Значение оценки параметров антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса слезной жидкости для прогноза и лечения заболеваний глаза 03. 00. 04 биохимия

Елизавета Петровна

Значение оценки параметров антиоксидантной системы

и протеиназно-ингибиторного баланса слезной жидкости

для прогноза и лечения заболеваний глаза

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2009

«Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца»

член-корр. РАМН А.А.Терентьев

последипломного образования

Защита диссертации состоится «7 » сентября 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, дом 1.

Автореферат разослан «5 » июня 2009 года

Сохранение зрения является одной из важнейших социально-медицинских проблем. В России ежегодно на 45-50 тыс. увеличивается число лиц, впервые ставших инвалидами по зрению. За период 1992-2003 гг. численность инвалидов вследствие зрительных расстройств составила свыше 402 тыс. человек (Либман Е.С., Шахова Е.В., 2005.).

Современные подходы к лечению многих заболеваний связаны с привлечением большого количества инструментальных и лабораторных исследований для получения целостной картины болезни и поиска эффективных способов борьбы с ней. Большое внимание уделяется разработке новых неинвазивных методов исследования.

Наиболее доступным биологическим объектом для биохимических исследований, характеризующих локальные изменения метаболизма глаза, является слезная жидкость (СЖ). СЖ не только увлажняет поверхность глаза и удаляет пылевые частицы. Метаболические процессы в слезе тесно взаимосвязаны с обменными процессами, происходящими в глазу как в норме, так и при патологии (Винецкая М.И. и соавт., 1995; Касавина Б.С., Кузнецова Т.П., 1978; Петрович Ю.А., Терехина Н.А., 1990; Сомов Е.Е., Бржеский В.В., 1994; Чеснокова Н.Б.1986; Broekhuyse R.,1976; Haeringen van N.J.1981; Ohashi Y. et all., 2006.). Поэтому исследование биохимических свойств СЖ позволяет получать новые сведения, существенно дополняющие представления о патогенезе целого ряда заболеваний глаз. Состав СЖ изменяется при различных заболеваниях в непосредственно омываемых ею тканевых структурах глаза (Кузнецова Т.П. и соавт., 1994; Терехина Н.А. и соавт. 2007; Чеснокова Н.Б.1986; Csutak A. et all.,2004; Ghavami S. et all., 2007; Gupta A.K. et all., 1986.). Имеется связь между составом слезы и патологическими процессами, происходящими во внутренних структурах глаза (Архипова М.М. и соавт.,2000; Катаргина Л.А. и соавт., 2003; Нероев В.В. и соавт., 2006; Слепова О.С. и соавт., 2001, Хышиткуев Б.С. и соавт. 2006.). Поэтому выявление корреляции между биохимическим составом слезы, активностью ее компонентов и характером течения патологического процесса является актуальной проблемой, поскольку может расширить представления о патогенезе заболевания и помочь в оценке прогноза и выборе патогенетически ориентированной терапии, оценке ее эффективности и адекватности.

В настоящее время не вызывает сомнения роль свободнорадикального окисления в повреждении тканевых структур глаза и нарушении их функций при многих заболеваниях глаз, например, при глаукоме, катаракте, увеите, ретинопатиях различной этиологии, внутриглазных кровоизлияниях и других заболеваниях (Бабенкова И.В. и соавт., 1999; Гулидова О.В. и соавт., 1999; Долгова И.Г., 1999; Камилов Ф.Х. и соавт., 1999; Курышева Н.И., 2001; Behndig A. et all., 1998; Carubelli R. et all., 1990; Rose R.S. et all., 1998.). Не менее важная роль в патогенезе заболеваний глаз принадлежит процессам протеолиза. Нарушение баланса между протеазами и их ингибиторами лежит в основе многих патологических процессов, в том числе заболеваний глаз (Доценко В.Л. и соавт., 1990; Чеснокова Н.Б.1991; Corrales R. M. et all., 2006; Ghavami S. et all., 2007; Leonardi A. et all., 2003; Maatta M. et. all., 2008; Ollivier F.J. et all., 2007.). Имеются многочисленные данные о сопряженном функционировании протеиназ, их ингибиторов и метаболитов кислорода (Белова Л.А., 1997; Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., 1997; Buddi R. et all., 2002; Jonson D., Travis J., 1978). Эти две системы действуют кооперативно как при физиологических, так и при патологических процессах, в том числе связанных с повреждением собственных тканей организма.

Перспективным направлением в лечении заболеваний глаз является регуляция свободнорадикального окисления и протеолитических процессов (Бунин А.Я. и соавт., 1993; Давыдова Н.Г.и соавт., 2004; Ковалевский Е.И. и соавт., 1987; Полунин Г.С. и соавт., 1992; Ставицкая Т.В. и соавт., 2006; Филина А.А, 1994; Чеснокова Н.Б., 2004; Яровая Г.А., 2001; Peponis V. et all., 2002; Thompson K.N., Godin D.V., 1995.). Однако в настоящее время в офтальмологии недостаточно четко определены биохимические критерии к применению медикаментозной терапии и биохимический контроль ее эффективности. Таким образом, исследование интенсивности свободнорадикальных процессов и процессов протеолиза в слезе, изучение взаимосвязи между ними, может способствовать получению новых сведений о патогенезе глазных болезней, разработке новых подходов к диагностике, профилактике и лечению заболеваний органа зрения.

1. 
   изучить характер изменения показателей антиоксидантной системы в слезной жидкости кролика, их взаимосвязь с протеиназно-ингибиторным балансом при патологических процессах в во внешних структурах глаза на моделях травм глаза (щелочной ожог роговицы, ожоговая ишемия конъюнктивы, проникающая рана роговицы);
   
2. 
   изучить характер изменения показателей антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса в слезе кролика при травмах глаза при: а) пероральном приеме антиоксидантного комплекса, б) различных режимах воздействия NO-содержащего газового потока;
   
3. 
   изучить характер изменения показателей антиоксидантной системы в слезной жидкости кролика, их взаимосвязь с протеиназно-ингибиторным балансом при патологических процессах во внутренних структурах глаза на моделях ишемии сетчатки и иммуногенного увеита;
   
4. 
   изучить характер изменения показателей антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса в слезе кролика при патологических процессах во внутренних структурах глаза под влиянием: а) инстилляций антиоксидантного комплекса, б) субконъюнктивальных инъекций донора NO и ингибитора NO-синтазы;
   
5. 
   изучить характер изменения показателей антиоксидантной защиты в слезной жидкости пациентов с первичной открытоугольной глаукомой и влияние на них инстилляций эмоксипина.
   

Впервые изучена взаимосвязь между изменением активности компонентов антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторным балансом в слезной жидкости в динамике патологических процессов во внешних (щелочной ожог роговицы, ожоговая ишемия конъюнктивы, проникающая рана роговицы) и во внутренних (иммуногенный увеит, острая ретинальная ишемия) структурах глаза. Нарушение протеиназно- ингибиторного баланса и угнетение показателей системы антиоксидантной защиты, отмечаемое в слезе, ассоциировано с замедлением процессов репарации в травматизированных тканях и активацией воспаления.

Впервые изучено влияние оксида азота в газовом потоке на активность компонентов антиоксидантной и антипротеолитической систем слезной жидкости кролика в норме и при травмах глаза.

Впервые изучено влияние антиоксидантных комплексов на активность компонентов антиоксидантной и антипротеолитической систем слезной жидкости кролика при щелочном ожоге роговицы и острой ишемии сетчатки.

Впервые изучена активность компонентов антиоксидантной и антипротеолитической систем слезной жидкости и крови кролика при общей иммунизации организма, при иммуногенном увеите, а также влияние на исследуемые параметры доноров NO и ингибиторов NO-синтазы.

Впервые у больных глаукомой установлена корреляция между изменением антиокислительной активности слезы и изменением показателей гидродинамики глаза, выявлено нормализующее действие эмоксипина на АОА слезной жидкости.

Показана информативность исследования активности компонентов антиокислительного и антипротеолитического потенциала слезы для оценки характера течения патологических процессов, протекающих как во внешних, так и во внутренних структурах глаза.

Анализ состояния компонентов антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса слезной жидкости послужил одним из оснований для разработки режимов применения NO-содержащего газового потока для лечения травм глаза.

Анализ состояния компонентов антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса слезной жидкости послужил одним из критериев для обоснования применения ингибиторов индуцибельной NO-синтазы в лечении иммунногенного увеита.

Оценка антиокислительного и антипротеолитического потенциала слезной жидкости является объективным показателем эффективности применения антиоксидантных комплексов при ожоговой травме роговицы и при ишемии сетчатки.

Определение антиокислительной активности в слезной жидкости пациентов с первичной открытоугольной глаукомой является объективным показателем эффективности медикаментозной терапии.

1. 
   Травматические повреждения внешних структур глаза сопровождаются угнетением активности показателей системы антиоксидантной защиты и изменением активности компонентов протеиназно-ингибиторного баланса в слезной жидкости на стадии максимальной выраженности воспалительных проявлений патологического процесса.
   
2. 
   При пероральном приеме антиоксидантного комплекса в слезной жидкости здоровых кроликов возрастает антиоксидантный потенциал. Прием препарата при ожоге роговицы способствует увеличению активности компонентов антиоксидантной системы в слезе, что свидетельствует об уменьшении окислительного стресса в тканях глаза и проявляется благоприятным течением репаративных процессов.
   
3. 
   Местное воздействие газовым потоком, содержащим оксид азота, положительно влияет на течение посттравматического процесса в глазу кролика, при этом в слезе отмечается раннее увеличение активности трипсиноподобных ферментов с последующим возрастанием антипротеолитического потенциала и АОА.
   
4. 
   Общая иммунизация организма кролика сопровождается изменениями активности компонентов антиоксидантной системы в слезной жидкости, изменения этих показателей в крови менее выражены.
   
5. 
   При патологических процессах во внутренних структурах глаза в слезной жидкости кролика происходит снижение АОА и увеличение активности СОД и каталазы при иммуногеном увеите; увеличение антитриптической активности при острой ишемии сетчатки.
   
6. 
   В слезе кроликов с иммуногенным увеитом под влиянием донора NO происходит угнетение антитриптической активности, активности СОД и каталазы, клинически это соответствует тяжелому и длительному течению воспаления. Применение ингибитора NO-синтазы приводит к увеличению антитриптической активности, ранней нормализации АОА, увеличению активности каталазы на поздних сроках увеита, уменьшению активности и продолжительности воспалительного процесса.
   
7. 
   Инстилляции антиоксидантного комплекса кроликам с острой ишемией сетчатки приводят к возрастанию антиоксидантного потенциала слезы и повышению активности α₂-макроглобулина, отмечается улучшение проходимости и кровенаполнения ретинальных сосудов.
   
8. 
   АОА слезной жидкости пациентов с глаукомой не отличается от АОА слезы здоровых доноров и не зависит от стадии заболевания. Впервые обнаружена высокая степень корреляции между изменением АОА и изменением показателей гидродинамики глаза при местном применении эмоксипина.
   

Основные положения работы доложены и обсуждены на II Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов "Актуальные проблемы офтальмологии" (Москва, 2007), на научно-практической конференции "Офтальмоиммунология. Итоги и перспективы." (Москва, 2007). Диссертационная работа апробирована на межотделенческой конференции в МНИИ ГБ им. Гельмгольца (25.02.2009).

По теме диссертации опубликовано 25 научных работ, из них 5 - в центральной печати, 3 - в зарубежных изданиях.

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 26 таблицами, 24 рисунками, 15 фотографиями. Список литературы включает в себя 195 источников, из которых 97 отечественных и 98 иностранных.

Экспериментальные исследования выполнены на 115 кроликах (230 глаз) породы шиншилла массой 2-2,5 кг. Обследовано 20 больных первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ).

Исследовали показатели локальной антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса в слезной жидкости и сыворотке крови кроликов, у которых моделировали патологические процессы воспалительного и ишемического характера, затрагивающие внешние и внутренние структуры глаза. Значение биохимического исследования слезы оценивали при ожоговой травме, иммуногенном воспалении, на моделях хирургической раны и лазерного повреждения сетчатки, у больных ПОУГ.

Биохимические исследования.

Исследовано 1476 образцов слезы кроликов, 200 образцов сыворотки крови кроликов и 120 образцов слезы пациентов.

Все измерения в слезе и крови обязательно проводили до воспроизведения патологического процесса или до начала лечения у больных (исходные данные). При постановке эксперимента всегда формировали группу интактных животных, у которых слезу собирали в те же сроки, что и у опытных для исключения влияния режима содержания животных на исследуемые биохимические параметры.

Отбор слезы у кроликов проводили с помощью дисков из фильтровальной бумаги. Слезную жидкость элюировали в фосфатном буфере pH 7,4. Элюат центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для измерения активности биохимических показателей. Отбор слезы у пациентов с глаукомой осуществляли при помощи микрокапилляра из нижнего конъюнктивального свода без прикосновения к глазу и без стимуляции.

Антиокислительную активность (АОА) измеряли путем измерения кинетики люминолактивированной хемилюминесценции (ХЛ) в модельной системе гемоглобин - люминол – перекись водорода (Гулидова О.М. и соавт., 1999). АОА оценивали по величине латентного периода ХЛ и выражали через эквивалентную молярную концентрацию стандартного антиоксиданта тролокса ( мкМ тролокса) с учетом разведения. Измерение динамики ХЛ проводили на хемилюминометре "Биотокс-7" ("Энергия", Москва), совместимом с персональным компьютером.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли спектрофотометрическим методом Mizra H. and Fridovich I., основанным на способности СОД ингибировать спонтанное окисление эпинефрина в адренохром при рН 10,2 и 30^С. Регистрировали увеличение абсорбции при 480 нм. Расчет активности фермента производили по калибровочной кривой, которая представляла собой зависимость процента ингибирования окисления эпинефрина от концентрации СОД, внесенной в инкубационную среду. Активность СОД в крови выражали через эквивалентную концентрацию чистого фермента в мкг/мл пробы. При исследовании слезы оценивали удельную активность СОД в мкг/мг белка в образце. Измерения проводили на спектрофотометре UV 160A (Shimadzu, Япония).

Об активности каталазы судили по убыли перекиси водорода в инкубационной среде (Beers. R.F. and Sizer I.W.). Оптимум рН для активности каталазы при 25^С - 7,0. Регистрировали убыль оптической плотности при длине волны 240 нм (dA₂₄₀/min). Расчет активности фермента производили по калибровочной кривой, которая представляет собой график зависимости dA₂₄₀/min от концентрации каталазы в пробе. Активность каталазы в крови выражали через эквивалентную концентрацию чистого фермента в мкг/мл пробы. При исследовании слезы оценивали удельную активность каталазы в мкг/мг белка в образце. Измерения проводили на спектрофотометре UV 160A (Shimadzu, Япония).

Для измерения суммарной активности трипсиноподобных протеиназ использовали метод Эрлангера с соавторами в модификации В.А. Шатерникова, основанный на определении количества продукта реакции, образовавшегося в ходе ферментативной реакции с соответствующим специфическим субстратом N-бензоил-DL-аргинин--нитроанилидом (БАПНА). Для определения антитриптической активности (АТА) использовали метод Хавербека в модификации В.А. Шатерникова, основанный на торможении расщепления трипсином белковых и низкомолекулярных субстратов. Для определения активности ₂-макроглобулина (₂-МГ) использовали метод К.Н.Веремеенко и Л.И.Волохонской в модификации Т.А.Кримштейн и В.Б.Хватова, основанный на том, что комплекс ₂-МГтрипсин сохраняет протеолитическую активность по отношению к низкомолекулярным субстратам (БАПНА), и на эту активность не влияет ингибитор трипсина из бобов сои. Расчет ферментативной активности производили с помощью калибровочной кривой, построенной по π-нитроанилину. При исследовании сыворотки крови определяли общую активность фермента, которую выражали в нмоль/мин*мл образца. При исследовании слезы удельную ферментативную активность выражали в нмоль/мин*мг белка в образце. Измерения в сыворотке крови проводили на спектрофотометре UV 160A (Shimadzu, Япония). Исследование слезной жидкости проводили с использованием анализатора FP-9 (Labsystems, Финляндия).

Для измерения концентрации белка использовали метод Лоури и соавт.

Биохимические методы исследования были адаптированы для микроколичеств слезной жидкости.

Клиническую оценку течения патологического процесса у животных проводили по бальной системе. При травмах внешних структур глаза при помощи биомикроскопии оценивали состояние конъюнктивы (отек, гиперемия, отделяемое, площадь ишемии) и роговицы (отек, васкуляризация, площадь и глубина изъязвления). При увеите клиническую оценку проводили при помощи биомикроскопии и офтальмоскопии (осмотр глазного дна с трехзеркальной линзой) по следующим признакам: отек век и роговицы, инъекция конъюнктивы, преципитаты на эндотелии, экссудат в передней камере, образование задних синехий, опалесценция хрусталика и преципитаты на передней капсуле хрусталика, экссудация в стекловидном теле. Для клинической оценки течения ишемии сетчатки использовали биомикроскопию, офтальмоскопию, фоторегистрацию глазного дна.

Был изучен характер изменения параметров антиоксидантной системы и взаимосвязь с протеиназно-ингибиторным балансом в слезе под влиянием антиоксидантов и регуляции содержания оксида азота в тканях глаза. С этой целью применяли антиоксидантные комплексы - Иммуджен (Immugen) и Селекартен, Эмоксипин, ингибитор протеолиза – Гордокс, доноры и ингибиторы оксида азота - NO-содержащий газовый поток (NO-СГП), Na нитропруссид, S-метилтиомочевину.

1. Травмы передней поверхности глаза.

Под общей и местной анестезией моделировали щелочной ожог роговицы и ожоговую ишемию конъюнктивы модифицированным методом Obenberger. Для нанесения ожога использовали диски из хлопчатобумажной ткани диаметром 7 мм, пропитанные 10% NaOH. Через 40с диск удаляли, а глаз промывали 20 мл физиологического раствора. Моделировали проникающую рану роговицы: алмазным лезвием в центральной части роговицы обоих глаз наносили проникающий разрез длиной 2 мм. Слезу отбирали до и на 1, 3, 7, 14, 21 и 28 сутки после нанесения травмы.

2. Воспалительные и ишемические процессы во внутренних отделах глаза.

Иммуногенный увеит моделировали методом Foss. Вначале проводили первичную сенсибилизацию организма путем подкожного введения 5 мл нормальной лошадиной сыворотки (НЛС). Увеит развивался в ответ на интравитриальное введение на 8-9 сутки разрешающей дозы антигена (0,1мл). В качестве местной анестезии использовали 1% раствор дикаина.

Слезу и кровь отбирали до эксперимента, на 4 сутки после первичного введения антигена и на 1, 2, 4, 7, 10 и 14 сутки увеита.

Экспериментальную модель острой ишемии сетчатки воспроизводили путем лазеркоагуляции ретинальных сосудов I-III порядка в наружном квадранте глазного дна (Иванов А.Н. и соавт., 2007). Слезу собирали до и на 1, 3, 7, 10 сутки эксперимента.

Экспериментальные исследования проводили совместно с сотрудниками отделения травматологии (руководитель д.м.н., проф. Гундорова Р.А.) – д.м.н. Макаровым П.В., д.м.н. Кваша О.И д.м.н. Ивановым А.Н.; отделения патологии сетчатки и зрительного нерва (руководитель проф. Нероев В.В.) – к.м.н. Давыдовой Г.А.

Влияние патологического процесса во внутренних структурах глаза у людей на биохимические показатели слезной жидкости изучали у больных ПОУГ. Исследования проводили совместно с главным научным сотрудником отделения патофизиологии и биохимии - д.м.н. проф. Ермаковой В.Н.

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием статистического пакета программ "XL" и "Statistica". Результаты представлены в виде средних величин М со стандартным отклонением m. Достоверность различий, с уровнем значимости не менее 95%, оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

В заживлении ожоговой раны роговицы у кролика, вызванной щелочью, выделяется несколько стадий. Острый постожоговый период характеризуется отеком и гиперемией конъюнктивы, поражением краевой петлистой сети перилимбальных сосудов и десквамацией эпителия роговицы в зоне ожога. Во второй стадии происходит интенсивная неоваскуляризация роговицы, снижение ее чувствительности, развиваются язвенные дефекты роговицы и глубокая инфильтрация ее стромы. Третья стадия характеризуется новообразование соединительной ткани и формированием грубого васкуляризированного бельма. Наличие ишемизированного участка конъюнктивы осложняет течение ожоговой болезни глаз.

Проникающая рана роговицы характеризуется слабой воспалительной реакцией, закрытие раневого канала эпителиально- фибриновым комплексом происходит в первые сутки после травмы. На 2-3 сутки наступает эпителизация поверхности раны, воспалительные явления стихают. К концу 2 недели определяется несколько выбухающий линейный рубец беловато-серого цвета, который со временем уплощается и становится тоньше.

Изучение характера изменения параметров протеиназно-ингибиторного баланса в СЖ при травматических повреждениях внешних структур глаз кроликов выявило зависимость исследуемых показателей от стадии и характера течения патологического процесса. При ожоговой ишемии конъюнктивы нами выявлено увеличение ТПА в начале развития изъязвлений роговицы (7 сутки) и в период, когда происходило их резкое углубление (21 сутки), изменения АТА при этом были выражены слабо. При проникающей ране роговицы на фоне увеличения АТА активность трипсиноподобных протеиназ была снижена на всех сроках. Снижение протеолитической активности на ранних сроках после травмы может явиться причиной недостаточного очищения раны от продуктов распада, что приводит к формированию грубого рубца. Как при ожоговой ишемии конъюнктивы, так и при проникающей ране отмечалась тенденция к увеличению активности α_2-макроглобулина на ранних сроках после травмы.

При травмах внешних структур глаза нами впервые изучена динамика АОА в слезе. Выявлено снижение АОА слезной жидкости на всех сроках наблюдения, особенно выраженное в период максимальных клинических проявлений воспаления. Для ожоговых травм это 7-14 сутки, а для проникающей раны роговицы – 1-2 сутки. В своем исследовании мы оценивали АОА слезы в основном по отношению к наиболее агрессивному гидроксильному радикалу. Снижение АОА свидетельствует о расходовании эндогенных антиоксидантов слезы на нейтрализацию гидроксильных радикалов, образование которых усиливается при воспалении. Таким образом, АОА слезы является маркером интенсивности окислительного стресса в наружных структурах глаза.

При щелочном ожоге роговицы нами обнаружено угнетение активности антиоксидантных ферментов СОД и каталазы в слезе. В острый период нарастал дефицит компонентов антиоксидантной защиты, наиболее выраженный в период интенсивной васкуляризации. Активность СОД была подавлена в течение всего срока наблюдения.

С целью воздействия на свободнорадикальные и протеолитические процессы мы применили антиоксидантный комплекс Иммуджен и NO-содержащий газовый поток (NO-СГП). Нами впервые показано, что пероральный прием антиоксидантов здоровыми кроликами приводит к достоверному увеличению АОА и некоторому увеличению активности СОД в слезе. Воздействие на глаз NO-СГП не оказывает влияния на исследуемые параметры слезы у здоровых кроликов.

При щелочном ожоге роговицы на фоне приема антиоксидантного комплекса в слезе достоверно увеличивалась АОА, активность каталазы и СОД по сравнению с нелеченными животными. Увеличение активности каталазы и СОД на поздних стадиях воспаления может положительно влиять на репаративные процессы, поскольку эти ферменты поддерживают стационарные концентрации супероксидного радикала и перекиси водорода и предотвращают окислительное повреждение вновь синтезируемых структурных компонентов роговицы. Клинически это подтверждается формированием более прозрачного рубца по сравнению с нелеченными кроликами.

Нами было проведено исследование влияния NO-СГП на биохимические параметры слезы кроликов с травмами глаза. Мы применили NO-СГП в режимах, оказывающих терапевтическое воздействие Как было показано раннее, оно заключается в нормализации микроциркуляторных нарушений, улучшении сосудистой и нервной трофики, усилении фагоцитоза, ингибировании кислородных радикалов (Шехтер и соавт, 1998).

NO-СГП в используемых режимах способствовал более ранней нормализации АОА слезы кроликов как с ожоговой ишемией конъюнктивы, так и с проникающей раной роговицы. По-видимому, NO проявлял антиоксидантные свойства, либо нормализация АОА была следствием благоприятного клинического течения и снижения образования активированных кислородных метаболитов. При воздействии NO-СГП (экспозиция 15с - после нанесения ожога, на 1 и 2 сутки) на глаза кроликов с ожоговой ишемией конъюнктивы, нами обнаружено повышение активности протеиназ на ранних сроках воспалительного процесса, что должно способствовать очищению ожоговой раны и удалению некротизированных тканей.

На поздних сроках воспаления возрастала антитриптическая активность, которая препятствует чрезмерной активации протеолитических ферментов. Не исключено, что это может быть связано с сосудорасширяющим действием NO и поступлением низкомолекулярных антипротеиназ из сосудов конъюнктивы.

При оценке влияния воздействия NO-СГП (экспозиция 30, 60, 90с - после нанесения раны, на 1 и 2 сутки) на протеиназно-ингибиторный баланс слезы кроликов с проникающей раной роговицы обнаружены дозозависимые изменения исследуемых параметров (Рис.1). Наилучшие клинические результаты получены при экспозиции потока 60-90с. При таком воздействии наблюдалось раннее повышение трипсиноподобной активности. Антитриптическая активность при этом была ниже, чем у нелеченных животных. Это способствовало лучшему очищению раны от продуктов распада тканей, что приводит к формированию более нежного и прозрачного рубца.

*-достоверные различия по сравнению с нелеченными животными, p<0.05

Нами были изучены системные и впервые локальные изменения параметров антиоксидантной и антипротеолитической системы, как при общей иммунизации, так и при иммуногенном увеите. Оказалось, что при иммунизации изменения исследуемых биохимических параметров в слезе более выражены, чем в крови. Это связано, вероятно, с тем, что конъюнктива - слизистая обоочка, оказывающая большое влияние на состав слезы, - является иммунокомпетентной тканью, которая вовлекается в иммунный и воспалительный ответ.

По нашим данным в слезе происходило снижение активности СОД после первичной сенсибилизации, повторное введение антигена приводило к достоверному увеличению активности этого показателя. Одновременно достоверно снижалась активность каталазы. Характер изменения активности антиоксидантных ферментов является следствием активации нейтрофилов и генерации супероксидного радикала при стимуляции иммунной системы. Характер изменения активности a2-макроглобулина (a2-МГ) свидетельствует об активации макрофагов конъюнктивы, в которых он вырабатывается.

Увеит развивался практически сразу после интравитриального введения разрешающей дозы НЛС. На 2-3 сутки увеита наблюдалась гиперемия конъюнктивы, выраженный отек роговицы, хлопкообразные преципитаты на эндотелии роговицы и хрусталике, гипопион, фибрин в передней камере, передние и задние синехии, воспалительные клетки в стекловидном теле. Начиная с 4 суток, отмечалась слабая положительная динамика. К 6-7 суткам клинические признаки воспаления стихали, однако биохимические изменения в слезе свидетельствовали о более длительном и активном течении патологического процесса. При иммуногеном увеите в слезе мы наблюдали значительные изменения показателей антиоксидантной системы: увеличение активности СОД на 39,6% (1-2сутки увеита), увеличение активности каталазы на 66% (7сутки увеита, p<0,05) и на 54,3% (14 сутки увеита, p<0,05), снижение АОА на 30% (7сутки, p<0,05). Если динамика активности СОД практически не отличалась от изменения активности СОД у иммунизированнх животных, то снижение АОА и увеличение активности каталазы были следствием развития увеита.

Нами впервые были изучены биохимические изменения в слезе при лечении увеита донорами оксида азота и ингибиторами индуцибельной NO-синтазы. Полученные данные подтверждают участие оксида азота в патогенезе увеита. Донор оксида азота вводили субконъюнктивально (0,2 мл на 2, 3 сутки увеита) и способствовали тем самым поддержанию высокой концентрации оксида азота в очаге воспаления, которая повышается при стимуляции иммунной системы вследствие активации индуцибельной NO-синтазы. Это может приводить к накоплению пероксинитрита и реализации цитотоксического действия NO. По данным клинических наблюдений введение донора NO приводило к более тяжелому и длительному течению воспалительного процесса по сравнению нелеченными животными. Результаты биохимического исследования подтверждали данные клинических наблюдений. Мы обнаружили снижение активности СОД и каталазы в слезе на поздних сроках воспаления по сравнению с нелеченными животными. О высоком уровне окислителей свидетельствует и снижение АТА в слезе кроликов, получавших донор NO по сравнению с нелеченными животными, поскольку известно, что оксиданты способны окислять метионин в активном центре α₁-антитрипсина, что приводит к его инактивации.

Ингибитор NO-синтазы вводили субконъюнктивально (0,2мл однократно через 3 часа после введения разрешающей дозы). Введение на ранних сроках ингибитора iNOS способствует снижению концентрации оксида азота до уровня, при котором он не способен конкурировать с СОД за супероксидный радикал. После введения ингибитора NO-синтазы отмечалось значительное уменьшение активности и длительности воспалительной реакции. В слезе мы наблюдали более раннюю нормализацию АОА в слезе, увеличение антипротеолитической активности, а также повышение активности каталазы, защищающей ткани глаза от действия перекиси водорода.

П
*
ри ишемии сетчатки, вызываемой лазеркоагуляцией ретинальных сосудов, наблюдается послеожоговая воспалительная реакция с окклюзией сосудов. Сосуды сужены, ткань сетчатки отечная в течение двух недель после лазерного воздействия. Через три недели сохраняется равномерное сужение сосудов, ткань сетчатки бледная с четкой дифференцировкой зоны коагуляции.

При исследовании слезы нами обнаружено увеличение антитриптической активности и активности a2-МГ на 3 сутки после лазерного воздействия (p<0,05). Это могло быть вызвано как воспалительным процессом в сетчатке, так и реакцией компонентов системы гемостаза слезы в ответ на нарушение кровообращения в сетчатке. К 7 суткам значения АТА были близки к нормальным, тогда как активность a2-МГ оставалась повышенной до 10 суток эксперимента. По нашим данным ишемический процесс в сетчатке не влиял на уровень АОА в слезе.

Инстилляции селенсодержащего антиоксидантного комплекса Селекартена кроликам с ишемией сетчатки приводили к увеличению АОА слезы, что, по-видимому, является следствием прямого антиоксидантного действия компонентов Селекартена. На фоне лечения антиоксидантным комплексом еще больше увеличивалась активность a2-МГ. Вероятно, это связано с иммунотропным действием компонентов комплекса, поскольку известно, что селен способен оказывать стимулирующее воздействие на иммунокомпетентные клетки конъюнктивы, которые синтезируют a2-МГ. Положительное влияние антиоксидантного комплекса на биохимические параметры подтверждалось данными клинических наблюдений. Применение Селекартена способствовало более раннему восстановлению проходимости и кровенаполнения сосудов сетчатки.

3. Значение биохимического исследования слезной жидкости у пациентов с ПОУГ.

Биохимические исследования проводились у 20 больных с различными стадиями глаукомы. При исследовании образцов слезы пациентов с ПОУГ общая АОА составила 244,5 ± 20,0 мкМ тролокса. Такие значения АОА слезной жидкости соответствуют значениям АОА слезы здоровых доноров.

Мы не обнаружили зависимости АОА слезы от стадии глаукомы. Однако нами была выявлена значительная вариация АОА в слезе больных до лечения. Это позволило разделить больных на 3 группы: I - АОА < 200 мкМ тролокса; II - АОА от 200 до 300 мкМ тролокса; III - АОА >300 мкМ тролокса.

Все пациенты в течение 2 месяцев получали инстилляции Эмоксипина (2 раза в день, через 15-20 мин после введения гипотензивных средств). При исследовании антиокислительной активности Эмоксипина in vitro мы не обнаружили у этого препарата прямого антиоксидантного действия. Это подтверждает данные, полученные другими авторами, которые исследовали Эмоксипин в такой же модельной системе.

Лечение Эмоксипином приводило к нормализации АОА слезы: исходно высокая АОА снизилась, низкая – увеличилась.

Нами впервые обнаружена достоверная корреляция между изменениями клинических показателей и изменением АОА в слезе до и после лечения Эмоксипином. По нашим данным коэффициент корреляции между изменением полей зрения, изменением скорости оттока и изменением АОА составил 0,53 и 0,61 соответственно. Полученная корреляция между изменением АОА и изменениями полей зрения и показателей гидродинамики глаза свидетельствует о том, что одним из показателей эффективности лечения может служить изменение АОА слезы в процессе лечения глаукомы.

Таким образом, проведенные нами исследования свидетельствуют о том, что исследование слезной жидкости является информативным при патологических процессах воспалительного и ишемического характера, протекающих как в структурах глаза, омываемых слезой, так и во внутренних структурах глаза, не соприкасающихся со слезной жидкостью. По нашим данным исследование состояния системы антиоксидантной защиты и протеиназно-ингибиторного баланса в слезной жидкости имеет значение для получения информации о патогенезе и прогнозе глазных болезней, для разработки показаний к медикаментозной терапии и оценке ее эффективности, а также для разработки новых методов лечения.

Выводы:

1. 
   При травматических повреждениях внешних структур глаза (щелочной ожог роговицы, ожоговая ишемия конъюнктивы, проникающая рана роговицы) в период максимальной выраженности клинических признаков воспаления в слезной жидкости происходит: а) снижение антиокислительной активности и угнетение активности антиоксидантных ферментов СОД и каталазы, б) изменение протеиназно-ингибиторного баланса.
   
2. 
   Пероральный прием антиоксидантного комплекса приводит к увеличению АОА в слезе здоровых кроликов; прием антиоксидантного комплекса при ожоговой травме роговицы положительно влияет на клиническое течение ожога и способствует более ранней по сравнению с нелеченными нормализации АОА, увеличению активности каталазы и СОД в слезе.
   
3. 
   Под влиянием газового потока, содержащего оксид азота, в слезе кроликов с травмами внешних структур глаза происходит увеличение активности трипсиноподобных ферментов в острый период воспаления и возрастание антипротеолитического потенциала и АОА на поздних сроках воспаления, что выражается клинически благоприятным течением посттравматического процесса.
   
4. 
   При общей иммунизации организма кролика в слезной жидкости отмечается возрастание активности СОД и снижение активности каталазы, АОА при этом не меняется. Изменения этих показателей в слезе более выражены, чем в крови.
   
5. 
   При патологических процессах во внутренних структурах глаза в слезной жидкости кролика происходит изменение активности компонентов антиоксидантной системы и протеиназно-ингибиторного баланса: а) при иммуногеном увеите - снижение АОА и увеличение активности СОД и каталазы на ранних стадиях воспаления, б) при острой ишемии сетчатки - повышение антипротеолитического потенциала.
   
6. 
   Применение донора оксида азота при иммуногеном увеите у кролика приводит к угнетению антитриптической активности, активности СОД и каталазы в слезной жидкости и к более тяжелому течению увеита. Воздействие ингибитором NO-синтазы способствует раннему увеличению антитриптической активности, ранней нормализации АОА, увеличению активности каталазы на поздних сроках увеита и значительному улучшению течения увеита.
   
7. 
   Под влиянием инстилляций антиоксидантного комплекса в слезной жидкости кроликов с острой ишемией сетчатки происходит увеличение АОА и активности α₂-макроглобулина, улучшается проходимость и кровенаполнение ретинальных сосудов.
   
8. 
   АОА слезы у пациентов с глаукомой не зависит от стадии заболевания, но является объективным показателем эффективности терапии, так как выявлена корреляция между изменением АОА слезы и изменениями показателей гидродинамики глаза при глаукоме.
   

Практические рекомендации:

1. Исследование параметров антиоксидантной системы в слезной жидкости позволяет оценить тяжесть и прогноз офтальмопатологии, определить необходимость, продолжительность и эффективность терапии антиоксидантными препаратами.

2. Нарушение протеиназно-ингибиторного баланса в слезной жидкости является объективным показанием к назначению при глазных заболеваниях препаратов с протеолитическим или антипротеолитическим действием, определению сроков и длительности их применения.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. 
   Чеснокова Н.Б., Гундорова Р.А., Кваша О.И., Шехтер А.Б., Пекшев А.В., Давыдова Н.Г., Столярова Е.П., Безнос О.В., Горбачева О.А., Косакян С.М. Перспективы применения экзогенного оксида азота в офтальмологии. // Материалы научно-практ. конференции “NO-терапия: теоретические аспекты, клинический опыт и проблемы применения экзогенного оксида азота в медицине ”- М.- 2001. - С. 124-126.
   
2. 
   Чеснокова Н.Б., Гундорова Р.А., Шехтер А.Б., Быков В.П., Кваша О.И., Пекшев А.В., Косакян С.М., Горбачева О.А., Столярова Е.П., Безнос О.В., Галчин А.А. Влияние оксида азота в газовом потоке на заживление ран роговицы глаза в эксперименте. // Материалы научно-практ. конференции “NO-терапия: теоретические аспекты, клинический опыт и проблемы применения экзогенного оксида азота в медицине ” - М.- 2001. - С.126-129.
   
3. 
   Столярова Е.П., Кваша О.И., Косакян С.М., Безнос О.В., Шехтер А.Б., Пекшев А.В., Чеснокова Н.Б. Протеиназно-ингибиторный баланс и антиокислительная активность слезы при лечении проникающей раны роговицы у кроликов оксидом азота в газовом потоке // Материалы VII Международного медицинского конгресса студентов и молодых ученых. – Тернополь. - 2003. - С.212.
   
4. 
   Чеснокова Н.Б., Гундорова Р.А., Кваша О.И., Быков В.П., Давыдова Н.Г., Безнос О.В., Столярова Е.П., Косакян С.М., Горбачева О.А., Шехтер А.Б., Пекшев А.В. Экспериментальное обоснование применения оксида азота в газовом потоке для лечения травм глаза // Вестник РАМН. - 2003. - №5. - С. 40-44.
   
5. 
   Косакян С.М., Безнос О.В., Столярова Е.П., Чеснокова Н.Б., Гундорова Р.А., Кваша О.И., Шехтер А.Б., Пекшев А.В. Экспериментальное обоснование использования газового потока, содержащего оксид азота для лечения травм глаза. // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека". – Смоленск. - 2003. - С. 148-149.
   
6. 
   Чеснокова Н.Б., Кузнецова Т.П., Казанская Н.Ф., Кост О.А., Никольская И.И., Безнос О.В., Павленко Т.А., Столярова Е.П., Скиргелло О.А Значение исследования протеолитических ферментов и их ингибиторов в слезе для изучения патогенеза раневого процесса в глазу.// Материалы II Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития".- Москва. – 2003. - С. 193.
   
7. 
   Гундорова Р.А., Чеснокова Н.Б., Шехтер А.Б., Пекшев А.В., Кваша О.И., Давыдова Н.Г., Безнос О.В., Столярова Е.П., Косакян С.М., Горбачева О.А. Применение оксида азота в газовом потоке для заживления ран роговицы // Офтальмологический журнал. - 2003 - №1. - С. 47-52.
   
8. 
   Столярова Е. П., Безнос О. В, Сиала С., Кваша О.И., Чеснокова Н. Б. Влияние газообразного оксида азота на антиокислительную активность слезной жидкости кроликов в норме и при ожогах глаз различной локализации // II Международная конференция "Патофизиология и современная медицина". - Москва. – 2004. - С. 353.
   
9. 
   Ермакова В.Н., Чеснокова Н.Б., Столярова Е.П. Влияние инстилляций эмоксипина на антиокислительную активность слезы, зрительные функции и показатели гидродинамики глаза больных первичной открытоугольной глаукомой.// Всероссийская научно-практическая конференция "Глаукома. Проблемы и решения." Москва. - 2004. - С. 236-239.
   
10. 
    _{Макаров П.В., Титкова С.М., Ануров М.В., Михальчик Е.В., Чеснокова Н.Б., Безнос О.В., Столярова Е.П., Оганесян О.Г., Трофимова М.В., Акопян А.В., Ключиков В.Ю., Коркина Л.Г. Изучение состояния местной антиоксидантной системы глаза при экспериментальной ожоговой травме роговицы и перспективы формакологической коррекции ее показателей // Вестник офтальмологии. – 2005. - №6. – С.40-43.}
    
11. 
    Гундорова Р.А., Чеснокова Н.Б., Шехтер А.Б., Пекшев А.В., Кваша О.И., Давыдова Н.Г., Столярова Е.П., Косакян С.М., Горбачёва О.А., Сиала С., Безнос О.В Оксид азота в газовом потоке при лечении травм глаза (экспериментальное обоснование) // Сборник тезисов научно-практической конференции "Оказание первой и специализированной помощи при травмах органа зрения в экстремальных ситуациях и катастрофах". Москва.- 2006. - С. 91-93.
    
12. 
    _{Швецова Н.Е., Чеснокова Н.Б., Безнос О.В., Столярова Е.П., Иванов А.Н. Определение биохимических показателей слезы при создании модели ишемии сетчатки на фоне лечения препаратом селекартен в эксперименте. // Материалы IV Международной научно-практической конференции "Пролиферативный синдром в офтальмологии". – Москва. – 2006. – с.48-51.}
    
13. 
    Гундорова Р.А., Иванов А.Н., Цапенко И.В., Зуева М.В., Чеснокова Н.Б., Швецова Н.Е., Безнос О.В., Столярова Е.П., Андерсен Э.Б. Динамика электроретинограммы и биохимических показателей слезы при моделированной ишемии сетчатки кролика // Вестник офтальмологии. – 2007. - №5. – с.28-32.
    
14. 
    _{Нероев В.В., Чеснокова Н.Б., Давыдова Г.А., Давыдова Н.Г., Перова Т.С., Столярова Е.П., Безнос О.В.. Влияние донора оксида азота нитропруссида Na на течение иммуногенного увеита у кроликов и биохимические показатели слезы и крови // Материалы XIV Российского национального конгресса "Человек и лекарство". – Москва. – 2007. – с.855.}
    
15. 
    _{Нероев В.В., Чеснокова Н.Б., Давыдова Г.А., Давыдова Н.Г., Перова Т.С., Столярова Е.П., Безнос О.В. Влияние доноров оксида азота нитропруссида Na и L-аргинина на течение увеита, аниоксидантный и антипротеолитический потенциал слезной жидкости и крови в эксперименте. // Вестник офтальмологии - 2007. - №3. – с.22-25.}
    
16. 
    Нероев В.В., Чеснокова Н.Б., Столярова Е.П., Безнос О.В., Давыдова Г.А., Перова Т.С. Изменения протеиназно-ингибиторного баланса и показателей антиокислительной системы слезы и сыворотки крови при экспериментальном иммуногенном увеите // Материалы Всероссийской научно-практической конференции "Офтальмоиммунология: итоги и перспективы". Москва. – 2007. – С.214-216.
    
17. 
    Столярова Е.П., Михальчик Е.В., Макаров П.В., Безнос О.В., Чеснокова Н.Б., Коркина Л.Г. Информативность показателей локальной антиоксидантной системы в оценке течения постожогового процесса в роговице (экспериментальное исследование). // Материалы II Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов "Актуальные проблемы офтальмологии". – Москва. – 2007. – с.40-42.
    
18. 
    Цапенко И.В., Иванов А.И., Швецова Н.Е., Чеснокова Н.Б., Зуева М.В., Безнос О.В., Столярова Е.П. Изучение электроретинограммы и биохимических показателей слезы при создании модели ишемии сетчатки кролика и на фоне лечения препаратом "Селекартен"// Материалы Всероссийской конференции "Ерошевские чтения".– Москва. – 2007. – с.346-349.
    
19. 
    _{Швецова Н.Е., Чеснокова Н.Б., Иванов А.Н., Безнос О.В., Столярова Е.П. Биохимические показатели слезы на модели ишемии сетчатки на фоне лечения препаратом селекартен // Материалы научно-практической конференции "Новые технологии в пластической хирургии придаточного аппарата глаза при травмах глаза и орбиты в условиях чрезвычайных ситуаций и катастроф". – Москва. – 2007. – с.189-191.}
    
20. 
    Столярова Е.П., Кузнецова Т.П., Безнос О.В., Григорьев А.В., Чеснокова Н.Б. Информативность биохимического исследования слезной жидкости // Российский общенациональный офтальмологический форум. Сборник научных трудов. – Москва. – 2008. –– С.454-458.
    
21. 
    Stolyarova E.P., Kosakyan S.M., Kvasha O.I., Beznos O.V., Shekhter A.B., Chesnokova N.B. Influence of nitric oxide on experimental corneal wound healing and metabolic processes in tears // XV International Congress of Eye Research, Geneva, Switzerland, 6-11 октября 2002
    
22. 
    Stolyarova E.P., Kosakyan S.M., Beznos O.V., Kvasha O.I., Pekshev A.V., Chesnokova N.B Influence of NO-containing gas flow (NO-CGF) on the antioxidative activity of tear fluid in normal eyes and after the penetrating corneal wound in rabbits.// Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека". – Смоленск. - 2003. - С.152.
    
23. 
    Kosakyan S.M., Stolyarova E.P., Beznos O.V., Chesnokova N.B., Shekhter A.B., Kvasha O.I., Pekshev A.V. The experimental basis for using of the nitric oxide containing gas flow for the treatment of ocular injuries. // Материалы национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека", Смоленск. - 2003. - С.148-149.
    
24. 
    Chesnokova N.B., Kuznetsova T.P., Kazanskaya N.F., Kost O.A., Nikolskaya I.I., Beznos O.V., Pavlenko T.A., Stolyarova E.P., Skirgello O.E.. Significance of proteinase-inhibitory balance in tears for the study of pathogenesis and for elaboration of methods for therapy and prognosis of the burn wound healing in the eye. // Biocataliytic technology and nanatechnology, ed. J.I. Zaikov, Nova Science Publishers Inc. - New York. - 2004. - Р.119-126.
    
25. 
    _{Chentsova E., Chesnokova N., Shekhter A., Pekshev A., Kvasha O., Davydova N., Beznos O., Stolyarova E., Kosakyan S., Gorbacheva O. Applicatoin of nitric oxide in gas flow for healing of corneal wound. // VII International symposium on ocular trauma. – Rome. – 2006. - Abstract note book P. 145.}
    

Каталог: fileadmin -> rsmu -> documents -> science -> uchenii sovet -> news 2009 september
news 2009 september -> Определение оптимальной тактики лечения больных инфарктом миокарда без подъема сегмента st на экг 14. 00. 06 Кардиология
news 2009 september -> Многоканальная электромиостимуляция и гипербарическая оксигенация в комплексном лечении больных с диабетической ангиопатией 14. 00. 51- восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия
news 2009 september -> «гиперфильтрация при артериальной гипертензии: распространенность, клиническое значение, пути коррекции» 14. 00. 06 Кардиология
news 2009 september -> Система мать-плацента-плод и современные подходы к диагностике и ведению беременных с варикозной болезнью вен нижних конечностей 14. 00. 01 акушерство и гинекология
news 2009 september -> Оценка факторов врожденного иммунитета слизистой цервикального канала в прогнозировании преждевременных родов 14. 00. 01. Акушерство и гинекология 14. 00. 36. Аллергология и иммунология
news 2009 september -> Клиническая эффективность технологии быстрой коррекции чсс и повышения инотропной функции миокарда в период декомпенсации хсн 14. 00. 06 Кардиология
news 2009 september -> «алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита с у доноров крови» 14. 00. 46 клиническая лабораторная диагностика
news 2009 september -> Перевязка внутренних подвздошных артерий в лечении массивных акушерских кровотечений 14. 00. 01 акушерство и гинекология
news 2009 september -> Применение трансъюгулярного внутрипеченочного портосистемного шунтирования в лечении осложнений синдрома портальной гипертензии 14. 00. 27 Хирургия
news 2009 september -> Цереброваскулярные нарушения и нейродегенеративные изменения на поздних стадиях рассеянного склероза 14. 00. 13 нервные болезни

Скачать 178.5 Kb.

Поделитесь с Вашими друзьями: