочным результатам измерения и неправильной интерпретации результатов. Только концентрация гемоглобина и количество тромбоцитов остаются стабильными в течение суток хранения крови.

- Кровь нельзя замораживать. Капиллярную кровь с ЭДТА следует хранить при комнатной температуре и анализировать в течение 4 часов после взятия.

- При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т.д.) пробы крови хранят в холодильнике (4 град. - 8 град. С) и исследуют в течение 24 часов. Однако при этом следует учитывать, что происходит набухание клеток и изменение параметров, связанных с их объемом. У практически здоровых людей эти изменения не носят критического характера и не сказываются на количественных параметрах, но при наличии патологических клеток последние могут изменяться или даже разрушаться в течение нескольких часов с момента взятия крови.

- Непосредственно перед исследованием кровь должна быть тщательно перемешана в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов на ротомиксе до момента их исследований не рекомендуется вследствие возможного травмирования и распада патологических клеток.

- Исследование крови на приборе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо вначале согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость, а форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что, в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной появления "сигналов тревоги" вследствие компрессии лейкоцитарной гистограммы.

- Приготовление мазков крови рекомендуется делать не позднее 1-2 часов после взятия крови.

При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Тряска, вибрация, постоянное перемешивание, нарушения температурного режима, возможные проливы и загрязнения проб могут оказывать существенное влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки (BD Vacutainer (R) производства компании "Becton Dickinson", Deltalab, Sarstedt) и специальные транспортные изотермические контейнеры (фирма "Гем").

На результаты гематологических исследований могут влиять факторы, связанные с индивидуальными особенностями и физиологическим состоянием организма пациента. Изменения клеточного состава периферической крови наблюдаются не только при различных заболеваниях, они также зависят от возраста, пола, диеты, курения и употребления алкоголя, менструального цикла, беременности, физической нагрузки, эмоционального состояния и психического стресса, циркадных и сезонных ритмов; климатических и метеорологических условий; положения пациента в момент взятия крови; приема фармакологических препаратов и др. Так, например, число эритроцитов и концентрация гемоглобина у новорожденных выше, чем у взрослых. С увеличением высоты над уровнем моря значительное повышение наблюдается для гематокрита и гемоглобина (до 8% на высоте 1400 м). Физические упражнения могут приводить к существенным изменениям числа лейкоцитов, обусловленным гормональными сдвигами. У больных при переходе из положения лежа в положение стоя показатели гемоглобина и число лейкоцитов могут увеличиваться на 6-8%, а показатели гематокрита и число эритроцитов возрастать на 15-18%. Этот эффект обусловлен переходом жидкости из сосудистого русла в ткани в результате повышения гидростатического давления. Выраженная диарея и рвота могут приводить к значительной дегидратации и гемоконцентрации. После регидратации наблюдается снижение гемоглобина и гематокрита, что может быть ошибочно принято за кровопотерю.

Для устранения или сведения к минимуму влияния этих факторов кровь для повторных анализов необходимо брать в тех же условиях, что при первом исследовании.
Автоматизированное исследование клеток крови
Автоматические счетчики крови оценивают размеры, структурные, цитохимические и другие характеристики клеток. Они анализируют около 10000 клеток в одном образце и имеют несколько различных каналов подсчета клеточных популяций и концентрации гемоглобина. На основании количества определяемых параметров и степени сложности их можно условно разделить на 3 основных класса:

I класс - автоматические гематологические анализаторы, определяющие до 20 параметров, включая расчетные показатели красной крови и тромбоцитов, гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, а так же частичную дифференцировку лейкоцитов на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. К анализаторам I класса относятся гематологические анализаторы, поставляемые в рамках приоритетного национального проекта "Здоровье" в 2006 г. в клинико-диагностические лаборатории амбулаторно-поликлинического звена здравоохранения: MEK-6400J/K фирмы Nihon Kohden (Япония), Адвия 60 фирмы Bayer (Германия), COULTER Ac*T фирмы Beckman Coulter (Франция).

II класс - высокотехнологичные гематологические анализаторы, позволяющие проводить развернутый анализ крови, в том числе полную дифференцировку лейкоцитов по 5-ти параметрам (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты и лимфоциты), гистограммы распределения лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов по объему, скатерограммы (Pentra-60, Cell-Dyn 3700, МЕК-8222).

III класс - сложные аналитические системы, выполняющие не только развернутый анализ крови с дифференцировкой лейкоцитов по 5 параметрам, но и подсчет и анализ ретикулоцитов, некоторых субпопуляций лимфоцитов; при необходимости комплектуются блоком для автоматического приготовления и окраски мазков из заданных образцов крови (Sysmex ХЕ-2100, Coulter LH750, Advia 2120, Pentra 120).

В основе работы анализаторов I-го класса лежит кондуктометрический метод. Анализаторы II и III-го классов используют в своей работе комбинации разных методов.
Кондуктометрические гематологические анализаторы

Технология автоматического подсчета клеток была разработана в 1947 г. Wallace Н. и Joseph R. Coulter. Апертуро-импедансный метод (метод Культера или кондуктометрический метод) основан на подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клеток через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Если через узкий канал, заполненный электропроводящим раствором, проходит клетка крови, то в этот момент сопротивление электрическому току в канале возрастает (рис. 10 - не приводится). Несмотря на то, что изменение сопротивления невелико, современные электронные приборы легко его улавливают. Каждое событие - прохождение клетки через канал, сопровождается появлением электрического импульса. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать число электрических импульсов, которые при этом генерируются.