Идентификация фармакологически активных веществ в

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
221
УДК 547.944.945
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В
ЭКСТРАКТАХ ЛИСТЬЕВ БАРВИНКА МАЛОГО (Vinca minor L.)
О.В. Молчан, С.Н. Ромашко, Т.М. Власова, В.П. Курченко, В.М. Юрин
Белорусский Государственный Университет, Минск, Республика Беларусь
Введение
Высшие растения являются уникальным источником соединений, используемых в фармацевтической промышленности, как в чистом виде, так и после различной химической трансформации. Фармакологически активные вещества растительного происхождения чаще всего относятся к основным классам вторичных метаболитов - алкалоидам, изопреноидам,
фенольным соединениям. В растениях синтезируются также цианогенные гликозиды,
поликетиды, витамины и др. Структурное многообразие и широкий спектр биологической активности вторичных метаболитов делает их незаменимой основой многих лекарственных препаратов. Кроме того, в настоящее время получение ряда соединений, например,
алкалоидов, стероидов, терпеноидов, фенольных соединений, в промышленных масштабах достигается, в основном, путем их экстрагирования из тканей дикорастущих или плантационных растений.
Фармакологическая ценность растений рода Vinca обусловлена высоким содержанием в них алкалоидов индольного ряда. Самым известным представителем рода является барвинок малый Vinca minor L. - многолетний вечнозеленый кустарничек, с ползучими,
ветвящимися и укореняющимися в узлах вегетативными побегами длиной до 60-80 см. [1, 2].
Заготавливаемая в качестве сырья надземная часть растения используется для выделения суммы алкалоидов, основным из которых является винкамин. Лекарственные препараты, содержащие сумму алкалоидов барвинка, используют в современной лечебной практике: винкатон («Гедеон Рихтер», Венгрия), винкапан (Болгария), винканор (Украина).
Эти препараты применяют при спазмах сосудов мозга, I и II стадиях гипертонической болезни, неврогенной тахикардии, головных болях различного происхождения, а также при депрессивных состояниях. Препараты барвинка эффективны для лечения детей с невритами лицевого нерва, полиневритами, остаточными явлениями менингоэнцефалита. Они также широко используются в отоларингологической и офтальмологической практике [3, 4].
Барвинок малый – преимущественно лесное растение, для которого характерен европейско-средиземноморский тип ареала. Он является дикорастущим в странах
Атлантической, Центральной и Южной Европы, а также в Молдавии, в Крыму и на Кавказе.
В последние десятилетия из мест первичной интродукции барвинок стал распространяться в полуестественные (парковые) фитоценозы. Анализ современного распространения и фитоценотические особенности барвинка свидетельствуют о том, что ареал вида значительно расширился в северном и восточном направлениях. В западных районах Беларуси отмечаются случаи широкой натурализации вида в естественных лесных фитоценозах, а также обнаруживаются популяции высокой плотности и длительного доминирования в надпочвенном покрове [5].
Таким образом, представляется возможным промышленное культивирование и заготовка сырья барвинка малого в условиях характерного для
Беларуси восточно-европейского климата. Однако содержание фармакологически ценных вторичных метаболитов в растениях в значительной степени зависит от климатических условий места произрастания. Кроме того, химический состав вторичных метаболитов барвинка малого изучен недостаточно и заслуживает более глубокого исследования.

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
222
Целью настоящей работы являлось изучение содержания алкалоидов и винкамина в листьях барвинка малого, а также оптимизация процесса получения экстракта, содержащего винкамин и другие биологически активные вещества.
Методы исследования
Объектом исследования служили листья вертикальных генеративных стеблей барвинка малого, собранные в период цветения на территории Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси [6]. При использовании в качестве сухого сырья,
листья высушивали при 600С и измельчали до размера 1 мм. Влажность сырья не превышала
9,0 %, что соответствовало требованиям Государственной Фармакопеи [7].
Экстракцию сырья различными растворителями и определение содержания экстрактивных веществ поводили согласно статьям Государственной Фармакопеи [7]. Для спектрофотометрического анализа экстракты были разведены в 20 раз соответствующими растворителями.
Спектры поглощения экстрактов анализировали с помощью спектрофотометра Varian Cary 50 в диапазоне длин волн от 210 до 800 нм с шагом 5 нм с использованием соответствующих растворителей в качестве контрольных растворов.
Определение содержания винкамина осуществляли с помощью жидкостного хроматографа высокого давления Agilent 1100, США, оснащенного диодно-матричным детектором и автосамплером. Анализ проводили на колонке с обращенной фазой Eclipse
XDB C18 (4.6 х 150 мм; 5 мкм). Для количественного определения винкамина в растительных экстрактах использовали винкамина гидрохлорид в качестве стандарта.
Мобильная фаза состояла из раствора А – 5 мМ Na2HPO4 – H3PO4(pH 6.0) и раствора В –
ацетонитрил. Градиентное элюирование проводили со скоростью 2 мл/мин при температуре
350С: 0-20 мин – линейный градиент от 80:20 до 20:80 (объем раствора А к объему раствора
В); 20-25 мин – изократическая элюция 20:80, промывка колонки; 25-30 мин - изократическая элюция 80:20, уравновешивание колонки. Спектры поглощения регистрировали в потоке с помощью детектора на основе фотодиодной матрицы.
Определение содержания экстрактивных веществ, суммы алкалоидов, фенольных соединений и флавоноидов анализировали по общепринятым методикам [7, 8, 9].
Результаты и обсуждение
Поскольку фармакологическая ценность исследуемого растения определяется, прежде всего, алкалоидами индольного ряда, из свежесобранных листьев барвинка был получен препарат алкалоидов. Суммарное содержание алкалоидов в препарате составило в пересчете на абсолютно сухую массу ткани 24,12 мг/г. Содержание винкамина в этом препарате составило 324 мкг/г. Данные величины сопоставимы с общим содержанием алкалоидов и винкамина в листьях барвинка малого, используемого в качестве растительного сырья в более южных регионах [10]. Таким образом, барвинок малый, произрастающий на территории Беларуси, может быть использован в качестве сырья для получения фармакологических препаратов.
Для создания лекарственных средств на основе растительного сырья необходима тщательная разработка и оптимизация процесса получения экстракта фармакологически активных веществ. На первых этапах обычно требуется определение технологических режимов, позволяющих экстрагировать максимальное количество биологически активных веществ. Одним из важнейших факторов является тип экстрагента. Поэтому нами были получены экстракты из сухих листьев барвинка малого с использованием растворителей различной степени полярности [11], проведен спектрофотометрический анализ экстрактов, и оценено количество извлекаемых экстрактивных веществ (табл. 1, 2).
Как видно в табл. 1, с ростом величины дипольного момента растворителя от 0 до 1,86
выход экстрактивных веществ возрастает более чем в 10 раз. Минимальное количество

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
223
экстрактивных веществ извлекается гексаном (4,92%), максимальное - этиловым спиртом и водой (28,89 и 43,39%, соответственно). Практически одинаковым (10-13%) оказывается содержание экстрактивных веществ в экстрактах на основе ацетона, ацетонитрила и хлороформа. Таким образом, использование экстрагентов с более высокими дипольными моментами – ацетона (2,72) и ацетонитрила (3,56) - не приводит к увеличению выхода экстрактивных веществ из листьев барвинка малого.
Таблица 1 – Содержание экстрактивных веществ и винкамина в экстрактах, полученных из сухого сырья барвинка малого с помощью растворителей различной степени полярности
Растворитель (дипольный
момент)
Содержание
экстрактивных
веществ, %
Содержание винкамина,
мкг/мл
Гексан (0)
4,92±0,40
не детектируется
Хлороформ (1,15)
12,06±0,37
не детектируется
Этиловый спирт (1,68)
28,89±0,31 3,89±0,03
Дистиллированная вода (1,86)
43,39±3,31
не детектируется
Ацетон (2,72)
13,33±0,80 2,11±0,01
Ацетонитрил (3,56)
10,32±0,78 1,85±0,02
Таблица 2 – Суммарное поглощение экстрактов, полученных из сухого сырья барвинка малого, в диапазоне длин волн 210-800 нм
Растворитель (дипольный момент)
Суммарное поглощение, отн. ед.
Гексан (0)
41,16
Хлороформ (1,15)
115,35
Этиловый спирт (1,68)
264,28
Дистиллированная вода (1,86)
322,93
Ацетонитрил (3,56)
110,55
Был также проведен спектральный анализ полученных экстрактов (рис. 1, табл. 2).
Интересно отметить, что характер изменения суммарного поглощения экстрактов (табл. 2) в исследуемой области (210-800 нм) в зависимости от типа экстрагента совпадает с результатами определения экстрактивных веществ согласно статьям Государственной
Фармакопеи (табл. 1). Суммарное поглощение экстрактов возрастает от 41,17 отн. ед. (при экстракции гексаном) до 322,93 отн. ед. (при экстракции дистиллированной водой).
Максимальное суммарное поглощение (как и выход экстрактивных веществ, см. табл. 1)
также характерно для спиртового и водного экстрактов. Минимальное – при экстракции гексаном и ацетонитрилом.
Спектрофотометрическая идентификация компонентов экстрактов из растительного сырья затруднительна вследствие содержания значительного количества различных веществ со сложными оптическими свойствами. Несмотря на это, спектры поглощения могут служить характеристикой состава экстракта. Кроме того, они позволяют дать предварительную оценку содержания биологически активных соединений в исследуемом сырье, поскольку известно, что многие классы веществ обладают специфическими спектрами поглощения.
Как видно на рисунке 1, в спектрах поглощения экстрактов обнаруживаются ярко выраженные полосы с максимумами при длинах волн 270-290, 315-320, 405, 530 и 665 нм.
Область 270-290 нм – характерные длины волн поглощения аминокислот, фенольных соединений и ряда алкалоидов. Например, спектр поглощения винкамина имеет в этой области максимум при длине волны 270 нм (рис 2). Анализ спектров показывает, что

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
224
максимумом интенсивности поглощения при длинах волн 270-290 характеризуются спектры поглощения водного и спиртового экстрактов. Водный экстракт, вероятно, обогащен аминокислотами, а спиртовой, скорее всего, содержит значительное количество алкалоидов и фенольных соединений.
Полосы поглощения 420-450 нм обычно характерны для спектров значительного количества экстрактивных веществ, в том числе, хлорофиллов, каротиноидов и ряда фенольных соединений. Особый интерес в данной группе соединений представляют
Рисунок 1 – Спектры поглощения экстрактов листьев барвинка Vinca minor L.,
полученные с использованием растворителей различной степени полярности (1 – вода,
2- этанол, 3 – ацетон, 4 – гексан, 5 – ацетонитрил, 6 – хлороформ)
Рисунок 2 – Спектр поглощения винкамина (10 мкг/мл в метаноле)

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
225
биологически активные флавоноиды, большинство которых являются водо- или спирторастворимыми. На рисунке 1 видно, что максимальное содержание веществ,
поглощающих в данной области спектра, обнаруживается при экстрагировании ацетоном и этиловым спиртом. В 2-3 раза меньше – при экстрагировании хлороформом, ацетонитрилом и гексаном. В спектрах поглощения водных экстрактов характерных полос в данной области длин волн не обнаруживается. Таким образом, на основании спектрального анализа можно предположить значительное содержание хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах на основе этанола, ацетона и хлороформа и прогнозировать наличие в исследуемом сырье спирторастворимых биофлавоноидов.
Поглощение длин волн 520-530 нм свойственно, как правило, растворам антоцианов.
Максимум поглощения 535 нм, наблюдается в спектрах поглощения всех экстрактов, кроме водного (рис. 1). Данный факт позволяет предположить присутствие среди экстрактивных веществ антоцианов.
Максимумами при длинах волн 660-680 нм характеризуются спектры поглощения хлорофиллов (рис. 1). Судя по интенсивности поглощения, экстракция хлорофиллов из исследуемого сырья этанолом, ацетоном и ацетонитрилом была сходной.
Поскольку особенно важно оценить выход в экстракт алкалоидов индольного ряда, в полученных экстрактах методом ВЭЖХ было определено содержание основного алкалоида барвинка малого - винкамина. Максимальным – 3,89 мкг/мл - было содержание винкамина в спиртовом экстракте (табл. 1). При экстрагировании ацетоном и ацетонитрилом содержание винкамина составило 2,11 и 1,85 мкг/мл, соответственно. При экстракции гексаном,
дистиллированной водой и хлороформом содержание этого алкалоида было ниже предела определения.
Таким образом, наибольший выход фармакологически ценных экстрактивных веществ из сухого сырья барвинка осуществляется при экстракции дистиллированной водой и этиловым спиртом, а также, вероятно, водными растворами спиртов. Максимальное количество винкамина, и, скорее всего, других алкалоидов барвинка, из сухого сырья извлекается спиртовыми растворами. Поэтому был также исследован выход экстрактивных веществ и винкамина при экстракции метанолом и водными растворами этилового и метилового спиртов (табл. 3). Как видно в табл. 3, содержание экстрактивных веществ было наибольшим при экстрагировании 70% раствором этанола, и составляло 40,64%. Экстракция метанолом (99 и 70%) приводила к выходу 32,38 и 34,92 % экстрактивных веществ,
соответственно. Содержание винкамина также было наибольшим в 70% этаноле и составляло 4,15 мкг/мл (табл. 3). Данная величина при пересчете на абсолютно сухую массу ткани составляет 0,03% и сопоставима с содержанием винкамина в препарате алкалоидов,
выделенного из свежесобранных листьев барвинка малого. Таким образом, при экстракции
70% этанолом происходит практически полное извлечение винкамина из исследуемого сырья.
Таблица 3 – Содержание экстрактивных веществ и винкамина в экстрактах, полученных из сухого сырья барвинка малого с помощью спиртовых растворов различной концентрации
Растворитель (концентрация)
Содержание
экстрактивных
веществ, %
Содержание винкамина,
мкг/мл
Этиловый спирт (70%)
40,64±1,27 4,15±0,02
Метиловый спирт (70%)
34,92±0,69 3,51±0,01
Метиловый спирт (99%)
32,38±0,62 3,88±0,05

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
226
Этиловый спирт (94%)
28,89±0,31 3,89±0,03
Интерес представляет также исследование содержания в сырье барвинка малого фармакологически активных веществ, возможно, обуславливающих дополнительный терапевтические эффект лекарственных препаратов. Успешное использование препаратов,
содержащих фенольные соединения, в том числе и флавоноиды, при лечении и профилактике большого числа заболеваний привлекает особое внимание к анализу содержания этой группы БАВ в экстрактах растительного сырья. Предварительный спектрофотометрический анализ экстрактов из сухого сырья барвинка малого показал, что в сырье барвинка малого может содержаться значительное количество фенольных соединений.
Поэтому нами было определено содержание фенольных соединений и флавоноидов в сухих листьях барвинка малого. Результаты определения суммы фенольных соединений и флавоноидов при экстракции 70 и 94 % этанолом приведены в табл. 4. Было установлено,
максимальное количество фенольных соединений (10.58%) извлекается 70% этанолом, а флавоноидов (0.69%) - 94% этанолом. Известно, что многие фенольные вещества в растительном сырье содержатся как в свободном, так и в связанном состоянии. Вещества,
находящиеся в свободном состоянии, достаточно легко извлекаются различными растворителями. Скорее всего, при данных условиях экстракции происходит извлечение фенольных соединений, находящихся в свободном состоянии. Полученные результаты позволяют оценить их содержание в сухом сырье барвинка малого.
Таблица 4 – Содержание фенольных соединений и флавоноидов в экстрактах, полученных из сухого сырья барвинка малого
Растворитель (концентрация)
Сумма фенольных
соединений, %
Сумма флавоноидов, %
Этиловый спирт (94%)
9.25±0,16 0.69±0.01
Этиловый спирт (70%)
10.58±0,23 0.44±0,02
Выводы
Барвинок малый, произрастающий в условиях восточноевропейского климата является интродуцированным растением, и в Беларуси до сих пор не использовался в качестве лекарственного растительного сырья. Кроме того, анализ литературных данных свидетельствует о том, что химический состав его практически не изучен.
Проведенное исследование свидетельствует о том, что уровень суммарного содержания алкалоидов, а также содержания основного фармакологически ценного алкалоида барвинка малого – винкамина – в растениях, культивируемых на территории ЦБС
НАН Б, достаточно высок. Кроме того, в листьях барвинка содержится ряд сопутствующих биологически активных веществ, идентификация и определение содержания которых может увеличить целесообразность и эффективность использования сырья. В данной работе было определено также содержание фенольных соединений и флавоноидов в сухом сырье барвинка малого.
Исследование биохимического состава экстрактов из сухих листьев барвинка,
полученных с использованием различных растворителей, показало, что наибольший выход фармакологически ценных экстрактивных веществ происходит при экстракции водой и водными растворами спиртов. А максимальную полноту извлечения винкамина из сухого сырья барвинка позволяет обеспечить экстракция 70% раствором этилового спирта.
Спектрофотометрический анализ экстрактов может быть использован при качественной оценке биохимического состава сырья барвинка малого и препаратов на его основе. А метод
ВЭЖХ – для определения содержания винкамина в лекарственных препаратах.

Труды БГУ 2008, том 3, часть 1
Методы
227
Финансирование исследований осуществлялось
Белорусским фондом фундаментальных исследований (проект № Б07-153). Авторы также благодарны за помощь сотрудникам Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси, в особенности, ведущему научному сотруднику ЦБС НАН Б канд. биол. наук Е.В. Спиридович.
Литература
1.
Takhtajan A. Diversity and classification of Flowering Plants. 1997. P. 433–435.
2.
Победимова Е.Г. // Флора СССР. М.–Л. 1952. С. 646–652.
3. Регистрация лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств под ред.
Вышковского Г.А. // М. 2004. Вып. 11. С. 195.
4. Лекарственные препараты и их применение. Справочник под ред. Судакова С.К. М.
1998. С 211.
5. Кухарева Л.В., Пашина Г.В. Полезные травянистые растения природной флоры:
Справочник по итогам интродукции в Белоруссии. Мн. 1986. С. 32.
6. Бородич Г.С., Гайшун В.В., Гетко Н.В., Грибик О.Я. Каталог травянистых растений открытого грунта Центрального ботанического сада Национальной академии наук Беларуси.
Мн. 1999. С. 28.
7.
Государственная Фармакопея СССР под ред. Машковского М.Д. М. 1968. 10-е изд
8.
Ziyad-Mohammed M.T., Scragg A.H. // Meth. in Mol.Biol. 1990. V. 6. P. 513-536.
9.
Запрометов М.Н. Биохимические методы анализа растений. М. 1960. 592 с.
10. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав,
использование. Л. 1984–1996. Т. 5.
11. Вайсбергер А., Проскауэр Э., Риддик Дж., Тупс Э. Органические растворители.
Справочник. М. 1958.
IDENTIFICATION OF PHARMACOLOGYCALLY ACTIVE SUBSTANCES
IN Vinca minor LEAVES EXTRACTS
O.V. Molchan, S.N. Romashko, T.M. Vlasova, V.P. Kurchenko, V.M. Yurin
Belarusian State University, Minsk, Republic of Belarus
Total alkaloid content was detected in Vinca minor leaves. The major alkaloid of leaves vincamine was separated with help of high performance liquid chromatography. Dry leaves were treated with different polarity solvents. HPLC and spectrophotometry methods were applied to analyze extracts. It was studied extractive substances and vincamine yield in extracts. Total content of phenolic and flavonoids substances were also determined.

Каталог: proceedings -> articles
articles -> Динамика развития мин личинок каштановой минирующей
articles -> Генетика спорта: вчера, сегодня, завтра
proceedings -> Социальная справедливость и гуманизм в современном государстве и праве / отв ред. Т. А. Сошникова : материалы Международной научной конференции. — М. Изд-во Моск гуманит ун-та, 2015. — 244 с